Name: Autoradiography כאל שיטה פשוטה ורבת -עוצמה עבור ויזואליזציה ואפיון של מטרות תרופתי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: למדו אוטורדיוגרפיה כטכניקה פשוטה ויעילה לוויזואליזציה של אתרי קישור ליגנדים ברקמות עכבר. שיטה זו מציעה רזולוציה מרחבית גבוהה ומהירות תיעוד דיגיטלי לניתוח פרמקולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה נתמכה על ידי קרן לונדבק (גרנט R133-A12270) ושל קרן נורדיסק Novo (גרנט NNF0C0028664). המחברים מודים ד ר עופר בר מארק על אספקת radioligand [3H].

לטיפול בבעלי חיים כל בוצעה בהתאם להנחיות של Inspectorate ניסויים בבעלי חיים דנית.
הערה: פרוטוקול המתוארים כאן מכסה רקמות הכנה (קרי, רקמת מוח העכבר), במבחנה autoradiographic וזמינותו בפירוט מספיק עבור הגדרת השיטה במעבדה החדשה, את החשיפה פוספור הדמיה הצלחות כמו גם לאחר מכן ניתוח densitometric של autoradiograms (איור 2) עם המטרה של לוקליזציה וכימות radioligand מחייב במבנים אנטומיים ברורים. לשם השוואה היסטולוגית, עבור cresyl, ויולט מכתים פרוטוקול הינה כלולה. יתר על כן, הקביעה של איגוד שאינם ספציפיים עם ליגנד מתחרות נכלל בתוך הפרוטוקול. לקבלת תיאור מפורט אודות אופן קביעת Kd, Bמקס או קייאני, ראה הפרסום הקודם4.
1. רקמות הכנה על ידי Cryosectioning
<ol><li>המתת חסד העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם ומנתחים באופן מיידי את המוח באמצעות מלקחיים ומספריים. ישירות להמשיך לשלב הבא כדי למנוע נזק לרקמות.</li>
	<li>Snap-הקפאת הרקמה על ידי צלילה אבקת קרח יבש, גז CO2 או איזופנטאן. ישירות להעביר הרקמה קפוא cryostat עם הטמפרטורה מוגדר כ-20 ° C. לחלופין, לאחסן את הרקמה ב-80 מעלות צלזיוס עד עיבוד. הערה: להימנע חוזרות מפשיר הקפאה כדי להפחית נזק לרקמות.</li>
	<li>תן את הרקמה להתאקלם-20 ° C ב- cryostat למשך 20 דקות לפני עיבוד נוסף כדי למנוע ניפוץ רקמות.</li>
	<li>לכסות את קופסת הטישיו בינונית ההטבעה בחוץ cryostat ולמקם במהירות את הדגימה רקמות קפוא הכיוון הרצוי אמנם המדיום ההטבעה עדיין נוזלי. למשל, מקום במוח העכבר אנכית אל המוח על מנת להשיג חלקים הילתית rostral. להעביר את קופסת הטישיו בחזרה cryostat ולחשוף את המדיום ההטבעה לטמפרטורות מתחת-10 ° C עבור טרשת. הערה: דגימות רקמה שברירית צריך להיות מצופה הטבעה בינוני בתוך התבניות רקמות לפני הרכבה.</li>
	<li>בעמדה בעל רקמת האזמל הקטן cryostat. התאם את הכיוון של הרקמה כדי להימנע מקטעים משופע.</li>
	<li>לחתוך את הרקמה בעזרת הדרכתו של אטלס stereotaxic18 בסעיפים של עובי הרצוי (12 מיקרומטר מומלצת [3H] מתויג ליגנדים). בזהירות ליישר לגולל את המקטע עם מברשת בגודל קטן במידת הצורך, הפשרה-הר המקטע לשקופית מיקרוסקופ. ברצף לאסוף את הסעיפים מאזור עניין לשכפול טכני הרצוי (למשל, 4 סעיפים לכל שקופית).</li>
	<li>לאפשר את המקטעים של השקופיות כדי מילה נהדרת עבור 1 h לפני טיפול נוסף. הערה: תוספת של חומר? סופג לחות לתיבות שקופית ממזער הצטברות לחות על הסעיפים רקמות. Procotol יכול להיות עצר כאן על-ידי אחסון לטווח ארוך מקטעים בתיבות שקופיות ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>2. במבחנה Autoradiography
זהירות: רדיואקטיביות. עובד מעבדה מוסמכת על פי תקנות מקומיות. ללבוש ביגוד מגן. . היפטר בהתאם דעיכה רדיואקטיבית או מיקור חוץ לחברה מוסמך.
<ol><li>להפשיר את המקטעים במשך לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT). תווית של השקופיות עם תנאים ניסיוני. השתמשי בעיפרון כי השקופיות שאתה רוחץ אתנול במהלך צביעת עוקבות.</li>
	<li>מקם את השקופיות אופקית מגשי פלסטיק. הערה: מיקום השקופיות על פלטפורמה מוגבהת בתוך מגשי פלסטיק מקלה על הטיפול שלהם.</li>
	<li>Incubate מראש הסעיפים רכוב על השקופיות במאגר assay מותאם למטרה המדובר (עבור פרוטוקול אסיד, 50 מ מ KHPO4 מאגר pH 6.0 משמש) על-ידי החלת בקפידה אמצעי אחסון המתאים על גבי השקופית (700 µL למקטעי הילתית מכרסמים 3-4). הערה: ודא כי כל קטע מכוסה לגמרי נוזלי.<ol>
