ליפוזום יחיד מדידות לצורך המחקר של משאבות פרוטונים אנזימים ממברנה בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי אלקטרוכימיה

שיטה זו מאפשרת לחקור את פעילות הובלת הפרוטון של אנזימי קרום הנשימה כמו ציטוכרום BO3 בסביבה טבעית של שומנים דו שכבתיים. היתרונות העיקריים של טכניקת אנזים יחיד זו היא האפשרות להתחיל ולהפסיק תגובות אנזימטיות בכל רגע באמצעות אלקטרוכימיה. באמצעות העברת מזרק זכוכית 200 microliters של מלאי כלורופורם של תמצית קוטב השומנים מ Escherichia coli לתוך בקבוקוני זכוכית לעשות חמישה aliquots מיליגרם.

הוסף 50 microliters של מיליגרם אחד למיליליטר ubiquinone 10 שומנים כדי להפוך את היחס הסופי של אחד עד 100 ubiquinone 10 כדי שומנים. לתערובת להוסיף 20 microliters של מיליגרם אחד למיליליטר אורך גל ארוך צבע פלואורסצנטי שכותרתו FDLL מקוצר השומנים. הומוגניזציה של פתרון הכלורופורם על ידי מערבולת קצרה להתאדות רוב הכלורופורם תחת זרימת חנקן או ארגון עדינה.

הסר את עקבות הכלורופורם לחלוטין על ידי אידוי נוסף תחת ואקום למשך שעה אחת לפחות. הוסף 312.5 microliters של 40 מילימולרים MOPS pH 7.4 מאגר אליליקוט אחד של שומנים ubiquinone 10 FDLL יבש לערבב. מערבבים את המערבולת עד שסרט השומנים מושעה לחלוטין ואחריו שתי דקות של טיפול באמבטיה קולית.

לאחר מכן להוסיף 125 microliters של 25 מילימולרים HPTS, צבע פלואורסצנטי רגיש pH כי יהיה אנקפסולציה בתוך ליפוזומים. עכשיו להוסיף 137.5 microliters של 250 מילימולר OGP פעילי שטח. לאחר ערבוב באמצעות מערבולת, sonicate את התערובת באמבט מים קולי במשך 10 דקות כדי להבטיח את כל השומנים הם מנוכרים לתוך micelles פעילי שטח.

ואז להעביר את הפיזור לתוך צינור פלסטיק 1.5 מיליליטר. מוסיפים את הכמות הנדרשת של ציטוכרום BO3 ומוסיפים מים טהורים במיוחד כדי ליצור נפח כולל של 50 מיקרוליטרים. דגירה תערובת reconstitution בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות על מערבל רולר.

הבא לשקול 50 מיליגרם של microbeads פוליסטירן לתוך כל אחד משני כובעי צינור 1.5 מיליליטר. ואז לשקול 100 מיליגרם של microbeads פוליסטירן לתוך עוד שני כובעי צינור 1.5 מיליליטר. סגור את הכובעים עם סרט פרפין כדי למנוע ייבוש.

הוסף את 50 המיליגרם הראשונים של חיידקים פוליסטירן לתוך תערובת reconstitution על ידי הצבת הכובע עם microbeads פוליסטירן על צינור פלסטיק 1.5 מיליליטר עם הפיזור מוכן. ואז לבצע ספין קצר במשך כמה שניות כדי להביא microbeads לתחתית הצינור. דגירה ההשעיה בארבע מעלות צלזיוס על מערבל רולר כדי לאפשר microbeads פוליסטירן לספוג את החומר הגלישה במשך 30 דקות.

חזור על התוספות של חיידקים פוליסטירן ודגירה כדלקמן. מוסיפים 50 מיליגרם של חיידקים במשך 60 דקות של דגירה. לאחר מכן להוסיף 100 מיליגרם של microbeads במשך 60 דקות של דגירה.

ולבסוף, להוסיף 100 מיליגרם של microbeads במשך 120 דקות של דגירה. הפרד את פתרון הפרוטאוליפוזום מהמיקרוביאדים הפוליסטירן באמצעות מיקרופיפטית עם קצה דק. לדלל את הפיזור ב 90 מיליליטר של חיץ MOPS בצינור מרכזי במיוחד TI 45.

