Name: תפוקה גבוהה התווית על-ידי Nitrobenzoxadiazole כולסטרול בזרימת Assay (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: למד שיטה לבדיקת יציאת כולסטרול בתאי מקרופאג' באמצעות NBD-cholesterol בלוחות 96-באר. השיטה מאפשרת סקרינג בקצב גבוה להערכת סיכון קרדיווסקולרי בבטיחות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו היא נתמכה חלקית על ידי המחקר מעניקה FIS (PS12/00866) מ אינסטיטוטו דה סאלוד קרלוס השלישי, מדריד, ספרד; Fondo Europeo פארא el Desarrollo אזוריים (פדר); אדום de Investigación en סידה (RIS), ISCIII-RETIC (RD16 0025 0002) ותוכנית סרקא / Generalitat דה קטלוניה. המחברים תודה את Retrovirology ואת המעבדה Immunopathology ויראלי של d'Investigacions אינסטיטוט Biomèdiques אוגוסט Pi I Sunyer (IDIBAPS). אנו מודים Escribà ט Rovira ג, ג הורטדו סיוע, Cufí ס מ הידע ואת טכנולוגיית העברת המשרד להדרכה שלה בהגנה על ההמצאה.

במחקר זה, אישור ועדה אתית (Comitè Ètic d'Investigació קליניקה, חולים במרפאה, ברצלונה; מספר אישור HCB/2014/0756), הודיע בכתב הסכמת כל הנושאים התקבלו.
1. כולסטרול להארכה הכנה
<ol><li>להמיס את להארכה הכולסטרול (MW 494.63; ראה טבלה של חומרים) אתנול טהור כדי להשיג את המניה (2 מ מ). בשביל בקבוקון 10 מ ג, לפזר את תוכן כל בקבוקון באמצעי אחסון 10.1 מ"ל אתנול לרכוש מניה 2 מ מ.</li>
	<li>לדלל את להארכה-כולסטרול מן המלאי ב- 1640 RPMI בתוספת 10% עוברית שור סרום ו-5% פניצילין/סטרפטומיצין (R10 בינוני) כדי להגיע ריכוז סופי של 5 μM (למשל, לקבל 10 מ של כולסטרול להארכה ב 5 הריכוז הסופי μM) על ידי דילול μL 25 מניות להארכה-כולסטרול (2 מ מ) R10 בינוני. אמצעי אחסון זה מספיקה בשביל צלחת 96-ובכן.</li>
</ol>2. התא תרבות, זריעה (יום 2)
<ol><li>התרבות התאים THP-1 R10 בינוני ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. התאם ל 0.3 x 106 תאים/מ ל כל 3 ימים.</li>
	<li>הזרע התאים צלחת 96-ובכן לבן עם חלק תחתון שטוח, ברור ב- 0.2 x 106 תאים/היטב במדיום R10 (100 μL לכל טוב).</li>
	<li>לטיפול תאי עם לענייני חוץ phorbol ננומטר 100, פעילים-12 13-אצטט (PMA מ מניה 10 μM) עבור 48-72 שעות, המקננת ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 להבדיל THP-1 תאים לתוך dmTHP-1. הערה: מומלץ להשתמש μL 5 מניות PMA (10 μM) בμl 500 R10 בינוני. לפני כן, להכין μM 10 מניות ובחום על ידי המסת בקבוקון lyophilized 1 g ב- 10 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), aliquot, ואת המניה ב-20 ° C.</li>
	<li>לחילופין (הצעה) לשלב פעולות 2.2 ו- 2.3 עבור המגון טוב יותר. להכין 10 מ ל THP-1 תאים בשפופרת 15 מ"ל, להוסיף μL 200 מניות PMA (10 μM), מערבבים בעדינות, מיד זרע μL 100 לכל טוב לצלחת. דגירה התאים כפי שמתואר בשלב 2.3.</li>
</ol>3. אפוליפופרוטאין B דלה הכנה סרום (ABDS) (יום 2 או 3)
<ol><li>כדי להכין פתרון פוליאתילן גליקול (PEG), לדלל גליצין ב- PBS 10% (עם H סטרילי2O) כדי ריכוז של 200 מ"מ ב- pH 7.4. 40 מ ל-200 מ מ גליצין להוסיף 10 גרם של פג 8000 להשיג פג 20% (w/v). מערבבים את הפתרון נמרצות כדי homogenize.</li>
	<li>החל 4 חלקים של 20% יתד לכל 10 חלקים סרום/פלזמה על כל מדגם סרום/פלזמה צינור 1.5 מ ל ולהשאיר את התערובת על קרח במשך 25 דקות17 (לדוגמה, עבור 100 μL של פלזמה או סרום, להוסיף 40 μL של 20% יתד פתרון).</li>
