Name: Colletotrichum fioriniae פיתוח מים ותמציות פרחים מבוסס כלורופורם אוכמניות, חמוציות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: למדו את פרוטוקול הביואסהי להערכת דינמיקת הפיתוח של Colletotrichum fioriniae באמצעות תמציות פרחים מכלורופורם ומים. השיטה מאפשרת מעקב בזמן אמת אחרי גירויים טבעיים המשפיעים על פתוגנים צמחיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים של ויליאם ס היינס, קרן מחקרים חמוציות ניחן האב ואת ניו ג'רזי אוכמניות וחמוציות מחקר המועצה, inc... על התמיכה. אנו מודים גם ג'ניפר Vaiciunas (והכוונה ההכנות פרחוני), כריסטין Constantelos (תרבות פטרייתי וההכנות פרחוני), דייוויד ג'ונס (תכשירים צמחיים, עקירות), לאנגלי Oudemans (תכשירים צמחיים, לצלם/צילום), ג'סי . לינץ ' (תכשירים צמחיים), רוקסן Tumnalis (תמיכה כללית), בו מתמחים סטודנט/קיץ.

<ol><li>Pszczółkowska, A., Okorski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+report+of+anthracnose+disease+caused+by+Colletotrichum+fioriniae+on+blueberry+in+western+Poland%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">First report of anthracnose disease caused by Colletotrichum fioriniae on blueberry in western Poland.</a> Plant Disease. 100, 2167(2016).</li>
<li>Oudemans, P. V., Caruso, F. L., Stretch, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranberry+fruit+rot+in+the+northeast%3A+a+complex+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">Cranberry fruit rot in the northeast: a complex disease.</a> Plant Disease. 82, 1176-1184 (1998).</li>
<li>Damm, U., Cannon, P. F., Woudenberg, J. H. C., Crous, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Colletotrichum+acutatum+species+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Studies+in+Mycology%22%5BJournal%5D)">The Colletotrichum acutatum species complex.</a> Studies in Mycology. 73, 37-113 (2012).</li>
<li>Marcelino, J., Giordano, R., Gouli, S., Gouli, V., Parker, B. L., Skinner, M., TeBeest, D., Cesnik, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colletotrichum+acutatum+var.+fioriniae+%28teleomorph%3A+Glomerella+acutata+var.+flioriniae+var.+nov.%29+infection+of+a+scale+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">Colletotrichum acutatum var. fioriniae (teleomorph: Glomerella acutata var. flioriniae var. nov.) infection of a scale insect.</a> Mycologia. 100, 353-374 (2008).</li>
<li>Pennycook, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colletotrichum+fioriniae+comb.+%26+stat.+nov.%2C+resolving+a+nomenclatural+muddle%5BTitle%5D)+AND+%22Mycotaxon%22%5BJournal%5D)">Colletotrichum fioriniae comb. & stat. nov., resolving a nomenclatural muddle.</a> Mycotaxon. 132, 149-154 (2017).</li>
<li>Shivas, R. G., Tan, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+taxonomic+re-assessment+of+Colletotrichum+acutatum%2C+introducing+C.+fioriniae+comb.+et+stat.+nov+and+C.+simmondsii+sp+nov%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Diversity%22%5BJournal%5D)">A taxonomic re-assessment of Colletotrichum acutatum, introducing C. fioriniae comb. et stat. nov and C. simmondsii sp nov.</a> Fungal Diversity. 39, 111-122 (2009).</li>
<li>Wharton, P. S., Diéguez-Uribeondo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+Colletotrichum+acutatum%5BTitle%5D)+AND+%22Anales+del+Jard%C3%ADn+Bot%C3%A1nico+de+Madrid%22%5BJournal%5D)">The biology of Colletotrichum acutatum.</a> Anales del Jardín Botánico de Madrid. 61, 3-22 (2004).</li>
<li>Prusky, D., Alkan, N., Mengiste, T., Fluhr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quiescent+and+necrotrophic+lifestyle+choice+during+postharvest+disease+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Quiescent and necrotrophic lifestyle choice during postharvest disease development.</a> Annual Review of Phytopathology. 51, 155-176 (2013).</li>
<li>Milholland, R. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMilholland%2C+RD+%22Compendium+of+Blueberry+and+Cranberry+Diseases%22">Compendium of Blueberry and Cranberry Diseases</a>. , American Phytopathological Society. St. Paul, MN. (1995).</li>
<li>DeMarsay, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Anthracnose+fruit+rot+of+highbush+blueberry%3A+biology+and+epidemiology%22">Anthracnose fruit rot of highbush blueberry: biology and epidemiology</a>. , Rutgers University. New Brunswick, NJ. Dissertation (2005).</li>
<li>Madden, L. V., Yang, X. S., Wilson, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+rain+intensity+on+splash+dispersal+of+Colletotrichum+acutatum%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Effects of rain intensity on splash dispersal of Colletotrichum acutatum.</a> Phytopathology. 86, 864-874 (1996).</li>
<li>Yang, X., Madden, L. V., Wilson, L. L., Ellis, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+surface-topography+and+rain+intensity+on+splash+dispersal+of+Colletotrichum+acutatum%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Effects of surface-topography and rain intensity on splash dispersal of Colletotrichum acutatum.</a> Phytopathology. 80, 1115-1120 (1990).</li>
<li>Wharton, P. S., Dickman, J. S., Schilder, A. M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+spore+release+by+Colletotrichum+acutatum+in+Michigan+blueberry+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Timing of spore release by Colletotrichum acutatum in Michigan blueberry fields.</a> Phytopathology. 92, 86(2002).</li>
<li>MacKenzie, S. J., Peres, N. A., Timmer, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization+of+citrus+leaves+and+secondary+conidiation+response+to+citrus+flower+extracts+by+non-postbloom+fruit+drop+strains+of+Colletotrichum+acutatum%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Colonization of citrus leaves and secondary conidiation response to citrus flower extracts by non-postbloom fruit drop strains of Colletotrichum acutatum.</a> Tropical Plant Pathology. 35, 333-342 (2010).</li>
<li>Leandro, L. F. S., Gleason, M. L., Nutter, F. W., Wegulo, S. N., Dixon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strawberry+plant+extracts+stimulate+secondary+conidiation+by+Colletotrichum+acutatum+on+symptomless+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Strawberry plant extracts stimulate secondary conidiation by Colletotrichum acutatum on symptomless leaves.</a> Phytopathology. 93, 1285-1291 (2003).</li>
<li>Waller, T. J., Vaiciunas, J., Constantelos, C., Oudemans, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+the+blueberry+floral+extracts+influence+secondary+conidiation+and+appressorial+formation+of+Colletotrichum+fioriniae%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Evidence the blueberry floral extracts influence secondary conidiation and appressorial formation of Colletotrichum fioriniae.</a> Phytopathology. 108, 561-567 (2017).</li>
<li>Gager, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+influence+of+cranberry+floral+wax+on+appressorium+formation+in+Colletotrichum+fioriniae%22">The influence of cranberry floral wax on appressorium formation in Colletotrichum fioriniae</a>. , Rutgers University. New Brunswick, NJ. Masters thesis (2015).</li>
<li>Podila, G. K., Rogers, L. M., Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+signals+from+avocado+surface+wax+trigger+germination+and+appressorium+formation+in+Colletotrichum+gloeosporioides%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chemical signals from avocado surface wax trigger germination and appressorium formation in Colletotrichum gloeosporioides.</a> Plant Physiology. 103, 267-272 (1993).</li>
<li>Polashock, J. J., Caruso, F. L., Oudemans, P. V., McManus, P. S., Crouch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+North+American+cranberry+fruit+rot+fungal+community%3A+a+systematic+overview+using+morphological+and+phylogenetic+affinities%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">The North American cranberry fruit rot fungal community: a systematic overview using morphological and phylogenetic affinities.</a> Plant Pathology. 58, 1116-1127 (2009).</li>
<li>Miller, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V-8+juice+agar+as+a+general+purpose+medium+for+fungi+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">V-8 juice agar as a general purpose medium for fungi and bacteria.</a> Phytopathology. 45, 461-462 (1955).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