<li>מכסים את מגשי פלסטיק עם מכסה על מנת למנוע אידוי, דגירה מראש בטמפרטורה הרלוונטיים (עבור פרוטוקול אסיד incubate מראש למשך 30 דקות ב- RT) תחת עדין קבוע (20 סל ד) לוחץ על צלחת מטרף.</li>
		<li>מצפני מחייב שאינם ספציפיים, תוספת assay מאגר עם ריכוז הרלוונטיים של המתחם unlabelled (עבור פרוטוקול אסיד, 1 מ"מ אסיד). הערה: ייתכן הדגירה מראש שלא יהיה צורך.</li>
	</ol>
</li>
	<li>יוצקים את נוזל טרום דגירה מכל שקופית ולאחר להעביר את השקופיות חזרה אל מגש פלסטיק.</li>
	<li>כדי למנוע התייבשות, מיד דגירה הסעיפים הרלוונטיים ריכוז של radioligand במאגר assay בתנאים הרצויים (עבור פרוטוקול אסיד, 1 ננומטר [3H] HOCPCA עבור 1 h RT) על ידי כיסוי הסעיפים לחלוטין עם radioligand פתרון (700 µL למקטעי הילתית מכרסמים 3-4).<ol>
<li>דגירה תחת תחת עדין קבוע (20 סל ד) רעד של מגשי פלסטיק עם מכסה סגור. הערה: ריכוז radioligand הניתנים לאימות על ידי ספירת של aliquot ב מונה נצנוץ נוזלי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להסיר את הפתרון דגירה על ידי לשפוך את הנוזל, להעביר את השקופיות לתוך ארון שקופיות מיקרוסקופ. מיד להמשיך לשלב הבא כדי למנוע התייבשות סעיף.</li>
	<li>לשטוף את השקופיות. עבור פרוטוקול אסיד, לשטוף עם מאגר assay כקרח פעמיים עבור 20 s ולאחר מכן לשטוף ואז פעמיים בטבילת המדף שקופית במגשים מלאים קרח מים מזוקקים להסרת מלחים. מקם את השקופיות אנכית בארונות תקשורת עבור air-drying לפחות שעה-RT או יבש השקופיות עבור 5 דקות עם מפוח להגדיר טמפרטורה קר. הערה: כביסה חייב להיות מותאם במיוחד, למשל, כביסה נרחב עשויה להיות שימושית עבור הפחתת מחייב שאינם ספציפיים.</li>
	<li>להעביר את השקופיות fixator המכילה אבקת paraformaldehyde (PFA) עבור קיבוע לילה עם כדורגלן האדים ב RT כדי להגן על היושר של המתחם ליגנד-יעד. התראה: PFA רעיל. למקם את fixator בתוך מנדף, להימנע ממגע עור/עיניים עם כדורגלן.</li>
	<li>למחרת, להעביר את השקופיות תיבת desiccator המכילה סיליקה ג'ל עבור h 3 RT לסלק לחות.</li>
</ol>3. חשיפה פוספור הדמיה צלחות וסריקה
<ol><li>מקום הסעיפים קלטת ממוגן קרינה צלחת הדמיה עם רקמת פונה כלפי מעלה. על כימות עוקבות של איגוד radioligand, לכלול microscale [3H] של כל קלטת. לארגן את הסעיפים באופן אקראי ולחשוף את הסעיפים להשוואה ישירה במגרה אותו.</li>
	<li>למחוק את הזרחן טריטיום רגיש הדמיה צלחת מיד לפני השימוש כדי להסיר שהצטברו. אותות אחסון וכדי לחסל את הרקע אותות. לכן, לטעון את הצלחת לתוך מכונת הדמיה פוספור, לחשוף אותם בפני גלוי/אינפרא אדום בהיר על פי ההוראות של היצרן.</li>
	<li>הסר את הלוחית של מכונת הדמיה פוספור והכנס אותו מיד בסעיפים בקלטת. ודא כי בקלטת סגורה לחלוטין. חושפים את הסעיפים לצלחת הדמיה פוספור במשך 3 ימים ב- RT מפני אור.</li>
	<li>כי אור מוחק אות מהצלחת הדמיה, בזהירות לפתוח את הקלטת בחושך מיד להעביר את הצלחת ההדמיה לתוך התיבה כהה imager פוספור או למקם םלצה פוספור בחדר חשוך. הערה: הקפד notate הסידור המרחבי של השקופיות במהלך החשיפה כדי לזהות הדגימה בודדים על התמונה הדיגיטלי לאחר ניתוח. לכן, צלחות הדמיה פוספור להציג גם פינה אחת חיתוך זווית ברורים על מנת לזהות את הכיוון הנכון של הצלחת על התמונה הדיגיטלית.</li>
	<li>סרוק את הצלחת לרזולוציה הגבוהה ביותר ניתן לקבל תמונות דיגיטליות.</li>
</ol>4. אופציונלי: Cresyl מכתים סגול סעיפים רקמות
<ol><li>להכין 1% cresyl, ויולט פתרון על ידי ערבוב 5 g אצטט cresyl סגול ב- 500 מ"ל מים יונים (dH2O) עד התפרקה (כ ח 2). לסנן באמצעות נייר סינון באמצעות משפך לתוך בקבוק 500 מ"ל חדש. להתאים את ה-pH ל 3.5-3.8.</li>
	<li>מיקום ההכתמה שקופית להגדיר תחת fume המנוע. להכין מגשים עם הפתרונות הבאים לפי לבן מגשי פוליפרופילן (למעט קסילן): א 50% ethanol/50% dH2O נולד ב 70% ethanol/30% dH2O ג. 100% אתנול ד 100% אתנול אי 100% dH2O פ 1% cresyl סגול ג 0.07% חומצה אצטית (להוסיף µL 175 של חומצה אצטית 250 מ של dH2O). ה 100% קסילן במגשים עמידים הממיס הירוק אני 100% קסילן במגשים עמידים הממיס הירוק</li>