	<li>Centrifuge את התמיסה פג-אפוליפופרוטאין B ב 13,000 x g למשך 15 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>למחוק את התמיסה. להעביר את תגובת שיקוע צינור חדש. הערה: אנו ממליצים להכין את ABDS ביום השלישי (טרי). אם זה לא אפשרי, להכין את ABDS ביום 2 ולשמור אותו ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
</ol>4. להארכה-כולסטרול תא טעינה (יום 2)
<ol><li>ביטול המדיום תרבות של ה-dmTHP-1 ולשטוף את התאים פעמיים עם 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).</li>
	<li>לטעון את התאים עם 5 μM להארכה-כולסטרול (100 μL לכל טוב) במדיום R10 דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.</li>
</ol>5. דגירה עם כולסטרול Acceptors (יום 3)
<ol><li>ביטול המדיום ולשטוף את התאים פעמיים עם PBS.</li>
	<li>דגירה התאים עם 2 – 5% ABDS או הריכוז הרצויה של מקבל השומנים מטוהרים (HDL, ApoA, ספקיות, וכו ') מעורבבת עם RPMI 1640 השקופה בינונית (100 μL לכל טוב) עבור 4-6 h ב- 37 מעלות צלזיוס. הערה: כוללות פקד שלילי (נולד ב- C) המורכב השקופה RPMI 1640 בינונית ללא acceptors ופקד חיובי (C +) (למשל, ABDS מתוך מאגר של תורמים בריאים) או מטוהרים HDLs. שים לב כי הפקד חיובי חל במיוחד כאשר המטופל דגימות (תנאי המחלה) הם ניתחו (משלים איור 1).</li>
	<li>להכין מלאי 200 מ של הפתרון פירוק התא 1 (50 מ מ טריס מאגר, 150 מ מ NaCl, H2O). מערבבים את היחס פתרון 1-1:1 (v: v) פירוק התא עם אתנול טהור כדי לקבל את הפתרון פירוק 2.</li>
</ol>6. ניאון האות ללכוד (יום 3)
<ol><li>
זיהוי להארכה-כולסטרול מדיה
	<ol>
<li>הסר המדיום תא הלוחות ולאסוף אותו בצלחת 96-ובכן לבן חדש עם התחתון שטוח אטום.</li>
		<li>לצורך זיהוי האות זריחה אופטימלית הדגימות מדיה, להוסיף 100 μL של כוהל טהור 100 μL של כל מדגם בינוני כדי לקבל יחס של 1:1 בצלחת לבנה 96-ובכן.</li>
		<li>לשמור לצלחת עם התקשורת שטופלו נוספים מודדים עוצמת קרינה פלואורסצנטית (FI) אורך גל nm (עירור/פליטה) 463⁄536 ב luminometer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
זיהוי להארכה-כולסטרול תאיים
	<ol>
<li>לשטוף את התאים פעמיים עם PBS.</li>
		<li>כדי להשיג את כולסטרול intracellular, lyse התאים על ידי המקננת בהם עם μL 100 של פירוק פתרון 2 לכל טוב ומנערים את הצלחת בטמפרטורת החדר (RT) במשך 25 דקות.</li>
		<li>עבור זיהוי האות זריחה אופטימלית הדגימות lysate תא, ללכוד את עוצמת קרינה פלואורסצנטית lysates תא באותו לבן 96-ובכן צלחת עם תחתית ברורה במול (באותה צלחת שבה התאים היו נזרע בשלב 2.2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>6.3 למדוד את עוצמת קרינה פלואורסצנטית (FI) ב- luminometer תוך התאמת הפרמטר רגישות ל- 50 בתוכנה (ראה טבלה של חומרים).</li>
</ol>7. תוצאות ניתוח
<ol><li>אקספרס בזרימת כולסטרול קצב דגימה כאחוז מחושבת באמצעות הנוסחה: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58891/58891eq1.jpg">
</li>
	<li>השג המדד הסופי של כולסטרול בזרימת (CE) על-ידי חיסור של CE של הפקד שלילי (דוגמה עמוסה להארכה-כולסטרול אבל מודגרות השקופה RPMI 1640 בינונית, ללא כולסטרול acceptors) CE של נתן דוגמאות: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58891/58891eq2.jpg">
</li>
</ol>