Bioassays גילוי התגובה fioriniae ג תמציות פרחים (FEs) פותחו עבור פרי אוכמניות, חמוציות רוט pathosystems אך ניתן להתאים בקלות אחרים צינה. פרוטוקול שתוארו לעיל יש כבר ערך להשגת ערכות נתונים חשובים רבים כולל, אך לא מוגבל: FE אפקטים מרובים מבודד של פתוגנים רבים, זמן-קורס מידע המתייחס צמיחה פטרייתי שלבים בנוכחות פס שונים, השוואה של טכניקות החילוץ, בדיקה של כימיקלים בודדים על צמיחה fioriniae ג ובידול, הערכה של פרחים בודדים איברים תמציות, השפעת טמפרטורה על fioriniae ג ואילו בנוכחות FE, אפקטים פנולוגיה שעווה התלויים עקירות, ואפקטים מי גשמים פרחוני. באמצעות שיטות אלה, נתונים שנוצרו יש גם בתנאי הבנה ברורה יותר של החיים fioriniae ג שלבים חלקית elucidates בגלל התקופה בלום היא כל כך קריטית השליטה של פירות רבים נרקב פתוגנים.
בתחילה, כל הפרחים עובדו באופן זהה פעיל-FE, אבל תהליך החילוץ עבר לכיוון באמצעות פרחים שלם. חיתוך פרחוני היה זמן רב, מעט מאוד השפעה על bioactivity של פס וכתוצאה מכך. עם זאת, איברים פרחים בודדים יכולים ויש כבר הערכה שימוש בפרוטוקול הזה, אבל זהירות רבה יש לנקוט כדי לא לגמרי macerate הרקמות פרחוני (1 סרט משלימה, עם הזהירות מפורט בשלב 2.3), כמו זה עלול לגרום שפורסמו פטריות-רעילים סטטיות תרכובות לתוך פה זה יכול לעוות את ההערכה מיקרוסקופיים. פחות עקירות פולשניים כגון מעבר -FE (משלימה את הסרט 2) ו- rw-FE הן כעת יותר חיובית עקב שלהם להקל על רכישת. בנוסף, טכניקות החילוץ אלה דורשים רק ואקום סינון כדי לרכוש פעילים ביולוגית סימנים כימיים פרחוני.
הפרחים מנוצל כל עקירות היו בדרך כלל בקירור של 0-3 ימים לפני הכנת תמצית. אתגר של פרוטוקול זה הוא ניהול זמן תחלופת FE (שדה אוסף דרך אחסון של תמציות). זה היה מתעצמת על דגימות רבות מספר מקורות ותאריכים. פרחים קפוא לא הוערכו במידה כלשהי אמיתי, כמו פרחים המופשרים מופיעים הורע, דהוי. עם זאת, ברגע הוכנו על פס על בסיס מים, חזר על הקפאת מפשיר הראה אין השפעה על bioactivity של פה, אז כל עוד פה והוקפאו הם במהירות לאחר הכנה bioassay (FE 3 בת קיימא).
כלורופורם מבוססי החילוץ מאפשר החקירה של פתוגן התגובות שעוות משטח תלת מימדי פרחוני/פרי במטוס מימדי באמצעות אידוי ch-FE על coverslips זכוכית דקה. עם זאת, סביר כי המבנים גבישי בפועל של שעוות שהופקדו מ ch-FE זהים השטח שממנו הם היו שנאספו. יש ליישם טכניקות משמעות, משלימה אם פטרייתי בתגובה שעווה ספציפי מבנים ויוו המוקד העיקרי של החקירה. תמציות מבוססי כלורופורם צריך תחזוקה אחסון יותר מאשר הקוד שיחולץ על בסיס מים. בנוסף לשמירת ch-FE תמציות בחושך, התרבות התא PTFE מרופדת צינור כובעים, מצלמות-מיקרוסקופים איטום גלישת צריך להיבדק באופן קבוע על הדלפות אויר והחליף במידת הצורך.
הרעיון של ניטור מי גשמים פרחוני נגר מושרשת ברעיון של קידום בכלי ניטור מחלות ספציפיות-לאתר. המכשירים איסוף מי גשמים ניתן להתאים ארכיטקטורות צמחים רבים אחרים, כל עוד המכשיר אוסף לוכדת מי גשמים יש להפעיל את הפרחים. גישה זו מספקת מידע על או לא גירוי פרחוני נוכח בשטח בכל זמן נתון, ניתן לנטר לאורך העונה. לחלופין, ניתן לפרוס אוסף התקנים במיקומים מרובים החופה כדי לקבוע עד כמה רמזים פרחוני נשטפו במהלך כל נתון הרטבה-אירוע. בעתיד ניסויים, rw-FE תכתיב כאשר יישומים פטריות כדאי להתחיל ולסיים מתי הם יכולים בבטחה. בנוסף, על ידי ניטור פנולוגיה שעווה התלויים עקירות (פרוטוקול סעיף 9), החשיבות של תקופת פריחה הפתוגן לביולוגיה הפך אפילו יותר ברור. מקטע זה נכללה גם להדגים את הגמישות של אלה bioassays, מתן שיטות המאפשרים השוואה side-by-side של שעוות משטח מארח המופרדות חנותם. הנתונים נוצר באמצעות טכניקות החילוץ פרחוני bioassays מייצגים מוחשי אינדיקטורים של גירוי הפתוגן, מחלקות כימי מסוים חשוב הפתוגן ביולוגיה, מטרות אסטרטגיות שליטה עתידית.