	<li>להעביר את השקופיות למכסה fume ומניחים בארון תקשורת שקופית.</li>
	<li>יתמוסס ליפידים באמצעות הגדלת סדרת מדורגת של אתנול dH2O 100% אתנול (מגש-ד) על ידי שילוב של שקופיות 1 דקות.</li>
	<li>נתרענן דגימות dH2O דרך יורד ריכוזי אתנול (מגש-d בסדר הפוך, ואחריו מגש e) על ידי שילוב של שקופיות 1 דקות.</li>
	<li>לטבול את דגימות בפתרון cresyl, ויולט למשך 10 דקות.</li>
	<li>יש לשטוף את דגימות ב- 0.07% חומצה אצטית ע י הרמת את השקופיות מעלה מטה בעדינות על ס' 4-8 לשטוף את השקופיות בטבילת dH2O עבור 1 דקות.</li>
	<li>מייבשים את דגימות ע י השריית השקופיות ב-30 s בסדר עולה ריכוזי אתנול (מגש-ד).</li>
	<li>העברת דגימות דרך שני מגשים של קסילן 100% (מגש h ואני) כדי להרוות האתנול.</li>
	<li>נתרענן דגימות dH2O דרך יורד ריכוזי אתנול (מגש-d בסדר הפוך, ואחריו מגש e) על ידי שילוב של שקופיות 1 דקות.</li>
	<li>הסר את השקופיות תמיסת מלח עם מלקחיים. הוסף מספר טיפות של הממס האורגני הרכבה מדיה לכל שקופית ולהוסיף coverslip 24 x 60 מ מ על גבי כדי להגן על דגימות. להסיר בועות אוויר בין הדגימה coverslip בהקשת בעדינות על גבי coverslip. הערה: שמור את השקופיות הנותרים קסילן במהלך ההרכבה כדי למנוע התייבשות.</li>
	<li>השקופיות יבש לילה בשכונה fume-RT.</li>
	<li>להשיג תמונה של הדגימה עם מיקרוסקופ, המטרה X 1.25.</li>
</ol>5. densitometric ניתוח של תמונה דיגיטלית
<ol><li>למדוד צפיפות אופטית היחסי (מוטות) של כל כיול סטנדרטי מ microscale [3H] עם תוכנת ניתוח התמונה.<ol>
<li>בחר אזור בגודל זהה עבור כל נקודה של microscale [3H] בעזרת כלי ליצירת אזור של פריט התפריט אזור נחישות. להקצות מספר בכל אזור שנבחר על ידי לחיצה על מספר תחת פריט התפריט תווית.</li>
		<li>ייצוא OD ערכים עבור כל נקודת הכיול סטנדרטי על ידי לחיצה על קובץ | E ייצוא | אזור 2D ח. להעביר ערכים רוד גיליון אלקטרוני, לנרמל לפי גודל האזור שנבחר. לבצע רגרסיה ליניארית כדי לקבל עיקול רגיל לצורך ניתוח densitometric נוסף. הערה: ודא כי האזורים שנבחרו לוחיות ההסבר על מנת לזהות התאמת ערכי רוד ודוגמאות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבצע כימות של autoradiograms באמצעות קניינית imaging התוכנה על-ידי בחירת האזור עניין (ROI) באמצעות כלי יצירת אזור בכל מקטע ומדידת שלה מקרי מוות ממנת יתר. בחר באותו האזור בכל מקטע על-ידי יצירת תבנית עבור האזור של עניין, אשר הועתקו, שמותאם ידנית כדי הבדלים קלים באנטומיה המוח על כל autoradiogram. לזהות את האנטומיה של רועי על ידי השוואה של autoradiograms עם אטלס18המוח. כאשר טיפולים מרובים מושווים, לבצע את הניתוח עיוור ולא אקראי כדי להימנע משוחד מבחר ROIs.</li>
	<li>ייצוא ערכים רוד והגדלים של אזורים שנבחרו לתוך גיליון אלקטרוני על-ידי לחיצה על קובץ | E ייצוא | אזור 2D ח.</li>
	<li>לחלק את המוט מדודה של רועי שנבחרו על ידי אזור שלו כדי להשיג הצפיפות לכל אזור מסוים.</li>
	<li>למדוד את המוט של הרקע של הצלחת ולייצא ערכים רוד מתאימים וגודל האזור לתוך גיליון אלקטרוני. להחסיר את האות רקע הממוצע של כל ערך רוד של כל רועי.</li>
	<li>ממוצע המוטות של משכפל טכניים, קרי, סעיף משכפל השימוש ברקמה מן אותה חיה.</li>
	<li>השתמש העקומה סטנדרטי כדי להמיר מוטות ליחידות של איגוד radioligand, כלומר., nCi/mg רקמות מקבילות (TE). הערה: TE המונח משמש כי הסטנדרטים נוצרים עם חומרים להדמיית רקמת.</li>
	<li>לבטא הכריכה על ידי המרה של nCi/mg nmol/mg טה בהתאם לפעילות ספציפית radioligand (משוואה 1). <img alt="נוסחת חישוב קשירת ליגנד, משוואה המתארת nmol/mg TE, רלוונטית למחקר ביוכימי." src="/files/ftp_upload/58879/58879eq1v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation">(1)</li>
	<li>כדי לקבל ערכים ספציפיים מחייב, להחסיר שאינם ספציפיים איגוד מ מחייב הכולל.</li>
	<li>משכפל הכריכה של כל שכפול ביולוגי באמצעות הממוצע של הצד הטכני הממוצע של כל בעל חיים (להשיג ב- 5.6 שלב).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