<ol><li>The top 10 causes of death. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death">http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death</a> (2018).</li>
<li>Hansson, G. K., Hermansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+system+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The immune system in atherosclerosis.</a> Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).</li>
<li>Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+challenges+in+translating+the+biology+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis.</a> Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).</li>
<li>Ilhan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis+and+the+role+of+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Clinical+Cases%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis and the role of immune cells.</a> World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345(2015).</li>
<li>Greaves, D. R., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity%2C+atherosclerosis+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease.</a> Trends Immunol. 22, (2001).</li>
<li>Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+and+its+related+cholesterol+efflux+as+a+HDL+function+index+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis.</a> Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).</li>
<li>Escolà-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+macrophage-specific+RCT+and+antioxidant+and+antiinflammatory+HDL+activity+measurements%3A+New+tools+for+predicting+HDL+atheroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection.</a> Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).</li>
<li>Santos-Gallego, C. G., Ibanez, B., Badimon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL-cholesterol%3A+Is+it+really+good%3F+Differences+between+apoA-I+and+HDL%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">HDL-cholesterol: Is it really good? Differences between apoA-I and HDL.</a> Biochemical Pharmacology. 76 (4), 443-452 (2008).</li>
<li>Rothblat, G. H., Phillips, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+lipoprotein+heterogeneity+and+function+in+reverse+cholesterol+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Lipidology%22%5BJournal%5D)">High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport.</a> Current Opinion in Lipidology. 21 (3), 229-238 (2010).</li>
<li>Hafiane, A., Genest, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL-mediated+cellular+cholesterol+efflux+assay+method%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+and+Laboratory+Science%22%5BJournal%5D)">HDL-mediated cellular cholesterol efflux assay method.</a> Annals of Clinical and Laboratory Science. 45 (6), 659-668 (2015).</li>
<li>Szalaia, R., Hadzsiev, K., Melegh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+Drug+Metabolizing+Enzymes+in+Roma+Population+Samples%3A+Systematic+Review+of+the+Literature%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 Drug Metabolizing Enzymes in Roma Population Samples: Systematic Review of the Literature.</a> Current Medicinal Chemistry. 23, 1-26 (2016).</li>
<li>Mcintosh, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Sterols+for+the+Study+of+Cholesterol+Trafficking+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Probes+and+Tags+to+Study+Biomolecular+Function%3A+for+Proteins%2C+RNA%2C+and+Membranes%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Sterols for the Study of Cholesterol Trafficking in Living Cells.</a> Probes and Tags to Study Biomolecular Function: for Proteins, RNA, and Membranes. , 1-33 (2008).</li>
<li>Ostašov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLIM+studies+of+22-+and+25-NBD-cholesterol+in+living+HEK293+cells%3A+Plasma+membrane+change+induced+by+cholesterol+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Physics+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">FLIM studies of 22- and 25-NBD-cholesterol in living HEK293 cells: Plasma membrane change induced by cholesterol depletion.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 167, 62-69 (2013).</li>
<li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+fluorescent+NBD-cholesterol+efflux+in+THP-1-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of fluorescent NBD-cholesterol efflux in THP-1-derived macrophages.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (4), 5989-5996 (2015).</li>
<li>Liu, N., Wu, C., Sun, L., Zheng, J., Guo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sesamin+enhances+cholesterol+efflux+in+RAW264.7+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Sesamin enhances cholesterol efflux in RAW264.7 macrophages.</a> Molecules. 19 (6), 7516-7527 (2014).</li>
<li>Qin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+THP-1+cells+as+a+model+for+mimicking+the+function+and+regulation+of+monocytes+and+macrophages+in+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature.</a> Atherosclerosis. 221 (1), 2-11 (2012).</li>
<li>Low, H., Hoang, A., Sviridov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+Efflux+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cholesterol Efflux Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), 5-9 (2012).</li>
<li>Gimpl, G., Gehrig-Burger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+reporter+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Cholesterol reporter molecules.</a> Bioscience Reports. 27 (6), 335-358 (2007).</li>
<li>Zhang, J., Cai, S., Peterson, B. R., Kris-Etherton, P. M., Heuvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vanden+Development+of+a+Cell-Based%2C+High-Throughput+Screening+Assay+for+Cholesterol+Efflux+Using+a+Fluorescent+Mimic+of+Cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22ASSAY+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Vanden Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for Cholesterol Efflux Using a Fluorescent Mimic of Cholesterol.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 9 (2), 136-146 (2011).</li>
<li>Rader, D. D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+HDL+metabolism+and+function%3A+implications+for+novel+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of HDL metabolism and function: implications for novel therapies.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3090-3100 (2006).</li>
<li>Davidson, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+apolipoprotein+B+depletion+on+HDL+subspecies+composition+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">The effects of apolipoprotein B depletion on HDL subspecies composition and function.</a> Journal of Lipid Research. 57 (4), 674-686 (2016).</li>
<li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sage+weed+%28Salvia+plebeia%29+extract+antagonizes+foam+cell+formation+and+promotes+cholesterol+efflux+in+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sage weed (Salvia plebeia) extract antagonizes foam cell formation and promotes cholesterol efflux in murine macrophages.</a> International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1105-1112 (2012).</li>
<li>Litvinov, Y., Savushkin, E. V., Garaeva, E. A. D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+Efflux+and+Reverse+Cholesterol+Transport%3A+Experimental+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cholesterol Efflux and Reverse Cholesterol Transport: Experimental Approaches.</a> Current Medicinal Chemistry. 371 (25), 2383-2393 (2016).</li>
<li>Phillips, A., Mucksavage, M. L., Wilensky, R. L., Mohler, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+efflux+capacity%2C+high-density+lipoprotein+function%2C+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis.</a> N Engl J Med. 364 (2), 127-135 (2011).</li>
<li>Rohatgi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDL+Cholesterol+Efflux+Capacity+and+Incident+Cardiovascular+Events%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">HDL Cholesterol Efflux Capacity and Incident Cardiovascular Events.</a> New England Journal of Medicine. 371 (25), 2383-2393 (2014).</li>
</ol>

המחברים רוצה להצהיר כי הם הממציאים של הבקשה לרישום פטנט (EPO; 18382337.6-1118; 17 במאי 2018) זכאי "שיטה לקביעת בזרימת כולסטרול" המבוסס על שיטה זו.