Ultracentrifuge את הפיזור באמצעות סוג 45 TI רוטור ב 125, 000 פעמים G במשך שעה אחת כדי גלולה proteoliposomes. לאחר ultracentrifugation, להשליך את supernatant ולשטוף את כדורי עם חיץ MOPS מבלי resuspending גלולה. לאחר השלכת חיץ שטיפה, להשעות מחדש את proteoliposomes ב 500 microliters של חיץ MOPS על ידי צינורות אותו קדימה ואחורה עם micropipette קצה דק לפני העברת המתלה צינור פלסטיק 1.5 מיליליטר.

לאחר צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 12, 000 פעמים G כדי להסיר את הפסולת, להעביר את supernatant שהוא proteoliposomes מחדש לתוך בקבוקון חדש. הדבק עד תשעה מחליקי כיסוי זכוכית על משטח זהב מתאדה באמצעות אפוקסי דו-רכיבים דל פלואורסצנטיות. לרפא את הדבק ב 80 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות.

רגע לפני השינוי עם שכבת מונו בהרכבה עצמית, נתק את החלקות כיסוי הזכוכית מוופל הסיליקון עם להב. בשל הדקות של מחליקי הכיסוי, יש לדאוג בעת ניתוק החלקות הכיסוי לא לפצח או לשבור את שקופיות הזכוכית. טובלים את הכיסוי הטרי מצופה זהב מחליק לתוך פתרון 6-marcaptohexanol ולהשאיר ב 20 עד 25 מעלות צלזיוס לילה כדי ליצור את השכבה מונו התאספו עצמית.

למחרת, להסיר את החלקות כיסוי מצופה זהב מהתסכול ולשטוף בקצרה עם מים או מתנול ולאחר מכן עם isopropanol. יבש את הכיסוי מצופה הזהב מחליק תחת זרימת גז עדינה. להרכיב את פתק הכיסוי מצופה זהב בתא ספקטרו-אלקטרוכימי כפי שדיאגרמה בפרוטוקול הטקסט.

צור קשר עם הזהב עם חוט שטוח מחוץ לאזור המוגדר על ידי גומי O-ring ו לדפוק בחוזקה את התא האלקטרוכימי על גבי זה. הוסף שני מיליליטר של פתרון מאגר האלקטרוליטים והצב את האלקטרודות הייחוס והאלקטרודות העזר בתא. המשך לבדוק את איכות השכבה המונו-שכבתית שהורכבה עצמית והפעל ריקים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

מוסיפים פרוטאוליפוזום לתא האלקטרוכימי ב-0.5 מיליגרם לריכוז שומנים סופי מיליליטר ומערבבים מעט עם פיפטה. המתן 30 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר עד לסיום ספיגת הפרוטאוליפוזום על משטח האלקטרודה. לשטוף את התא על ידי שינוי פתרון החיץ לפחות 10 פעמים, אבל להימנע השארת משטח האלקטרודה יבש לחלוטין.

עכשיו, לרוץ ספקטרוסקופיה בלתי תלויה אלקטרוכימית בפוטנציאל תא פתוח כדי לאשר את שכבת מונו התאספו עצמית על האלקטרודה זהב נשאר ללא שינוי. הפעל voltammograms מחזורי עם שיעורי סריקה 10 ו 100 מיליבולטים לשנייה כדי לצפות חמצון אוביקינול קטאלטי הפחתת חמצן על ידי ציטוכרום BO3 בתחילת הפוטנציאלים של הפחתת קווינון אלקטרוכימיים. לשנות את האלקטרודה זהב כמו קודם אבל באמצעות חמישה מיקרוגרם לכל פרוטאוליפוזום מיליליטר.