איכות autoradiographic assay נקבעת בדרך כלל לפי הרגישות של radioligand. גורם תורם מרכזי הוא radioisotope הנבחר, אשר ניתנת על-ידי הזמינות של ליגנדים ידוע או את הכדאיות של טכניקות ספציפיות labelling להניב ליגנדים עם פעילות ספציפית המתאימה (קרי, את כמות הרדיואקטיביות לכל יחידת השומה של radioligand)23, עם כמות מוגבלת של השפלה כימי. מספר גדול של radioligands של ליגנדים ידוע מלווים בלוחיות טריטיום9,10,24</su...

Autoradiography היא שיטה אשר מספק תמונות של דעיכה רדיואקטיבית. הטכניקה משמשת באופן שגרתי ללמוד התפלגות רקמת חלבון של עניין במבחנה המבוססת על אינטראקציה עם תרופתי ספציפי בין תרכובת radiolabelled המטרה שלו. זה מספק מידע ישיר על סלקטיביות ליגנד המטרה. במבחנה autoradiography עשוי לשמש גם קביעה כמותית של איגוד תרופתי הפרמטרים של radioligands, כגון קבוע דיסוציאציה (דK), צפיפות של אתרי קישור (Bmax), כמו גם לקביעת עיכוב הקבוע (Ki) של ליגנדים מתחרות1,2. בהשוואה לאיגוד radioligand homogenate מסורתיים, autoradiography יש את היתרון של מסוגל לדמיין אנטומיה המרחבי ולתת פרטים תמציתי של דפוסי ביטוי אזוריים3. השיטה של autoradiography לכן חלופה רלוונטי immunocytochemistry, במיוחד בהעדר נוגדן המאומת. Autoradiography מיושם בקלות בתוך מעבדה סטנדרטיים radioisotope קיבלו את הזמינות של radioligand מתאים עם יחודיות תרופתי הנדרש, גישה cryostat מיקרוטום עבור הכנת רקמות, ומקטעים של הדמיה מתאימים המכשיר כי הוא מסוגל לנתח את ההפצה של רדיואקטיביות בסעיפים המתאימים רקמות. ראוי לציין, קריטריון הבחירה חשובה עבור radioligand הוא כמות מוגבלת של איגוד לאתרים שאינם-יעד. זה יכול להיות חלבונים, ריריות או חומרים כגון פלסטיק או מסננים אחרים, הוא המכונות במקובץ מחייב שאינם ספציפיים. בדרך כלל, לא ספציפית מחייבת היא אי-saturable אבל יכול להיות saturable אם זה קשור חלבון חופש-יעד ספציפי. הדרך הטובה ביותר של אימות נכון מחייב ספציפית היא להשוות בין רקמות חסר המטרה, למשל, גנטית מהונדסים רקמות (הנוק-אאוט)4.
. הנה, המתודולוגיה מודגם עם אפיון האתר גבוהה-זיקה מחייב עבור חומצה γ-hydroxybutyric (אסיד) במוח של יונקים autoradiographic. הבנת האינטראקציה תרופתי בין אסיד לבין אתר איגוד שלו הוא מידת הרלוונטיות וכן אסיד שני תרופה שימושי קלינית לטיפול narcolepsy אלכוהוליזם5, אלא גם נתין הטבעי של המוח יונקים ו של פנאי סמים6. אתרי קישור אסיד גבוה-זיקה תוארו לראשונה באמצעות קשירה אסיד [3H] rat-המוח-homogenate-7. במהלך השנים, לקדם מחקרים autoradiography עם [3H] אסיד ופניות של [3H] רכיבי NC-382, הראה צפיפות גבוהה של איגוד אתרי באזורים הקדמי של עכברוש8,9,10, עכבר9 , חזיר המוח של11וקוף אדם-12. עם זאת, זהות מולקולרית והרלוונטיות המדויק פונקציונלי של אתרים אלה מחייב נשארו חמקמק.
עם כוונה לאפיין נוספת של אתרי קשירה, וכדי להקל על מחקרים על תפקיד פיזיולוגי של אסיד, פותחו מרובים radioligands שילוב איזוטופים שונים ניחן הזיקות השונות ([3H] GHB, [3 H] רכיבי NC-382 [3H] HOCPCA, [125אני] BnOPh-GHB)13,14,15,16(נבדקה17) (איור 1). השילוב של radioligands גבוהה-זיקה סלקטיבית, צפיפות רקמת גבוהה מאוד של האיגוד אתרי אפשרו לייצור של תמונות באיכות גבוהה באמצעות הזרחן הדמיה טכניקה9,11. יחד עם חלוקה לרמות של נקודות מעשיות בהגדרת ניסוי autoradiographic ואיור לצורך המחשה פרטים, המקטע לדיון ידגיש i) הבחירה של רדיונוקלידים ii) בחירה וזמינותו תנאי, iii) השימוש פוספור הדמיה צלחות לעומת לסרטי רנטגן. המטרה הכוללת של מאמר זה נועד לספק פרטים טכניים, מתודולוגי ומדעיים על טכניקת autoradiography בשביל לידע על רקמות הפצה וניתוח תרופתי של חלבון מטרות.