מתויג פלורסנט כולסטרול היא אסטרטגיה מבטיח לנתח ולחקור את המאפיינים ואת חילוף החומרים של הפריה טבעי כולסטרול. היתרונות העיקריים שלה הם כי זה שאפשר לקחת על ידי תאים, מאפשר תאיים ולימודים ממברנה הפצה, ולא ניתן להחיל על כולסטרול בזרימת מבחני כגון פרוטוקול זה (איור 7). בתחום ה סטרולים מתויג פלורסנט מסוימים מאפשרים כולסטרול מעקב גופית כולל BODIPY-כולסטרול, כולסטרול dansyl, dehydroegrosterol ו- 22 ו- 25-להארכה-כולסטרול12. במיוחד, 22-להארכה-כולסטרול מתאים ללמוד dynamics כולסט...

לפי ארגון הבריאות העולמי, הגורמים העיקריים הנוכחי למוות ברחבי העולם הם מחלת לב איסכמית וקו (חשבונאות עבור סכום כולל של 15.2 מיליון מקרי מוות)1. שניהם נמצאים מחלות לב וכלי דם (CVD) זה יכול להיות קדמו טרשת עורקים, שבר atheroma הפלאק של כלי הדם2,3.
טרשת עורקים היא כלי קיר דלקתיות מחלה שבה מקרופאגים, תאי T, תאי פיטום, תאים דנדריטים לחדור את אנדותל ולצבור מהדם, בסופו של דבר ויוצרים הפלאק טרשת עורקים. שלטי טרשת עורקים מציגים ליפופרוטאין קריסטלים הליבה וכולסטרול, שמעידים ברזולוציה גבוהה B-מצב בדיקת אולטרה סאונד מדידות של4,5עובי מדיה התרדמה אינטימה. ב מקרופאגים, כולסטרול בזרימת לכיוון השומנים מקבל חלקיקים מתבצעת על ידי אמצעים של קולטני קלטת (ABC) מחייב ATP ABCA1, ATP איגוד קלטת תת G חבר 1 (ABCG1), הקולטן נבלות SR-BI. האיזון של זרם הכולסטרול ולא בזרימת ב מקרופאגים נחשב תהליך מפתח חניכה טרשת עורקים6. כולסטרול בזרימת נחשבת צעד המפתח כולסטרול חיסול של רקמות היקפיים כדי פלזמה והכבד בתהליך הנקרא תעבורה כולסטרול הפוכה (RCT). כולסטרול יועברו מ מקרופאגים בעיקר כדי אפוליפופרוטאין A1 (ApoA1) על פני השטח של חלקיקי ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL). HDLs תחבורה ואז הכולסטרול בכבד הפרשה וסילוק מחדש7,8,9.
באופן מסורתי, נעשה שימוש טריטיום (3H) מתויג רדיו כולסטרול כולסטרול בזרימת10. האות פליטה של רדיואיזוטופים הוא מאוד רגיש10; עם זאת, כולסטרול מתויג הרדיו מציג מגבלות ברורים כגון פרוטוקולים ארוכים, סיכון של חשיפה לקרינה מייננת בצורך מיוחד רדיואקטיביות מתקנים וציוד על מנת להבטיח טיפול בטוח של פליטת רדיואקטיבי. להפך, זריחה יש בהצלחה שולבו טכניקות אבחון בשל פשטותו זיהוי אותות פלואורסצנט, מגוון רחב של fluorophores זמין, ו שלה בטיחות11. בתחום ה סטרולים מתויג פלורסנט מספר השתמשו ללמוד מטבוליזם הכולסטרול כולל dehydroergosterol (עם פלורסצנטיות מהותי), כולסטרול dansyl, 4,4-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) - כולסטרול, ו 22-(N-(7- Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol (להארכה-כולסטרול). במיוחד, להארכה-כולסטרול מציג ספיגה יעילה תאים אנושיים12. שני שונים להארכה מתויג כולסטרול זמינים כעת: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-להארכה) ו 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-להארכה; איור 1). כולסטרול בלוחיות הסבר moiety 22-להארכה ייתכן ולביצועי כולסטרול בזרימת מחקרים, בעוד 25-להארכה-כולסטרול משמש בעיקר הממברנה התאית dynamics מחקר13,14.
שורות תאים המשמש בדרך כלל כולסטרול במבחנה בזרימת מבחני הם תאים דמויי מונוציט כגון לוקמיה-derived THP-1 התאים של האדם, 264.7 גלם מאתר תאים15או J774.1. כל התאים האלה יכול להיות מובחן מקרופאגים במבחנה באמצעות 13 12-פעילים phorbol-אצטט (PMA), אך THP 1-נגזר מקרופאגים (dmTHP-1) הכי טוב לשקף לחקות את המקרופאגים האנושי16.
במחקר הנוכחי, אנו לייעל, לתקנן שיטה תפוקה גבוהה פלורסנט כדי לקבוע את הקיבולת בזרימת כולסטרול הדוגמאות סרום dmTHP-1, באמצעות 22-להארכה-כולסטרול כחלופה [3H]-כולסטרול. בנוסף, אנו משווים את הטכניקה פלורסנט ממוטבת עם אנלוגי רדיואקטיבי סטנדרטי.