Colletotrichum fioriniae גורמת פירות הריקבון Highbush אוכמניות (Vaccinium corymbosum ל') והן את1,גדול אמריקאי חמוציות (נ' macrocarpon ואיתן)2. הפתוגן הזה היה מותווה לאחרונה acutatum ג מינים מורכבות3,4,5,6 , הוא סוכן סיבתי של אוכמניות anthracnose וחבר הריקבון פרי החמוציות מורכבות, מעורר רבים אחרים צמח מחלות ברחבי העולם7. Fioriniae ג יש רדומים, hemibiotrophic סגנון חיים8, עם זיהומים המתרחשים במהלך בלום ופיתוח סימפטום לא הופך להיות לכאורה עד הפרי נמצאים בשלבים הסופיים של התבגרות9. אוכמניות, חמוציות, פירות רוט נשלטת רק בצורה הולמת עם פטריות יישומים שנעשו במהלך תקופת פריחה. המחלה overwinters אוכמניות רדום באד פרחוני סולמות10 , sporulates במהלך בלום. Conidia מועברים במהלך החופה באמצעות גשם-splash פיזור11,12 , הצטברות inoculum יש כבר בקורלציה חריפה תקופה פריחה13. תגובתה של מינים Colletotrichum פרחים המארח אינה ייחודית Vaccinium, כמו פרחים חשובים מרכיבי פוסט הדר בלום פירות טיפה (PFD)14 , כמו גם anthracnose תות15, בשני המקרים הגורם המחלה כדי sporulate. לכל המקרים הללו מדגישות את הצורך בשיטות יעילות להעריך את הדינמיקה הטמפורלי של רמזים כימי פרחוני על fioriniae ג ו פתוגנים אחרים הפוגעים במהלך בלום. התובנות שמספקת בשיטות המתוארות כאן הופכים להיות יותר ויותר יקר יותר.
פרוטוקול זה מפרט שיטות רכש תמצית פרחים (FE) ומנחה הערכת התגובות fioriniae כ FE דרך זכוכית coverslip bioassays15,16. טכניקות החילוץ פרחוני מחולקות לשני סוגים עיקריים; עקירות על בסיס מים (פעיל-FE, פסיבי (pass -FE), ולא שדה מבוססת על מי גשמים (rw-FE)), והשאיבה17 מבוססי כלורופורם (ch-FE). הקוד שיחולץ על בסיס מים מאפשרים בדיקה של מים גייסה סימנים כימיים פרחוני. אלו רמזים גויסו הם מרכיבים חשובים עשוי בית המשפט זיהום, מאז FE מגדיל מאוד את המהירות של זיהום16, בנוסף לספק את הלחות הדרושה הזיהום להתרחש. בנוסף, הם מייצגים מצב טבעי יותר כמו גירוי פרחוני יכולים להישטף לאורך החופה במהלך הרטבה-אירועים כפי שנצפו בעבר אוכמניות,14,אחרים מערכות חיתוך16. עקירות פרחוני מבוסס כלורופורם (ch-FE) מספקים גם מידע חשוב המתייחס הפתוגן בתגובה מארח משטח waxes17,18, הבהרת בשלבים צמיחה מוקדמת של conidia פעם הנמסרים רגישים האיברים המארח (קרי פרחים, השחלות, פרי פיתוח). הפתוגן בתגובה לשינויים עונתיים שעוות משטח מארח ניתן גם לנטר שימוש בפרוטוקול זה. בהתאם לכך, bioassays מותאמים לעבודה עם או פה על בסיס מים או מבוססי כלורופורם FE כדי להמתיק את ההבדלים הטבועים בין שני החומרים האלה.
הנתונים המופקים bioassays חשף כי על בסיס מים עקירות לעורר רמות גבוהות יותר של conidiation משנית יותר מבוסס כלורופורם עקירות איפה שהיתה היענות appressorial מוחלטת, ולכן שמערבות תרכובות מרובים נוכח פה. מעניין, שניהם מהתגובות צמיחה נצפו כאשר באמצעות מי גשמים הפועלות מחוץ פרחים אוכמניות, חמוציות, המציין תרכובות מופחתים מרובים יכולים להישטף מפני השטח של פרחים. לפיכך, ניטור לגירוי פרחוני יספקו תובנה ההסתברות להצלחה פתוגן בכל מערכת חקלאית.
המטרה הסופית של פרוטוקול זה נועד לספק מתודולוגיה למידע ביצירת הבסיס הביולוגי על פתוגנים צמח פטרייתי בתגובה סימנים כימיים פרחוני, וכן ייזום מתודולוגיות יכול להשתמש במידע פרחוני זה כדי לסייע תהליכי קבלת החלטות וניהול מחלה הספציפיות-לאתר.