<table><tbody><tr><td>אתנול אבסולוטי</td><td>Merck Millipore</td><td>107017</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>BAS-TR2040 לוחית הדמיה</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>28956481</td><td>20x40 ס"מ - רגיש לטריטיום</td></tr><tr><td>קרזיל סגול אצטט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>DPX (אמצעי הרכבה לא מימי למיקרוסקופיה)</td> <td>Merck Millipore</td><td>100579</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. תרכובת, 12 x 125 מ"ל</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>Tissue-Tek</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus שקופיות</td><td>VWR</td><td>631-9483</td><td>מיקרוסקופ שקופיות</td></tr><tr><td>Tissue-Tek סט צביעת שקופיות ידני</td><td>Sakura Finetek דנמרק ApS</td><td>4451</td><td></td></tr><tr><td>תקן טריטיום על Glas</td><td>American Radiolabeld Chemicals, Inc.</td><td>ART 0123</td><td></td></tr><tr><td>תחליף קסילן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A5597</td><td></td></tr></tbody></table>

autoradiography כאל שיטה פשוטה ורבת -עוצמה עבור ויזואליזציה ואפיון של מטרות תרופתי

Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

במבחנה autoradiography נועד להמחיש את התפלגות האנטומי של חלבון עניין ברקמות חיות ניסוי, כמו גם בני אדם. השיטה מבוססת על הכריכה ספציפי של radioligand למטרה הביולוגי שלו. לכן, מקטעי רקמת קפוא מודגרת עם פתרון radioligand, האיגוד אל המטרה הוא לאחר מכן מקומי על ידי הגילוי של דעיכה רדיואקטיבית, לדוגמה, באמצעות סרט פוטוסנסיטיבית או זרחן הדמיה צלחות. Autoradiograms דיגיטלי שנוצר להציג רזולוציה מרחבית יוצא דופן, אשר מאפשרת כימות ולוקליזציה של איגוד radioligand במבנים אנטומיים ברורים. יתר על כן, כימות מאפשרת אפיון ליגנד זיקה תרופתי באמצעות קבועי דיסוציאציה (דK), עיכוב קבועים (Kאני), כמו גם הצפיפות של אתרי קישור (Bmax) ברקמות שנבחרו. לכן, השיטה מספקת מידע אודות המטרה לוקליזציה והן ליגנד סלקטיביות. כאן, הטכניקה היא ביטוי עם אפיון autoradiographic של החומצה גבוה-זיקה γ-hydroxybutyric (אסיד) מחייב אתרי ברקמת המוח יונקים, תוך שימת דגש מיוחד על שיקולים מתודולוגי בנוגע וזמינותו מחייבת פרמטרים, הבחירה של radioligand ואת שיטת זיהוי.

התפלגות האנטומי של האתרים מחייב אסיד גבוה-זיקה באמצעות פרוטוקול המתואר, היה דמיינו את אנלוגי אסיד radiolabelled [3H] HOCPCA במוח העכבר, אשר נקטעה למקטעים הילתית, הווריד, אופקי (איור 3 ). רמות גבוהות של איגוד נצפתה היפוקמפוס, קליפת המוח, איגוד נמוך ב סטריאטום ואיגוד לא זוהה המוח הקטן, המתאים ביטוי דיווח קודמות, דפוסי זיקה גבוהה אסיד אתרי9,10, 11,</sup...

השיטה של autoradiography נמצא בשימוש שגרתי ללמוד קשירה של radioligands על מקטעים של רקמות לקביעת פרמקולוגיה איכותי או כמותי.