<table><tbody><tr><td>צלחת איסוף 96 בארות</td><td>Corning Inc</td><td>Costar 3912</td><td>צלחת לבנה 96 בארות עם תחתית אטומה שקופה</td></tr><tr><td>96 בארות צלחת</td><td>קורנינג בע"מ</td><td>Costar 3610</td><td>צלחת לבנה 96 בארות עם תחתית שטוחה שקופה</td></tr><tr><td>ערכת בדיקת פליטת כולסטרול (מבוססת תאים)</td><td>Abcam</td><td>ab196985</td><td>ערכת בדיקה מסחרית מבוססת תאים בתפוקה גבוהה שמטרתה לקבוע את כולסטרול אפלוקס</td></tr><tr><td>חסר צבע RPMI 1640</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>R7509</td><td>RPMI 1640 ללא פנול-אדום</td></tr><tr><td>Gen5 תוכנת ניתוח נתונים</td><td>BioTek</td><td></td><td>גרסה 2.0</td></tr><tr><td>גליצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8790-100G</td><td>גליצין, לשימוש שאינו בבעלי חיים</td></tr><tr><td>לומינומטר</td><td>Biotek</td><td>SYNERGY HT</td><td>Multi-Detection Microplate</td></tr><tr><td>Reader פתרון ליזה 1</td><td></td><td></td><td>50 מ"מ Tris Buffer, 150 מ"מ NaCl ו-H2O</td></tr><tr><td>תמיסת ליזה</td> 2 <td>בבית</td><td></td><td>אתנול טהור ותמיסת ליזה תאים 1:1 (v:v)</td></tr> <tr><td>NBD-כולסטרול</td><td>Thermo-Fisher</td><td>N1148</td><td>22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3&beta;-Ol</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td>חוצץ פוספט&nbsp; מי מלח</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>202452-250 גרם</td><td>פוליאתילן גליקול</td></tr><tr><td>PMA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>79346</td><td>פורבול 12-מריסטייט B-אצטט.</td></tr><tr><td>R10</td><td>RPMI 1640 בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-5% פניצילין/סטרפטומיצין.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td>RPMI 1640 עם 2 מ"מ L-גלוטמין המכיל 1.5 גרם/ליטר נתרן ביקרבונט ו-4.5 גרם/ליטר תאי</td></tr><tr><td>THP-1</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>ATCC,</td><td>קו דמוי מונוציטים #TIB-202 שמקורו בלוקמיה מתינוק בן שנה</td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr></tbody></table>

תפוקה גבוהה התווית על-ידי nitrobenzoxadiazole כולסטרול בזרימת assay

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

טרשת עורקים מובילה למחלות קרדיווסקולריות (CVD). לא ברור עדיין אם ריכוז כולסטרול-HDL (cHDL) ממלא תפקיד סיבתי בהתפתחות טרשת עורקים. עם זאת, גורם חשוב בשלבים המוקדמים של היווצרות הפלאק atheroma הוא היכולת בזרימת כולסטרול HDL (היכולת של חלקיקי ה-HDL כולסטרול מן מקרופאגים לקבל) על מנת למנוע היווצרות תאי קצף. זהו צעד המפתח הימנעות ההצטברות של כולסטרול של אנדותל, וחלק תעבורה כולסטרול הפוכה (RCT) כדי למנוע כולסטרול דרך הכבד. קיבולת בזרימת הכולסטרול בסרום או פלזמה במודלים macrophage התא הוא כלי מבטיח זה יכול לשמש סמן עבור טרשת עורקים. באופן מסורתי, [3H]-כולסטרול כבר בשימוש מבחני בזרימת כולסטרול. במחקר זה, אנו שואפים לפתח אסטרטגיה מהירה ובטוחה באמצעות פלורסנט מתויג כולסטרול (הכולסטרול-להארכה) ב וזמינותו הסלולר לאתר את ספיגת הכולסטרול ותהליכי בזרימת ב מקרופאגים THP 1-נגזר. לבסוף, אנו לייעל, לתקנן את שיטת בזרימת להארכה-כולסטרול ולפתח ניתוח תפוקה גבוהה באמצעות לוחות 96-ובכן.