<table><tbody><tr><td>0.22 ומיקרו; m גודל נקבוביות, מסנן עיקור אצטט</td><td>VWR</td><td>101102-280</td><td>תמצית פרחי אוכמניות (FE) הבהרה&nbsp;</td></tr><tr><td>200-1000 ומיקרו; l פיפטה עם טיפים</td> <td>-</td><td></td> <td>ציוד, כל ייצור בטווח יהיה מספיק</td></tr><tr><td>40-200 ומיקרו; l פיפטה עם טיפים</td> <td>-</td><td></td> <td>ציוד, כל ייצור בטווח יהיה מספיק</td></tr><tr><td>5-40 ומיקרו; l פיפטה עם טיפים</td> <td>-</td><td>-</td><td>ציוד, כל ייצור בטווח יהיה מתאים</td></tr><tr><td>ריסוס צבע חד פעמית עם מתאם חיבור&nbsp;</td><td>הובלת נמל</td><td>97098</td><td>מי גשמים אוכמניות (rw-) אוסף FE</td></tr><tr><td>אוטוקלאב</td><td>אמסקו</td><td>3011</td><td>ציוד, הכנת מדיה</td></tr><tr><td>שטיח רשת בר (יריעת רשת פלסטיק)</td> <td>Winco</td><td>BL-240</td><td>פסיבי (מעבר)-אוסף FE</td></tr><tr><td>טיימר ספסל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>06-662-47</td><td>ציוד, הכנת FE</td></tr><tr><td>צינור לחץ / ואקום שחור</td><td>VWR</td><td>62994-795</td><td>רכיב מסנן ואקום</td></tr><tr><td>משפך בוכנר</td><td>Coors ארה"ב</td><td>60240</td><td>רכיב מסנן ואקום, מקבל דיסקי נייר סינון 55 מ"מ</td></tr><tr><td>מבער בונסן&nbsp; &nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>ציוד</td></tr><tr><td>סידן פחמתי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>C64-500</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>רכיב מדיה סורבאל&nbsp;</td><td>RC 5B Plus</td><td>ציוד</td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה (15 מ"ל)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-527-90</td><td>ציוד</td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה (50 מ"ל)</td><td>VWR</td><td>10025-694</td><td>ציוד, קולקציית rw-FE</td></tr><tr><td>בד גבינה (דרגה 50)</td><td>ציוד פישר סיינטיפיק</td><td>AS240</td><td>, הכנת FE</td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>VWR</td><td>JT9175-3</td><td>כימיקלים, טריכלורו-מתאן: דרגת בדיקה, &ge; 99% טהור, לביולוגיה מולקולרית,</td></tr><tr><td>אגר קמח תירס ללא חמצן (CMA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>B11132</td><td>&nbsp; מדיה מוקדמת לערבב, אחסון מבודד על שכבות</td></tr><tr><td>כתם כותנה-כחול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61335</td><td>לקטופנול כתם כותנה-כחול</td></tr><tr><td>Difco Agar</td><td>VWR</td><td>90004-032</td><td>רכיב מדיה</td></tr><tr><td>מקדחה-מכבש</td><td></td> <td>דלתא-ציוד</td><td>, קולקציית rw-FE</td></tr><tr><td>EASYpure LF מים טהורים</td><td>במיוחד Barnstead</td><td>D738</td><td>ציוד, מקור מים נטול יונים</td></tr><tr><td>אתנול (95%)</td><td>-</td><td>-</td><td>בקבוק</td></tr><tr><td>מסנן כימי (500 מ"ל)</td><td>פיירקס</td><td>מס' 5340</td><td>רכיב מסנן ואקום</td></tr><tr><td>קולט אדים</td><td>המילטון-ציוד</td><td></td><td>, שימוש בכלורופורם</td></tr><tr><td>משפך (7 X 7 ס"מ)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>60820-110</td><td>קולקציית חמוציות rw-FE, הכנת FE</td></tr><tr><td>שקופית זכוכית גנרית&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-038-101</td><td>מוליכות ביולוגית</td></tr><tr><td>בקבוק ריסוס משאבת פלסטיק גנרית</td><td>VWR</td><td>16126-454</td><td>אוסף pass-FE, קיבולת של לפחות 250 מ"ל</td></tr><tr><td>צינורות תרבית תאי זכוכית</td> <td>-</td><td></td> אחסון של כיסויי זכוכית <td>ch-FE</td></tr><tr><td>(22 x 22 מ"מ)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>12-542B</td><td>מוליכות ביולוגית</td></tr><tr><td>תאי זכוכית ואן טיהם (צינורות זכוכית חתוכים ביד)</td><td>- </td><td>-</td><td>כלורופורם (ch)-בדיקה ביולוגית FE, (8 מ"מ OD 6 מ"מ ID)</td></tr><tr><td>פיפטת זכוכית (1-100 ומיקרו; ל)</td> <td>המילטון בע"מ</td><td>#710</td><td>ch-FE bioassay</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G5516</td><td>לקטופנול כתם כותנה-כחול</td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td>Bright-Line</td><td>5971R10</td><td>ציוד</td></tr><tr><td>חומצה לקטית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>W261106</td><td>לקטופנול כותנה-כחול</td></tr><tr><td>מכסה אדים זרימה למינרי</td><td>Labconco</td><td>3730400</td><td>ציוד, סביבת עבודה סטרילית</td></tr><tr><td>בדיקה מתכתית (כללי)&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>ציוד&nbsp;</td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה (2 מ"ל)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-408-138</td><td>אחסון והכנה של תערובת טיפול מימי</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ, Leica DMLB</td><td>Leica</td><td>020-519.010</td><td>ציוד</td></tr><tr><td>טיט (קרמיקה)</td> <td>Coors USA</td><td>60313</td><td>רכיב מסנן ואקום</td></tr><tr><td>כפפות ניטריל&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>19-130-1597D</td><td>אוסף פרחים</td></tr><tr><td>דיסקי נייר (מגבות נייר חתוכות)</td><td>יסודות משרד</td><td>KCC01510</td><td>בקרת לחות בבדיקה ביולוגית</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>סרט פרפין מפלסטיק&nbsp;</td></tr><tr><td>עלי (קרמיקה)</td> <td>Coors ארה"ב</td><td>60314</td><td>רכיב מסנן ואקום</td></tr><tr><td>גבישי פנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A92-100</td> שקיות פלסטיק <td>כתנה-כחול לקטופנול</td></tr><tr><td>(~100 מ"מ X 152 מ"מ)</td> <td>Uline</td><td>S1294</td><td>ציוד, קירור פרחים</td></tr><tr><td>כלי תרבית תאי פלסטיק (קוטר 9 ס"מ)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>(צלחת פטרי), מוליכות ביולוגית מוליכות</td></tr><tr><td>פוליטטרפלואורואתילן (PTFE) מרופדים&nbsp;</td><td>VWR</td><td>60927-228</td><td>אחסון כוסות ch-FE</td></tr><tr><td>פיירקס (100 מ"ל)</td><td>פיירקס</td><td>מס' 1000</td> הכנת מחבת לחם <td>ch-FE</td></tr><tr><td>פיירקס</td> <td>-</td><td>--</td><td>אוסף pass-FE</td></tr><tr><td>צילינדר בוגר פיירקס</td> <td>-</td><td>-ציוד</td><td>, הכנת FE</td></tr><tr><td>מיכל פלסטיק אטום (30 מ"מ X 13 מ"מ X 7 מ"מ)&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>מוליכות ביולוגית</td></tr><tr><td>מספריים לניתוח מחודד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>8940</td><td>ציוד, לחיתוך בד גבינה ודיסקיות נייר</td></tr><tr><td>מסננת רשת נירוסטה</td><td>VWR</td><td>470149-756</td><td>הכנת מקדח צעד ch-FE</td></tr><tr><td>(צעד-סיביות)</td><td>Dewalt-Equipment</td><td></td><td>, אוסף rw-FE</td></tr><tr><td>לולאה סטרילית (לולאה משולבת)Fisher</td> <td>Scientific</td><td>22-363-602&nbsp;</td><td>הכנת תרבות</td></tr><tr><td>חוט טלפון (חוטים פנימיים)</td> <td>-</td><td></td> <td>אוסף אוכמניות rw-FE</td></tr><tr><td>סל מבחנה&nbsp;</td><td>VWR</td><td>470137-792</td><td>תחליף זמין לסל רשת פלסטיק [תות]&nbsp;</td></tr><tr><td>V8 Juice</td><td>Campbell's Soup</td> <td>Company-רכיב</td> <td>מדיה פטרייתי</td></tr> <tr><td></td><td>סלי רשת פלסטיק וינטג' [תות]</td> <td>תרומה-מעבר-אוסף FE, יכול להחליף לסל מבחנה (470137-792)</td><td></td></tr><tr><td>מערבולת ג'יני (מערבולת)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-812</td><td>הכנת תרחיף נבגים</td></tr><tr><td>Whatman No. 1 עיגולים איכותיים 55 מ"מ</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td>רכיב מסנן ואקום</td></tr><tr><td>קשרי טוויסט מפלסטיק לבן (100 מ"מ)</td> קולקציית <td>Uline</td><td>S-566W</td><td>Cranberry rw-FE</td></tr></tbody></table>

colletotrichum fioriniae פיתוח מים ותמציות פרחים מבוסס כלורופורם אוכמניות, חמוציות

Colletotrichum fioriniae Development in Water and Chloroform-based Blueberry and Cranberry Floral Extracts

לעקוב במדויק את פנולוגיה של תקופת פריחה ואת הדינמיקה הטמפורלי של סימנים כימיים פרחוני פטרייתי פירות רקובים פתוגנים, שיטות הפקת פרחוני ו- coverslip bioassays פותחו ניצול Colletotrichum fioriniae. אוכמניות, חמוציות, זה פתוגן נשלטת בצורה אופטימלית על ידי יישום קוטלי פטריות במהלך תקופת פריחה בגלל משחק התפקידים פרחים בשלבים הראשונים של זיהום. פרוטוקול מפורט כאן מתאר איך פרחוני תמציות (FE) התקבלו באמצעות מים, כלורופורם- ושיטות שדה מבוססת על מי גשמים לשימוש מאוחר יותר ב- bioassays coverslip זכוכית המתאימים. כל FE שימש כדי לספק ערכה שונה של מידע: התגובה של fioriniae ג כימי פרחוני גויסו רמזים במים (על בסיס מים), פתוגן התגובה פרח פרי שעוות משטח (מבוסס על כלורופורם) ושל שדה מבוסס ניטור של אספו פרחים מי גשמים, עוברים במבחנה תצפיות סביבה חקלאית. פה בהרחבה מתואר כמו גם או כלורופורם-על בסיס מים, עם bioassay המתאימה המתוארת שפיצתה ההבדלים הטבועים בין שני החומרים האלה. מי גשמים זה ברחה פרחים נאספה במכשירים ייחודי עבור כל יבול, המאזכרים הגמישות ואת יישום של גישה זו עבור מערכות חיתוך אחרות. Bioassays מהירה, זולה, פשוטה, ומספקים את היכולת להפיק ייתכן בייעודי לאתר מידע על הנוכחות של תרכובות פרחוני מופחתים ממקורות שונים. מידע זה בסופו של דבר מוטב יעדכן אסטרטגיות ניהול המחלה, כפי FE לקצר את הזמן הדרוש עבור זיהום להתרחש, ובכך לספק תובנה שינוי הסיכונים לזיהום הפתוגן במהלך עונת הצמיחה.