Autoradiography כאל שיטה פשוטה ורבת -עוצמה עבור ויזואליזציה ואפיון של מטרות תרופתי

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

אוטוביוגרפיה היא טכניקה חזקה ופשוטה ללמוד הפצה של אתרי קשירה חלבון ברקמות באמצעות radioligand ספציפי עבור היעד. זה גם חלופה מתאימה אימונוהיסטוכימיה. טכניקה זו מדמיינת ביטוי חלבון ברזולוציה מרחבית באמצעות תמונות דיגיטליות מהירות יותר מחשיפה מסורתית לסרטים.זה עשוי לשמש גם לניתוח תרופתי של מטרות חלבון. השיטה כוללת רקמות עכבר המותקנות על זכוכית אך ניתן להרחיבן למינים אחרים או אפילו לתאים הגדלים על כיסויים. הדגמת ההליך תהיה על ידי נאן Griem-Krey, דוקטורנט במעבדה שלי.כדי להתחיל, להטביע את הרקמה באבקת קרח יבש כדי לצלם להקפיא אותו. מעבירים את הרקמה הקפואה ישירות להקפאה שנקבעה למינוס 20 מעלות צלזיוס. תן לרקמה להתאקלם למינוס 20 מעלות צלזיוס בהקפאה במשך 20 דקות.לאחר מכן מכסים את מחזיק הרקמה עם מדיום הטבעה מחוץ קריוסטט במהירות למקם את דגימת הרקמה הקפואה בכיוון הרצוי בעוד המדיום הטבעה הוא עדיין נוזלי. מעבירים את מחזיק הרקמה בחזרה להקפאטאט וחושפים את המדיום המטביע לטמפרטורות מתחת למינוס 10 מעלות צלזיוס להקשחה. מקם את מחזיק הרקמה במיקרוטום של ההקפאה.התאימו את כיוון הרקמה כדי למנוע מקטעים משופעים. חותכים את הרקמה עם הדרכה של אטלס סטריאוטוקסי בחלקים של עובי הרצוי ולפתח את החלק עם מברשת קטנה במידת הצורך. הפשר את המקטע על מגלשת מיקרוסקופ.לאחר מכן לאסוף ברצף את הסעיפים מאזור העניין עבור החזרה הטכנית הרצויה. אפשר לחלקים בשקופיות להתייבש למשך שעה אחת לפני טיפול נוסף. במעבדה רדיואקטיבית מוסמכת, השתמש בעיפרון כדי לתייג את השקופיות בתנאי הניסוי.מקם את השקופיות אופקית במגשי פלסטיק. החל בזהירות אמצעי אחסון מתאים של מאגר שיוך דם המותאם ליעד הנדון על המקטעים שנטענו בשקופיות. ודא שכל מקטע מכוסה לחלוטין.לקביעת איגוד לא ספציפי, תוספת מאגר SA עם ריכוז רלוונטי של תרכובת ללא תריס. לאחר מכן מכסים את המגשים במכסים כדי למנוע אידוי. טרום דגירה בטמפרטורה רלוונטית במשך 30 דקות על שייקר צלחת להגדיר 20 סל"ד.לאחר מכן, יוצקים את נוזל הדגירה מראש מכל שקופית ומעבירים את השקופיות בחזרה למגש הפלסטיק. מיד לכסות את החלקים לחלוטין עם הריכוז הרלוונטי של radioligand במאגר SA. לקביעת מחייב לא ספציפי, תוספת רדיוליגנד פתרון עם ריכוז רלוונטי של תרכובת ללא תריס.מכסים את המגשים במכסים ודגירה בתנאים הרצויים עם רעידות עדינות קבועות ב-20 סל"ד. לאחר מכן, יוצקים את פתרון הדגירה ומעבירים את השקופיות לתוך ארון תקשורת לשקופיות מיקרוסקופ. מיד לשטוף את השקופיות.לפרוטוקול GHB, יש לשטוף פעמיים עם חיץ SA קר כקרח למשך 20 שניות ולאחר מכן לשטוף פעמיים על-ידי טבילת מתלה השקופיות במגשים מלאים במים מזוקקים קרים כקרח. מקם את השקופיות אנכית בארונות תקשורת וייבש את האוויר למשך שעה אחת לפחות. לאחר מכן להעביר את השקופיות ל קיבוע המכיל paraformaldehyde עבור קיבעון לילה בטמפרטורת החדר.למחרת, להעביר את המגלשות לקופסת desiccator המכילה ג'ל סיליקה בטמפרטורת החדר. השאירו את השקופיות בתיבת ההתבולל למשך שלוש שעות כדי למנוע לחות. ראשית, מניחים את החלקים לתוך קלטת צלחת הדמיה מוגנת קרינה עם הרקמה פונה כלפי מעלה.