עבור מחקרי אנזים יחיד להפחית את יחס ציטוכרום BO3 כדי השומנים בין 0.1 ו 0.2%Place טיפה של שמן טבילה ולאחר מכן את התא האלקטרוכימי על המטרה 60 פעמים שמן של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. באמצעות מסננים מתאימים עבור פלואורסצנטיות FDLL, להתמקד על פני האלקטרודה. ליפוזומים בודדים צריכים להופיע כנקודות בהירות במגבלת ההתעבהות של מטרת המיקרוסקופ.

לצלם תמונה של פלורסנס FDLL. עבור אל אחת מערכות מסנן פלורסנס HPTS במיקרוסקופ כדי לוודא כי פלורנס HTPS גלוי בבירור וניתן להבחין בין הרקע. הגדל את עוצמת האור אם זה לא המקרה.

תכנת את תוכנת המיקרוסקופ לביצוע רכישת תמונה מתוזמן על-ידי החלפת שתי ערכות מסנני HTPS. לשם כך, הגדר חשיפה של שנייה אחת ולאחר מכן נווט אל יישומי תפריט. לאחר מכן הגדר/הפעל רכישת ND ובחר שני ערוצי HTPS.

הגדר את ההשהיה בין רכישות תמונה לכל הפחות. בניסוי זה להשתמש 0.3 השהיה שנייה ומשך כולל של חמש דקות. התאם את ההגדרות של potentiostat כדי לשנות את הפוטנציאל במהלך רכישת התמונה כפי שצוין בפרוטוקול הטקסט.

עכשיו, בו זמנית להפעיל את רכישת תמונה מתוזמן על המיקרוסקופ ואת הרצף הפוטנציאלי על potentiostat על ידי הפעלת ידנית שתי המדידות בו זמנית. המוצגים כאן תמונות פלואורסצנטיות של ליפוזומים נספגים על האלקטרודות בשלושה כיסויים שונים. הצבע המכיל ליפוזומים נראה בתמונות כנקודות בהירות.

החלק המרכזי של התמונה היה מולבן כדי לחשוף את רמת הפלורנס ברקע. התמונות בשני ערוצי HTPS הם סופר בלתי נסבל שבו היחס בין שני הערוצים מתאים pH של 7.4 בשימוש בניסוי זה. מספר גדול יותר של ליפוזומים גלויים עם ערוץ FDLL, אשר מציין את נוכחותם של ליפוזומים כי אין HPTS אנקפסולציה.

ההבדל בין ערוצי HPTS ו- FDLL בולט יותר בכיסויים גבוהים יותר. אולי בגלל כיסוי ליפוזום גבוה, ליפוזומים נוטים יותר להתפוצץ או להתיך על פני השטח. כאן, השינוי של florescence ליפוזום בשני ערוצי HTPS מוצג כמגרש משטח 3D של האזור המתאים במהלך 300 שניות של הניסוי.

הפוטנציאל המצמצם יושם בין 60 שניות ל-180 שניות. ההתוויה המתאימה של יחס עוצמת מדד נפח של שני ערוצי HPTS לעומת זמן מוצגת. מוצגים כאן החציונים של כל השינויים ב- pH של שלפוחית בתוך תמונה אחת כאשר תוכן BO3 של ציטוכרום הוא 1.3%עלייה ב- pH גלויה בבירור כאשר מוחל פוטנציאל בין 0.1 ל- 0.3 וולט.

כאשר תוכן BO3 ציטוכרום הוא ערך נמוך בהרבה של 0.1% העקומות החציוני להיות כמעט בלתי ניתן להבחנה מאלה של ליפוזומים ריקים. חשוב להבטיח הסרה מלאה של פעילי שטח מן היתרים ליפוזום מאז שאריות עשוי להגדיל את חדרות של ליפוזומים פרוטונים. שיטות אלה מאפשרות לנו לשאול שאלות ספציפיות על מצע קווינון ליפופילי טבעי בניגוד לאנלוגיות קינונה מסיסות במים המשמשות לעתים קרובות.

יתר על כן, ניסויי האנזים היחיד זיהו מצב דליפה שלא היה ידוע קודם לכן שבו החלבון פועל כתעלת פרוטון שבה פרוטונים זורמים בחופשיות לאחור.