התוצאות המובאות כאן הן מספר דוגמאות מבחני רבים שניתן לבצע באמצעות מתודולוגיה זו. איור 1 הוא מדריך מאויר bioassay FE על בסיס מים, בתוספת איור 2 אשר מלווה את bioassay FE מבוססי כלורופורם. איור 3 מספק מדריך ויזואלי מה אפשר לצפות על ההערכה מיקרוסקופיים של fioriniae ג 24 שעות, בשניהם bioassays מים כלורופורם מבוססות (בהשוואה SDW פקדי). איור 4 פרטים ללמוד מסלול הזמן 24 שעות ביממה עם fioriniae ג בנוכחות המגוון חמוציות 'סטיבנס' ch-FE, ונותנת התייחסות חזותית תוצאה ייבוא של מחקר זה: FE ירד את הזמן הדרוש כדי מבנים הזיהום דמויי לעומת SDW. איור 5 מספק דוגמה לנתונים שנאספו bioassay coverslip באמצעות מי גשמים פרחוני חמוציות נגר (CB "פרח" rw-FE). איור 6 מייצגת תוצאה חשובה נוספת: שחלה פרחוני ch-FE היה מופחתים הרבה יותר מאשר פרי ch-FE, ומציין את החשיבות של בלום במחזור החיים של fioriniae ג. משלימה תמונות וסרטים מספקים רכיבים חזותיים חשובים של הפרחים לשימוש עקירות התקנים אוסף מי גשמים פרחוני/פריסה, בנוסף סרטים להמחיש את (מיצוי פעיל - וגם פסיבי- תהליכים מבוססי-מים).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig1.jpg"> איור 1 : סקירה כללית של מבוסס מים פרחוני לחלץ bioassay (FE). Assay הזה היה מנוצל על בסיס מים תמציות פרחים עם פרחים הן אוכמניות, חמוציות: פעיל -פרחוני תמציות (פעיל-FE), פסיבית -פרחוני תמציות (עוברים-FE) פרחוני מי גשמים ונגר (rw-FE). FE-החלק בדרך כלל מהווה הגורם ניסויית/משתנה. לעומת זאת-FE החלק יכול להישאר קבוע, ניתן להעריך זמן נקודות/שעות לאחר חיסון. העדפה הפך לקראת ניתוח שדה 4-200 X הגדלה. קיצורים: מים יונים סטרילי, SDW; שטח, שדה ראייה, א <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig2.jpg"> איור 2 : סקירה כללית של מבוססי כלורופורם פרחוני לחלץ bioassay (ch-FE). Assay הזה היה מנוצל עבור נוחות אוכמניות וחמוציות (פרחים, השחלות ופירות). רק סוג אחד של תערובת מימית הטיפול היה בשימוש זה וזמינותו, ההשעיה נבג חלק 1 ל 2 חלקים SDW (כדי לשמור על ריכוז conidial עקביות בשל התאיידות ch-FE). Assay זה יכול לשמש כדי להשוות מרובים ch-FE (שעוות של משטחי המפעל השונים), או מרובות זמן נקודות/שעות לאחר חיסון באמצעות ch-פה אחד. קיצורים: מים יונים סטרילי, SDW; ואן Tieghem [זכוכית] תאים, רועים גרמני. תא. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig3.jpg"> איור 3 : השוואה חזותית של Colletotrichum fioriniae בנוכחות בסיס מים FE ו- ch-FE- ב זה אוכמניות assay 'Bluecrop' (פעיל-FE, על בסיס מים) (בידוד פטרייתי: BB #10) וחמוציות 'סטיבנס' מבוססי כלורופורם (ch-FE) (בידוד פטרייתי: CB-PMAP182) תמציות פרחים, לעומת SDW פקדים. עלייה דרמטית משני conidiation (טבעות) ויצירת appressorium (חץ) נצפו בעת השוואת conidia בנוכחות SDW (בקרה) (א) ל פעיל-FE (B) -חיסון לאחר 24 שעות. עם זאת, conidiation משני ניכרה לא כמו בהשוואת כלורופורם bioassay SDW לפקד (ג) ch-FE (ד); במקום זאת, fioriniae ג הצמיחה נעה לעבר היווצרות appressorial. הראו תגובה שכיחה כל סוג הוצאה, על בסיס מים, מבוססי כלורופורם, ללא קשר מינים מארח/פרחוני המתואר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig4.jpg"> איור 4 : הזמן-קורס לימוד (24 שעות) עם Colletotrichum fioriniae בנוכחות ch-FE- ב assay הזה, SDW שליטה (A-D) ו- "סטיבנס" חמוציות ch-FE (E-F) נבדקו באופן חזותי ב- 0, 6, 12 ו- 24 שעות לאחר חיסון (דוגמה של נקודות זמן משתנה השוואת FE מרובים). היווצרות Appressorium (חץ) החל ב- 6 ש ח בחודש ch-FE, גדל בהתמדה לאורך זמן עוקבות נקודות. התוצאה חומקת אל גורם חשוב בביולוגיה הפתוגן במהלך תקופת פריחה: פרחים לצמצם את הזמן הדרוש כדי מבנים הזיהום דמויי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig5.jpg"> איור 5 : תצוגה גרפית של הנתונים שנאספו באמצעות rw-FE bioassay. מי גשמים לברוח ממני חמוציות פרחים (CB "פרח" rw-FE) ותתכבד בתולה אשר לא נגעו בכל רקמות הצמח חמוציות ("בשטח" FE-rw) מן הרטבה-אירוע אחד בתוספת של תקן פעיל, חמוציות על בסיס מים פרחוני תמצית (CB פעיל -FE) (בקרה חיובית) SDW (בקרה שלילית) היו לאמירה של bioassay coverslip על בסיס מים, הערכה לצמיחה fioriniae ג . CB "פרח" rw-FE היו באותה הרמה של משני צורה conidiation ו- appressorium כמו תקן CB פעיל-FE-24 שעות לאחר חיסון, המציין כי המכשירים אוסף היו יעילים בלכידת ממריצים פרחוני שפורסמו במהלך הרטבה-אירוע. Conidia סה כ מורכבת ראשי (הפקיד), conidia ו conidia משני שהוקם. אותיות מצביעים על הבדלים משמעותיים ב- p &lt; 0.05 לפי הבדל משמעותי לפחות של פישר מבחן (LSD); אותיות רישיות, סה כ conidia; קטנות, appressoria. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig6.jpg"> איור 6 : פנולוגיה חמוציות המבוסס על ch-FE bioassay, בדיקה ויזואלית. ניהול המחלה פירות רקובים פטריות לעתים קרובות כרוך בלום זמן פטריות יישומים. כאן, חמוציות מבוססי כלורופורם תמציות (ch-FE) בשלבים רבים הצמיחה של חמוציות ('סטיבנס') הוערכו באופן חזותי עבור האפקט של שעוות משטח על fioriniae ג -חיסון לאחר 24 שעות. השחלות שנאספו בחודש יוני (א), פרי לא בוגר שנאספו בחודשים יולי ואוגוסט (B, C), פירות שנקטפו שנאספו באוקטובר (ד)ופקד SDW (E) נבדקו על היווצרות appressorial (חץ). השחלה ch-FE היו בסדר הגודל הגדול ביותר של היווצרות appressorial, המציינת כי זה צמח פנולוגיה (בלום) חשובה ביותר מחזור החיים של fioriniae ג. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig1.jpg"> משלימה איור 1: תפרחת אוכמניות. פרחים אוכמניות נאספו על עקירות במהלך פריחתה (אפריל-מאי בניו ג'רזי, ארה ב) (מוצג 'Bluecrop'). שימו לב את החפיפה של corollas/שחלות מפרחים סמוכים, הארכיטקטורה הכוללת של התפרחת לעומת משלימה איור 2 (חמוציות זקופה). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig2.jpg"> משלימה איור 2: זקוף חמוציות. פרחים חמוציות נאספו על עקירות במהלך פריחתה (יוני-יולי בניו ג'רזי, ארה ב) (מוצג "סטיבנס"). הערה את פרח מגוון דרגות על תפרחת חמוציות יחיד (אנכי), ולא את מכור, מים droplet שמירה על צורת corolla. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Supplemental Figure 3" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig3.jpg"> משלימה איור 3: אוכמניות מי גשמים פריסה (פרח). להשלים אוכמניות מי גשמים פרחוני אוסף התקן, ישירות תחת אשכול של התפרחות. שימו לב חוט מצופה פלסטיק נהגה אנכית אוריינט המכשיר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Supplemental Figure 4" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig4.jpg"> משלימה באיור 4: אוכמניות מי גשמים פריסה (גזע). אוכמניות שהושלמו מי גשמים פרחוני אוסף התקן, מניחים מחצית הדרך הגבעול בין תפרחת של הכתר של בוש. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Supplemental Figure 5" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig5.jpg"> משלימה איור 5: אוכמניות מי גשמים פריסה (כתר). להשלים אוכמניות מי גשמים פרחוני אוסף התקן, ממוקם בבסיס של בוש (כתר). ניתן להסיר הערה חוטים מצופה פלסטיק אם לא הכרחי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Supplemental Figure 6" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig6.jpg"> משלימה איור 6: אוכמניות מי גשמים פריסה (הקרקע). להשלים המכשיר אוסף מי גשמים בתולה, להציב סמוך שיחי האוכמניות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Supplemental Figure 7" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig7.jpg"> משלימה איור 7: מי גשמים חמוציות פריסה (תקריב). הושלמה התקן איסוף מי גשמים פרחוני חמוציות, עם שלד שתי מקופלות מתחת הקשרים כבל מוצלב בצורה מסודרת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Supplemental Figure 8" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig8.jpg"> משלימה איור 8: מי גשמים חמוציות הפריסה. מרובה להשלים מי גשמים פרחוני חמוציות התקנים לפרוס בביצה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Supplemental Movie 1" src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie1.jpg"> משלימה סרט 1: תמציות פרחים פעיל, על בסיס מים (פעיל -FE). תמיכת וידאו משלימה ביצוע השלבים 2.3-2.5.1. אוכמניות 'Bluecrop' פרחים שימשו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/active-FEextraction.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)</a>
<img alt="Supplemental Movie 2" src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie2.jpg"> משלימה את הסרט 2: פסיבי, תמציות פרחים על בסיס מים (עוברים-FE). תמיכת וידאו משלימה בעקבות צעדים 3.3-3.4. אוכמניות 'Bluecrop' פרחים שימשו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/pass-FEextraction.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)</a>
<img alt="Supplemental Movie 3" src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie3.jpg"> משלימה הסרט 3: פריסה של התקנים איסוף מי גשמים פרחוני חמוציות. תמיכת וידאו משלימה בעקבות צעד 6.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/rw-FEdeployment.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)</a>