המטרה של כולסטרול בזרימת וזמינותו היא לקבוע במבחנה את הקיבולת בזרימת כולסטרול סרום נתון, פלזמה, או תגובת שיקוע המכיל חלקיקי ה-HDL. השיטה מורכבת loading כולסטרול מתויג תרבות של קו תא מקרופאג סטנדרטי שייצור קשר עם הדגימה הבדיקה מדולל FBS ללא מדיה עם התאים. בסופו של דבר, רמות פלורסנט להארכה נמדדים תא lysate וכלי תקשורת. כדי למטב את המידות, רמת הכולסטרול effluxed מתאי למדיה מעורבב עם אמצעי אחסון אחד החומר הממיס המכיל אתנול. להארכה-הכולסטרול בתאי שנותרה היא resuspended לתוך הממס המכיל אתנול או דטרגנט לפני מדידות. לבסוף, נקבע ...

מדידה של קיבולת בזרימת במבחנה כולסטרול סרום או פלזמה במודלים macrophage התא הוא כלי מבטיח כמו סמן עבור טרשת עורקים. במחקר הנוכחי, אנו לייעל לתקנן שיטה בזרימת להארכה-כולסטרול פלורסנט, לפתח ניתוח תפוקה גבוהה באמצעות לוחות 96-ובכן.

תפוקה גבוהה התווית על-ידי Nitrobenzoxadiazole כולסטרול בזרימת Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