כלול מיקרו-קנה מידה רדיואקטיבי בכל קלטת לכמות הבא של כריכת רדיוליגנד. מיד לפני השימוש, לטעון את צלחת הדמיה זרחן רגיש טריטיום לתוך מכונת הדמיה זרחן ולחשוף אותו לאור אינפרא אדום גלוי על פי הוראות היצרן כדי למחוק אותו. לאחר מכן הסר את לוח ההדמיה ממכונת ההדמיה של הזרחן והצב אותה מיד על החלקים בקלטת.ודא שהקלטת סגורה לחלוטין. חשוף את החלקים לצלחת הדמיית הזרחן לזמן החשיפה האופטימי בטמפרטורת החדר תוך שמירה מפני אור. לאחר החשיפה, פותחים בזהירות את הקלטת בחושך ומיד מעבירים את לוח ההדמיה לתוך הקופסה הכהה של דימוי זרחן.סרוק את הלוח ברזולוציה הגבוהה ביותר האפשרית כדי לקבל תמונה דיגיטלית. כדי להתחיל, פתח תוכנית מתאימה לניתוח תמונות. קבע את הצפיפות האופטית היחסית עבור כל תקן כיול על-ידי בחירת קביעת אזור פריט התפריט.בחרו בכלי ליצירת אזורים ולהשתמש בו לבחירת אזור בגודל שווה לכל נקודה במיקרו-גוונים הרדיואקטיביים. הקצה מספר לכל אזור שנבחר על-ידי לחיצה על מספר תחת תווית פריט התפריט. לחץ על ייצוא קבצים ולאחר מכן על דוח אזור דו-מימדי כדי לייצא את ערכי ה- OD עבור כל נקודה בתקן הכיול.בתוכנת ההדמיה הקניינית, השתמש בכלי ליצירת אזור כדי לבחור את אזור העניין בכל מקטע ולמדוד את ה- ODs שלו כדי להתחיל לבצע כימות של האוטרדיוגרמות. בחר את אותו אזור בכל מקטע על-ידי יצירת תבנית עבור אזור העניין והעתק והתאם אותו לווריאציות קלות באנטומיה של המוח בכל אוטורדוגרמה. לאחר מכן, לחץ על דוח אזור דו-מימדי של ייצוא קבצים כדי לייצא את הערכים והגדלים של ROD של אזורים נבחרים לגיליון אלקטרוני.קבע את האיגוד של הרדיוליגנד כמפורט בפרוטוקול הטקסט. במחקר זה, ההתפלגות האנטומית של אתרי קשירה GHB זיקה גבוהה הם דמיינו עם רדיולאבלד GHB אנלוגי רדיואקטיבי HOCPCA במוח העכבר אשר נחתך לתוך קורונדל, קשת, וקטעים אופקיים. רמות גבוהות של קשירה נראים בהיפוקמפוס ובקליפת המוח, בעוד רמות קשירה נמוכות יותר נראים בסטריאטום ולא מזוהה כריכה בצוואר הקטן.כפי שמוצג כאן, המבנים האנטומיים עשויים להיות חזותיים באמצעות מישורים שונים ושלמות אנטומית עשויה להיות נתמכת על ידי כתמים סגולים cresyl. אוטורדוגרמות מייצגות של חולדה, עכבר וחזיר ממחישות את השימור האבולוציוני של אתרי קשירה GHB בעלי זיקה גבוהה במוח היונקים. אתרי איגוד HOCPCA רדיואקטיביים מזוהים בכל שלושת המינים המאפשרים השוואה של אנטומיה מוחית גסה ביניהם.אתרי איגוד GHB זיקה גבוהה נבדקים עם רדיוליגנדים GHB אשר מציגים זיקה שונה עבור אתרי הכריכה אבל פעילויות ספציפיות דומות. HOCPCA רדיואקטיבי ניחן ברגישות גבוהה ויחס אות מעולה לרעש. בשל הרגישות הנמוכה יותר של NCS-382 רדיואקטיבי, יש להשתמש בריכוזי רדיוליגנד גבוהים יותר על מנת להשיג רמות דומות של קשירה.אפילו ריכוזי רדיוליגנד גבוהים יותר נחוצים עבור GHB רדיואקטיבי כדי להשיג רמות קשירה דומות. עם זאת, ריכוזי רדיוליגנד גבוהים יותר גם להגדיל את רמת כריכה לא ספציפית עם יחס אות נמוך יותר לרעש וכתוצאה מכך. חשוב לייעל את תנאי ההתמדה כמו ריכוז radioligand, כביסה ותזמן חשיפה על מנת לקבל את האות הטוב ביותר ליחסי רעש וזה גם מאוד חשוב לזכור למחוק את הצלחת לפני.ניתן להאריך את ההליך לתנאי vivo כדי לקבל מושג על כריכה מורכבת בבעלי חיים אשר יכול להיות שימושי עבור פרויקטים גילוי. זכור לעבוד במעבדה עם חומר רדיואקטיבי מלא מוסמך ללבוש בגדים מגן בעת טיפול רדיואקטיביות או paraformaldehyde.