. הנה, מתוארים bioassays שנועד לעקוב אחר ההתפתחות של חיידקים פטריות, Colletotrichum fioriniae, בנוכחות תמציות פרחים עם אוכמניות או חמוציות על coverslips זכוכית דקה. מים, כלורופורם- ו שדה מי גשמים - מבוסס פרחוני מיצוי טכניקות מפורטים כמו גם תובנה איך המידע הזה יכול להיות מיושם.

Colletotrichum fioriniae פיתוח מים ותמציות פרחים מבוסס כלורופורם אוכמניות, חמוציות

To accurately monitor the phenology of the bloom period and the temporal dynamics of floral chemical cues on fungal fruit rotting pathogens, floral ...

פרוטוקול זה מספק מערכת זולה ומסתגלת כדי להעריך את הדינמיקה הזמנית של רמזים פלואורוכימיים על פיורניה Colletotrichum ופתוגנים צמחיים אחרים המדביקים פריחה מונחית. התקני איסוף מי גשמים רצפה חדשניים מאפשרים למשתמש לנטר ממריצים טבעיים ותנאים המשפיעים על התפתחות פתוגן באופן כמעט בזמן אמת באתר ספציפי. התחל הליך זה עם תרבות של Fiorniae Colletotrichum ממארח נגוע באופן טבעי כמתואר בפרוטוקול הטקסט.כאשר מושבות מתחילות להתיז, פס conidia על עוד V 8 מיץ אגר המכיל צלחת תרבות התא לייצר תרבות sporulating בצפיפות גבוהה. לאחר שבעה ימים של צמיחה, השתמש בלולאה סטרילית סטנדרטית כדי לאסוף כמות קטנה של קונדיציה מתרבות הצפיפות הגבוהה על ידי נגיעה קלה בלולאה למסה הקונידיאלית. מערבבים את זה לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של מים סטריליים deionized.וורטקס מדגם זה במשך 10 שניות. באמצעות פיפטה סטנדרטית, לצלול למעלה ולמטה פעמים רבות כדי לערבב עוד יותר את המדגם. לאחר מכן מניחים טיפה של דגימת המערבולת על ההמוציטומטר ומהערכה את ריכוזי הנבגים.כוונן את הריכוז ל-0.1 מיליון קונדיה למיליליטר של מים מזוקקים סטריליים עם נפח סופי של חמישה מיליליטר. זה נקרא השעיית נבג והוא נעשה רק מיד לפני השימוש בכל bioassay. כדי לבצע מיצוי פרחוני על בסיס כלורופורם, נקה את כל הרכיבים עם 95% אתנול פעמיים.לאחר מכן לנקות את הרכיבים פעמיים עם כלורופורם כדי למנוע זיהום עבור כל מיצוי. אין לנקות את הכובעים מצופים PTFE עם כלורופורם כפי שהוא יפגע בהם. לאחר הניקוי, מניחים את הרכיבים בצד להתייבש במהופך.לשלב חלק אחד פרחים מעובדים לתשעה חלקים כלורופורם ב beaker על ידי הוספת פרחים ולאחר מכן כלורופורם. בעדינות מערבולת במשך 30 שניות ומתח דרך מסך נירוסטה לתוך המק השני. יוצקים את התמצית המבוססת על כלורופורם מהקוקר השני לתוך צינור תרבות הזכוכית ומדביקים את מכסה PTFE.עוטפים את המכסה בפרפילם כדי למנוע אידוי. אחסן את תמצית הפרחים המבוססת על כלורופורם שנוצרת בחושך כדי להפחית את השפלת האור בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש ניסיוני. חזור על עקירות עם דגימות מרובות כדי לספק שכפולים.כדי ליצור התקן איסוף עבור כל מיקום שנבחר, השתמש במתג המחובר ללחיצה על מקדחה כדי לקדוח חור בתחתית ספריי. ואז לחתוך קו ישר מהחלק העליון של החור אל הפה של ספריי. עכשיו לקדוח ארבעה חורים שיווי משקל גדול מספיק כדי להשחיל את חוט מצופה פלסטיק בפה של ספריי.חבר קצה אחד של חוטי הפלסטיק המהותרים קצה אחד חופשי. לקדוח חור גדול מספיק כדי להשחיל את תרסיס צבע או מתאם לתוך מכסה כובע צנטריפוגה 50 מיליליטר. לאטום את הליכי המשנה של המתאם עם parafilm כדי למנוע דליפה.צרף את זה הן את כובע הצנטריפוגה ואת החלק מושחל של מרסס. ואז לחבר את צינור צנטריפוגה 50 מילימטר. צור ארבעה התקני איסוף לכל מיקום דגימה.פרוס מכשירים במקומות נבחרים על ידי כיפוף כוסות מרסס כך שיתאימו לגבעולים. כוון את הצד החתך של המרסס כלפי מעלה באמצעות חוטי הפלסטיק הצבועים המחוברים לגזעולים אחרים. זה מבטיח מים חולפים על הפרחים נתפס.כדי לאסוף מי גשמים מפרחי חמוציות, תחילה לנקב חום שמונה חורים שונים סביב הפה של המשפך באמצעות בדיקה מתכת. הכנס קשרים טוויסט לארבעה חורים. חבר את הקצוות האחרים למיקום הנגדי של החור הזה ויוצר תבנית חצייה מסודרת.עוטפים את המשפך בקיטור בפרפילם ומניחים בצד. לקדוח חור גדול מספיק כדי להכניס את המשפך במורד הגבעול לתוך כובע צנטריפוגה 50 מיליליטר עם קצת צעד. הכנס את המשפך המוכן לתוך מכסה הצנטריפוגה.לאחר גשמים או השקיה תקורה, להסיר ולהחליף את החלק התחתון של הצינור צנטריפוגה. צינורות איסוף מי גשמים יש לשנות במהירות לאחר הרטבת אירועים כפי שהם נוטים השפלה מזהמים טבעיים מגויסים נגר כגון חיידקים ופטריות אחרות. מניחים שתי שכבות של דיסקי נייר בתוך מנות תרבות להשרות עם שני מיליליטר של מים מזוקקים סטריליים.