פרוטוקול זה הוא השיטה מבוססת התא שלנו להפסקת כולסטרול של רפלוקס כולסטרול בפלזמה ceramal. במיוחד בהקרנות. זה עשוי להיות מיושם כדי לאבחן סיכון קרדיווסקולרי, כדי לזהות או להעריך כולסטרול תחזוקה נמוכה יותר.טכניקה זו מונעת את הסיכון ואת הנטל כבטיחות עם טיפול בחומרים מוקרינים על ידי מתן תוצאות עם רמות איכות דומות, לאלה של כולסטרול reflux דווח לקשר עם כך, פלזמה או כולסטרול ceramal reflux של מקובל ניתן להשוות, לבקרת הייחוס שלנו עשוי לספק את הסיכון לסבול משיטה זו תחול גם על קווי התא כמו קווי תאים אנושיים אחרים או אפילו שלבי מאקרו ראשיים., שלבי מאקרו או ותאי גזע של לחצן ספריי הנגרמים על ידי אדם. כדי להתחיל בהליך זה, להמיס את הכולסטרול NPD באתנול טהור כדי לקבל פתרון מלאי עם ריכוז סופי של שני micromolar.לדלל 25 microliters של מלאי הכולסטרול NBD ב AR 10 בינוני כדי להגיע לריכוז הסופי של חמישה micromolar. תאים thp-1 תרבות שלנו 10 בינוני ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. כל שלושה ימים להתאים את צפיפות התא ל300000 תאים למיליליטר.לאחר מכן להשיג צלחת 96 היטב עם תחתית ברורה שטוחה. להומוגניזציה טובה יותר, הכינו 10 מיליליטר של תאי thp-1 בצינור של 15 מיליליטר, והוסיפו 200 מיקרוליטרים של מלאי PMA. מערבבים בעדינות וזרעים 100 מיקרוליטרים של התערובת לתוך בארות הצלחת ב 200, 000 תאים לתוך באר.ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני במשך 48 עד 72 שעות כדי להבדיל את תאי thp-1 לתאי DM thp-1. תחילה לדלל גליצין ב 10% PBS עם מים סטריליים, לריכוז של 200 micromolar ב pH 7.4. מוסיפים 40 מיליליטר של גליצין מדולל ל-10 גרם יתד 8000 להכנת תוסף 20%, ומערבבים במרץ להומוגניזציה.הבא להחיל ארבעה חלקים של 20% לכל 10 חלקים של מדגם על כל סרום או דגימת פלזמה בצינור 1.5 מ"ל. השאירו את התערובת על הקרח למשך 25 דקות. צנטריפוגה אפוליפופרוטאין B יתד ב 13000 פעמים G, וב ארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.השלך את המשקעים, והעבר את העל-טבעי לצינור חדש. אחזר את הלוח המכיל את תאי ה- thp-1 המובחנים. הסר והשליך את מדיום התרבות ולאחר מכן לשטוף את התאים פעמיים עם PBS 1X.הוסף 100 microliters של 5 מיקרומולרים MVD כולסטרול AR-10 בינוני לכל באר. דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. למחרת להשליך, להשליך את המדיום.לשטוף את התאים פעמיים עם PBS, ולאחר מכן להוסיף 100 MICROLITERS ABDS, או מקבל שומנים מטוהרים מדולל rpmi 1630 בינוני לריכוז הרצוי לכל באר. כלול פקד שלילי אשר אינם מכילים מקבלי כולסטרול בשליטה חיובית, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך ארבע עד שש שעות. בינתיים, להכין מלאי 200 מיליליטר של פתרון תות תא אחד כפי שמתואר בטקסט.מערבבים פתרון זה עם אתנול, ביחס נפחי של אחד לאחד כדי לקבל פתרון תזה מדי. לגילוי מדיה וכולסטרול BD, הסר את מדיום התא מהצלחות שנאספו בצלחת לבנה חדשה של 96 באר עם תחתית שטוחה אטומה. הוסף 100 מיקרוליטרים של אתנול טהור ל-100 מיקרוליטרים של כל דגימה בינונית כדי להשיג יחס של אחד לאחד בצלחת החדשה.באמצעות מד חום, למדוד את עוצמת הפלואורסצנט בגירוי של 463 ננומטר, ו פליטה של 536 ננומטר. לגילוי כולסטרול NBD תאי, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS. מוסיפים 100 מיקרוליטרים של תותבת תזה גם לכל באר, ו דגירה בטמפרטורת החדר, תוך טלטול במשך 25 דקות.לאחר מכן, למדוד את עוצמת הפלואורסצננט תוך התאמת פרמטר הרגישות ל 50 בתוכנה. לאחר מכן לקבוע את שיעור efflux כולסטרול במידה הסופית של כולסטרול efflux כמתואר בפרוטוקול הטקסט. דילול כולסטרול NBD באתנול טהור מייצר את ערכי העוצמה הגבוהים ביותר של הפלואורסצנט בעוד תוכן גבוה בתספורת מיקווית, מוריד את העוצמה.הדבר מצביע על כך ש הפליטה הפלואורסצנטית של מולקולה זו תלויה מאוד במדיום, שבו היא כלולה. בעת שימוש בתערובת של מדיה ואתנול ביחס של אחד לאחד, נראה כי עוצמת הפלואורסצנטי גדלה באופן פרופורציונלי, עם ריכוז של אנלוגי כולסטרול, מה שמרמז כי החללית מתנהגת כראוי בתנאים אלה. כדי לקבוע את משך הזמן הנדרש כדי להדגר את התאים טעון עם מקבלי כולסטרול, התקשורת התא נקצר בנקודות זמן שונות.efflux כולסטרול התפתח באופן ליניארי מאפס עד שש שעות, עם האות המרבי שנתפס שש שעות לאחר ABDS מתווסף לתאים. סף הרוויה והטווח הדינמי נבדקים על ידי מדידת efflux הכולסטרול באחוזים שונים של HDL המכיל מדיה. בנכס תפוקה גבוהה, efflux מתפתח באופן ליניארי מאחד עד 7%ABDS, להגיע לשיא של קיבולת efflux כולסטרול ב 7%בריכוזים גבוהים מ 7%העוצמה של הפלווסנט פוחתת ביחסים הפוכים עם אחוז ה-ABDS.הביצועים של השיטה המבוססת על פלואורסצנטיות מוערכים לאחר מכן על ידי השוואתה לטכניקת הרדיו הסטנדרטית המסומת. שתי הטכניקות מתואמות מאוד בעת שימוש בריכוזים שונים של ABDS. השיטה המתוארת רגישה לעלייה של ריכוזי מקבל בתוך ערכי efflux כולסטרול בין חמישה ל 15%, חשוב לוודא כי celluarizer אינו מכיל אגרגטים.נקודה קריטית היא לדרג סביבה המכילה אתנול מצרפי, כדי למדוד את הפלואורסצנטיות במשקל הומוגני ואופטימלי. בעקבות הליך זה, שם כולסטרול טכני ניתן למדוד, ואת ההשפעה של תרופות במסלול efflux כולסטרול ניתן לקבוע. גם בית הספר בסופו של דבר לשמש אבחון כדי התחת סיכון קרדיווסקולרי.אנו מאמינים כי שיטה זו היא הרבה יותר קלה ובטוחה מאשר השיטה הסטנדרטית הרדיואקטיבית. עם זאת הוא עדיין תלוי תא. אנא זכרו כי אתנול הוא פתי ויש לאחסן אותו ולטפל בו בהתאם.

high-throughput-nitrobenzoxadiazole-labeled-cholesterol-efflux-assay

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

Assay כולסטרול נועדה לכמת את שיעור בזרימת כולסטרול מן התאים בתרבית ואת היכולת של פלזמה acceptors לקבל את הכולסטרול מתאי שוחרר. Assay כולל תיוג תאים עם איזון כולסטרול, הכולסטרול בין בריכות תאיים ושחרור של כולסטרול כדי acceptor תאיים.

בזרימת כולסטרול Assay

פרוטאוליפוזומים משמשים לחקר תעלות מטוהרות וטרנספורטרים שהוקמו מחדש בסביבה ביוכימית מוגדרת היטב. מודגם הליך ניסיוני למדידת פליטה בתיווך חלבונים אלה. מתוארים השלבים להכנת פרוטאוליפוסומים, ביצוע ההקלטות וניתוח נתונים כדי לקבוע כמותית את התכונות הפונקציונליות של החלבון המשוחזר.