autoradiography-as-simple-powerful-method-for-visualization

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מתארים זרימת עבודה עבור מהירות ניתוח ולחקור את האוספים של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות PhenoRipper, פלטפורמת דימוי ניתוח שפותחה לאחרונה.

ראפיד ניתוח וחקירה של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת כדי לדמיין ולעקוב אחר קולטנים בודדים על פני תאים חיים ובכך לנתח את הניידות הרוחבית של הקולטן, גודל קומפלקסי הקולטנים וכן לדמיין אינטראקציות קולטן-קולטן חולפות. ניתן להרחיב פרוטוקול זה לחלבוני ממברנה אחרים.

רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

סחר קולט מודולציה היענות איתות ותא לligands והוא, עצמו, מגיב לתנאי תא, כוללים איתות מושרה ליגנד. כאן אנו מתארים טכניקה חזקה וגמישה לכמותית הערכת סחר קולט תוצאת משימוש בסמים באמצעות immunolabeling וניתוח colocalizational.

מעקב אחר שינויים בהשפעת סמים בסחר פוסט-הפנמת קולטן על ידי ניתוח Colocalizational

מוצג פרוטוקול לסינון תרופות מולקולרי קטן המבוסס על סינתזה באתרה של ננו-אשכולות זהב פלואורסצנטיים קטנים במיוחד (Au NCs) באמצעות חלבון טעון תרופות כתבנית. שיטה זו פשוטה לקביעת הזיקה של תרופות לחלבון מטרה על ידי אות פלואורסצנטי גלוי הנפלט מתבנית החלבון Au NCs.

מהיר וכמוני Fluorimetric שיטה להקרנת סמים מיקוד-חלבון מולקולה קטנה

כאן אנו מציגים פרוטוקול לתיאור לוקליזציה של קולטני אנגיוטנסין II מסוג 1 במוח החולדה על ידי אוטורדיוגרפיה כמותית, דנסיטומטרית, קולטן במבחנה באמצעות אנלוגי יוד-125 של אנגיוטנסין II.

קולטן autoradiography פרוטוקול עבור ויזואליזציה המרוכזת של אנגיוטנסין II רצפטורים

כאן, אנחנו תיאר שיטה הדמיה גבוהה-תוכן לכמת התעבורה של מוטציות אופסין # רודופסין הקשורים עם רטיניטיס פיגמנטוזה. ניתוח התוצאות מרובות באורך הגל שימש לכמת אופסין # רודופסין החלבון על פני התא או את כל התא.

וזמינותו תחבורה אופסין # רודופסין על ידי ניתוח גבוהה-תוכן הדמיה

כאן, אנו מייצגים פרוטוקול עבור הרדיו האוטומטי לחלוטין של [11ג] הצמד-7941 וניתוח של קינטיקה בזמן אמת של זה PET-מעקב על P-gp הבעת תאים שאינם ביטוי.

היבט טכני של סינתזה אוטומטי הערכה בזמן אמת קינטי של [11ג] הצמד-7941

אנו מתארים פרוטוקולים עבור הערכת מידת התמרה על ידי תאי-חודר פפטידים ניצול מערכות הדמיה vivo ex ולאחר מכן הטבעה פרפין, ומיקרוסקופית פלורסנט קונפוקלית וקד באמצעות מיקוד הלב פפטיד כדוגמה. בפרוטוקול שלנו, בעל חיים יחיד יכול לשמש לרכישת שני סוגים של הערכת הדמיה של אותם איברים, ובכך לחתוך את מספר בעלי החיים הדרושים ללימודים על ידי חצי.

ב Vivo הדמיה של התמרה יעילות של מיקוד הלב פפטיד

פרוטוקול זה מציג סדרה של ניסויים שאומצו להערכת פפטידים אנטי-סרטניים הניתנים להחלפה, שניתן להשתמש בהם בסינון פרה-קליני של תרכובות כאלה. זה כולל הערכת ציטוטוקסיות בתרביות תאים דו-ממדיות ותלת-ממדיות, הערכת יעילות פוטואיזומריזציה של רקמת מודל (ex vivo) ויעילות in vivo .

הערכה חוץ גופית ו-in vivo של תרכובות פעילות ביולוגיות מבוקרות - תרופות מועמדות פוטנציאליות לפוטופרמקולוגיה של סרטן

אנו מציגים פרוטוקול להדמיה ישירה של פעילויות מטבוליות בתאים המווסתים על ידי חומצות אמינו באמצעות מיקרוסקופ פיזור ראמאן מגורה (DO-SRS) המשולב במיקרוסקופ פלואורסצנטי עירור של שני פוטונים (2PEF).

הדמיה כימית ביו-אורתוגונלית של מטבוליזם בתאים המווסתת על ידי חומצות אמינו ארומטיות

פרוטוקול זה מציג הליך מפורט להכנת ארבעה רדיוטרייסרים פחמן-11 באמצעות "שיטת הלולאה" [11C]מתילציה. אנו מתארים את הליך הסינתזה [11C]ER-176, עם נתונים עבור שלושה רדיוטרייסרים נוספים: [11C]MRB, [11C]mHED ו-[11C]PiB. שיטת הלולאה מספקת סינתזה יעילה עם תפוקות רדיוכימיות מוגברות כנגד כלי התגובה המסורתיים [11C]methylation.

שיפור היעילות ותפוקות התיוג הרדיואקטיבי של רדיוליגנדים פחמן-11 למחקר קליני בשיטת לולאה

למדו אוטורדיוגרפיה כטכניקה פשוטה ויעילה לוויזואליזציה של אתרי קישור ליגנדים ברקמות עכבר. שיטה זו מציעה רזולוציה מרחבית גבוהה ומהירות תיעוד דיגיטלי לניתוח פרמקולוגי.

Autoradiography כאל שיטה פשוטה ורבת -עוצמה עבור ויזואליזציה ואפיון של מטרות תרופתי

גלה סרטונים נוספים