לאחר מכן, מערבבים כמויות שוות של מים מזוקקים סטריליים ותמצית פרחונית על בסיס מים בשני צינורות מיקרוצנטריפוגה מיליליטר. לאחר מכן להוסיף נפח שווה של ההשעיה נבג מוכן שני צינורות מיקרוצנטריפוגה מיליליטר. ההכנה המתקבלת נקראת תערובת טיפול מיקווי.לשליטה, להשמיט את חלק תמצית הפרחים ולהחליף עם מים מזוקקים סטריליים כדי לשמור על ריכוזים conidial עקבי. עכשיו מניחים כיסויי זכוכית מנוקים מראש על גבי מגבות נייר ספוג בתוך צלחת תרבות התא. מניחים טיפה 40 microliter של תערובת טיפול מים על מרכז כיסוי.חזור על זה לטיפולים הרצויים כולל הפקד. ואז לסגור את צלחת תרבות התא. לאחר שכל הטיפולים והשכפולים חולקו, מניחים את כל הכלים המשוכפלים של תרבות התאים במיכל פלסטיק אטום ומטמיקים ב-25 מעלות צלזיוס בחושך.בנקודות זמן שנקבעו מראש, להוסיף 10 microliters של fixative טיפות לעצור את הצמיחה ושמירה למחצה על ההר. לאחר תיקון נוסף, בזהירות להפוך את coverslips הצבת כל אחד מהם טיפה בצד למטה על שקופית מיקרוסקופ זכוכית כדי להקל על בדיקה מיקרוסקופית. כאשר כל הכיסויים נמצאים על מגלשות מיקרוסקופ זכוכית, להשאיר אותם להתיישב יבש חלקית מכסה המנוע זרימה במשך 20 דקות.לספור את כל conidia נוכח על coverslip כולל conidia העיקרי, conidia נבט, ו conidia המשני שזה עתה נוצר, כמו גם אספרסיה. עבודה בהגדלה פי 400 או פי 200 בהיקף של 3.808 מילימטרים רבועים. במכסה המנוע של זרימה למינארית, הוסיפו שני כמויות שוות של מים מזוקקים סטריליים ונפח אחד של השעיית נבג לצינור מיקרוצנטריפוגה שני מיליליטר.הניחו את תערובת הטיפול המים הזו בצד לביואסאיס של תמצית פרחים המבוססת על כלורופורם. במכסה המנוע של האדים, מניחים תא ואן T על מכסה זכוכית בתוך צלחת תרבות תאי הפלסטיק המוכנה. מחלקים 33 מיקרוליטרים של תמצית פרחונית מבוססת כלורופורם רצויה למרכז התא ומאפשרים להתייבש.אל תיגע בקירות התא. לטיפול הבקרה, להוסיף כלורופורם בתולה. לאחר שהתמצית הפרחונית המבוססת על כלורופורם התייבשה, מחלקים 99 מיקרוליטרים של תערובת הטיפול המים המוכנה עם פיפטה סטנדרטית למרכז תא ואן טי.לאחר מכן סגור את כל מנות תרבות התאים ודגירה. בנקודות זמן שנקבעו מראש, להוסיף 15 microliters של תיקון לתא ואן T ולתת לו לשבת לפחות חמש דקות כדי להבטיח כתמים פטרייתיים נאותים. לאחר מכן, הסר בזהירות את תא ואן טי.בצע שלבים של היפוך נקודת כריכה ורכישת נתונים כבעבר. לאחר הערכה מיקרוסקופית של C.fiorniae ב 24 שעות לאחר חיסון, השוואה של conidia בנוכחות מים מזוקקים סטריליים לעומת תמצית פרחונית על בסיס מים מגלה עלייה דרמטית קונידיציה משנית היווצרות אפרסוריום. עם זאת, קונידיציה משנית לא היה ברור כמו בעת השוואת בקרת מים מזוקקים כלורופורם bioassay לתמציות מבוססות כלורופורם.במקום זאת, הצמיחה C.fiorniae עברה לכיוון היווצרות appressorial. בבדיקה זו, בקרת מים מזוקקת סטרילית ועקירות פרחוניות מבוססות חמוציות על בסיס כלורופורם נבדקו ויזואלית באפס, שש, 12 ו-24 שעות לאחר החיסון. היווצרות אפפרסוריום החלה בשש שעות בתמצית הפרחים המבוססת על כלורופורם וגדלה בהתמדה לאורך נקודות הזמן הבאות.תוצאה זו תומכת בממצא כי פרחים להפחית את הזמן הדרוש כדי ליצור מבני זיהום. ניהול מחלות עבור פטריות נרקבות פירות לעתים קרובות כרוך יישומים קוטל פטריות זמן פריחה. כאן, חמוציות כלורופורם מבוסס תמציות מתוך שלבי צמיחה מרובים של חמוציות הוערכו חזותית עבור שעווה משטח יעיל על C.fiorniae ב 24 שעות לאחר חיסון.השחלות נאספו בחודש יוני, פירות לא בוגרים שנאספו בחודש יולי, וב אוגוסט, פירות שנקטפו שנאספו באוקטובר, ושליטה במים מזוקקים סטריליים נבדקו להיווצרות appressorial. תמציות מבוססות כלורופורם השחלות היו בעוצמה הגדולה ביותר של היווצרות appressorial המציין את החשיבות של פריחה מחזור החיים של C.fiorniae. הפתוגן הוא המרכיב החשוב ביותר בפרוטוקול זה.פטריות יש להעביר מדיה טריים באופן שגרתי כדי לשמור על עקביות בין ניסויים. כל עבודה עם כלורופורם חייבת להתבצע במכסה המנוע של האדים מטעמי בטיחות. זה כולל הכנת חומרים וכלי זכוכית, הליכי מיצוי, ו מוליכות של bioassay מבוסס כלורופורם.שילובים של נקודות זמן, פתוגנים, אוספי מי גשמים פרחוניים, או עקירות מארח יכול להיות מנוצל כדי להעריך אינטראקציות מארח-פתוגן שונים. מכשירי איסוף מי הגשמים והביואסות הנלוות להם יאפשרו לאחרים לעבוד עם ממריצים מארחים מגויסים במהלך אירועי גשם במערכות נתיבים רבות.