Proteoliposome מבוסס הזרימה Assay כדי לקבוע מאפייני מולקולה בודדת של Cl<sup-&gt;</sup&gt; ערוצים ומסועים

חוקר את יחסי הגומלין בין חיידקים פתוגנים מארחיהם הוא אזור חשוב של מחקר ביולוגי. כאן אנו מתארים טכניקות צורך למדוד טרנסלוקציה מפעיל ידי burnetii Coxiella במהלך להשתקת גנים siRNA שימוש המצע כלאם.

החלת העברת אנרגית תהודת קרינה (סריג) לבחינת יעילות טרנסלוקציה מפעיל ידי<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; במהלך siRNA השתקה

נתאר כאן fluorometric assay ללא תא הביוכימי לקביעת ה-HDL-השומנים peroxidation. זה מהיר ולא לשחזור assay יכול לשמש כדי לקבוע פונקציה HDL במחקרים בקנה מידה גדול והוא יכול לתרום להבנת פונקציית ה-HDL מחלות אנושיות.

ללא תא הביוכימי Fluorometric Assay אנזימטי למדידה תפוקה גבוהה של שומנים בדם Peroxidation של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה

מטרת מחקר זה היתה להעריך במבחנה להורדת שומנים בדם סמים אפקטים ב להתכוונן המורפולוגיה של חלקיקים כולסטרול. השוואה של התרופות להורדת שומנים בדם חשף בווריאציות השפעתם ב להתכוונן התכונות מורפולוגי של חלקיקים כולסטרול.

דיפרנציאלית השפעות תרופות להורדת שומנים בדם להתכוונן מורפולוגיה של כולסטרול חלקיקים

פרוטוקול זה מספק גישה יעילה מדידת ספיגת כולסטרול LDL במחירים זרם בזמן אמת באמצעות תא חי הדמיה למערכת סוגי תאים שונים. טכניקה זו מספקת פלטפורמה למסך את פעילות פרמקולוגית של תרכובות להשפיע על זרם LDL תוך מעקב אחר עבור תא ומורפולוגיה cytotoxicity ומכאן פוטנציאליים.

ספיגת כולסטרול LDL Assay באמצעות תא חי הדמיה ניתוח עם התא לניטור תקינות

מוצג כאן מבחן פלואורסצנטי רגיש לניטור פעילות אפוליפופרוטאין N-אצילטרנספראז באמצעות פפטיד דיאצילגליצריל ואלקין-פוספוליפידים כמצעים עם כימיה של קליקים.

בדיקה פלואורומטרית מבוססת קליק-כימיה עבור אפוליפופרוטאין N-אצילטרנספראז מאיפיון אנזים ועד סינון תפוקה גבוהה

פרוטוקול זה מפרט בדיקת מבחנה למדידת ספיגת שומנים תאיים בתאי אנדותל בעת גירוי עם אנלוגים פלואורסצנטיים BODIPY-C12 ו-BODIPY-C16 של חומצות שומן רוויות ארוכות שרשרת וארוכות שרשרת מאוד. שיטה זו יעילה וניתנת להתאמה לסוגי תאים אחרים, ומציעה גישה שימושית לחקר חילוף החומרים של השומנים.

כימות ספיגת חומצות שומן אנדותל באמצעות אנלוגים של חומצות שומן פלואורסצנטיות

כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים למדידת כמות הפוספוליפיד הפלואורסצנטי שהוסר במיוחד מחלקיקי תורם שומנים על ידי ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) הקיים בפלזמה או בסרום אנושי שלם. הראינו שמדד זה של פונקציונליות HDL מנבא מחלות לב וכלי דם אירועיות.

בדיקת פליטת פוספוליפידים ספציפית לליפופרוטאין בצפיפות גבוהה

תפוקה גבוהה, פלטפורמה אוטומטית של פיתוח וייצור קו התא לייצור חלבונים ותרופות מתואר. יישום סדרן BD Cell Aria FACS, CloneSelect Imager וטקאן חופש מערכת EVO טיפול הנוזל הוכיחה יכולת עיבוד גדל באופן משמעותי בפיתוח קו התא עם איכות הקו השתפרה התא reproducibility גבוהה.

פלטפורמה תפוקה גבוהה אוטומטיות לפיתוח קווי ייצור עבור Cell Therapeutics חלבון

למד שיטה לבדיקת יציאת כולסטרול בתאי מקרופאג' באמצעות NBD-cholesterol בלוחות 96-באר. השיטה מאפשרת סקרינג בקצב גבוה להערכת סיכון קרדיווסקולרי בבטיחות.

תפוקה גבוהה התווית על-ידי Nitrobenzoxadiazole כולסטרול בזרימת Assay

גלה סרטונים נוספים