colletotrichum-fioriniae-development-water-chloroform-based-blueberry

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

שיטה שכיבות למשוך לאיסוף נדיפים צמח מתואר. השיטה מאפשרת השוואה של נדיפים המושרה על ידי האכלה אוכלי עשב, jasmonate מתיל אקסוגניים, ונזק מכני. טכניקה זו משמשת גם כדי לחקור את התגובה נדיפים ענפים ניזוק חשיפה נדיפים מענפי אוכלי עשב שניזוק בתוך צמחים אוכמניות.

אוכלי עשב הנגרמת נדיפים אוכמניות צמח תוך איתות

שיטות מתוארות להפרדת chromatographic בשכבה דקה (TLC) של תמציות צמחים וbioautography קשר לזהות מטבוליטים אנטי בקטריאליים. השיטות מיושמות להקרנה של תרכובות פנוליות תלתן אדומים עיכוב חיידקים מייצרי אמוניה היפר (HAB) יליד המסס השור.

בשכבה דקה כרומטוגרפי (TLC) הפרדות וbioassays של תמציות צמחים כדי לזהות תרכובות Antimicrobial

אנו מציגים כאן פרוטוקול לבנייה ואימות מודלים לחיזוי לא הרסני של סך הסוכר, סך החומצה האורגנית ותכולת האנתוציאנין הכוללת באוכמניות בודדות על ידי ספקטרוסקופיה קרובה לאינפרא אדום.

בניית מודלים לחיזוי הורס של תוכן מרכיב האוכמניות ידי ספקטרוסקופיה האינפרה-אדום הקרוב בהתבסס על מדידות HPLC

עבודה זו מפרטת שיטה שלב אחר שלב להכנת תמציות פוליפנול עשיר מאבקת יער מיובש בהקפאה. בנוסף, הוא מספק תיאור יסודי של איך להשתמש אלה poliphenol עשיר תמציות בתרבית תאים בנוכחות של הפפטיד הורמון אנגיוטנסין II (Ang II) באמצעות כלי דם וסקולרים חלקות (VSMCs).

מיצוי וטיהור של פוליפנולים מאבקת ברי מיובשים בהקפאה לטיפול בתאי שריר חלקים וסקולריים<em&gt; במבחנה</em

פלטפורמת מיקרו-פרוצדורה-גז-כרומטוגרפיה של מרחב ראש-פאזה מוצקה מתוארת כאן לזיהוי וכימות מהירים, אמינים ואוטומטיים למחצה של נדיפים בפירות דומדמניות שחורות בשלים. טכניקה זו יכולה לשמש כדי להגדיל את הידע על ארומה פירות ולבחור cultivars עם טעם משופר לצורך הרבייה.

יצירת פרופילים של תרכובות נדיפות בפרי דומדמניות שחורות באמצעות מיקרו-קסטרה של שלב מוצק Headspace בשילוב ספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה-מסה

כאן, מתוארת שיטה להפיכת רקמות הצמח לשקופות תוך שמירה על יציבות חלבונים פלואורסצנטיים. טכניקה זו מאפשרת הדמיה עמוקה של רקמות צמחים מנוקות ללא חתך פיזי.

ניקוי אופטי של רקמות צמחים להדמיית פלואורסצנטיות

המאמר הנוכחי נועד לספק פרוטוקולים מפורטים ונאותים לבידוד פטריות אנדופיטיות הקשורות לצמחים, שימור ארוך טווח של מבודדים, אפיון מורפולוגי ומיצוי DNA כולל לצורך זיהוי מולקולרי וניתוחים מטאגנומיים לאחר מכן.

בידוד, אפיון ומיצוי DNA כולל לזיהוי פטריות אנדופיטיות בצמחים מיקוהטרוטרופיים

פרוטוקול זה מפרט את השימוש בשיטת מיצוי מבוססת פוליאול בסיוע מיקרוגל למיצוי תרכובות פנוליות ונוגדי חמצון טבעיים, המייצגת גישה מעשית ובת קיימא מבחינה סביבתית לפיתוח תמציות מוכנות לשימוש.

מיצוי בסיוע מיקרוגל של תרכובות פנוליות ונוגדי חמצון ליישומים קוסמטיים באמצעות טכנולוגיה מבוססת פוליאול

הוקם פרוטוקול בדיקה ביולוגית של עלים מנותקים לגידול המוני של תריפס צ'ילי בשיטת עלים מנותקים שונה במיכלי זכוכית המכילים אגר, מה שמבטיח הישרדות גבוהה והתפתחות מסונכרנת. מערכת זו מאפשרת סינון יעיל של אלימות פטריות אנטומופתוגניות כנגד זחלי כוכב 2 ומספקת אספקת תריפס אמינה להערכות מעבדה, חממה ושדה.

הקמת מערכת גידול תריפס צ'ילי (Scirtothrips dorsalis Hood) לבדיקת אלימות של פטריות אנטומופתוגניות

פרוטוקול זה מתאר גישה בעלת תפוקה גבוהה להערכת דליפת יוני צמחים, פעילות פרוקסידאז וייצור קלוז באותה דגימה.

הערכת תגובות עלים למטבוליטים משניים מיקרוביאליים באמצעות פורמט בעל תפוקה גבוהה

למדו את פרוטוקול הביואסהי להערכת דינמיקת הפיתוח של Colletotrichum fioriniae באמצעות תמציות פרחים מכלורופורם ומים. השיטה מאפשרת מעקב בזמן אמת אחרי גירויים טבעיים המשפיעים על פתוגנים צמחיים.

Colletotrichum fioriniae פיתוח מים ותמציות פרחים מבוסס כלורופורם אוכמניות, חמוציות

גלה סרטונים נוספים