השתלת איון עם פגיעה אינטרה באמצעות h-עם פגיעה מטריקס איון מילוי (יונת)

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאימות ויוו של טיפול מבוסס הידרוג תא, שממחישים את הדוגמה של השתלת איון. h-עם פגיעה איון מטריקס ממלאת השרשה (ביות) מאפשר השתלה של תערובת תא-הידרוג בין השכבות עם פגיעה, ליד כלי הדם, כדי למקסם את engraftment בסביבה מטבולי תקין.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת מפתח בתחום הטיפול בתאים, כגון, האם השתלת איון יכולה להיות ממוטבת על ידי הטכניקה הכירורגית hOMING? היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא פשוטה, מהירה וניתן לכוונון, וגם האימות הביו-חומרי מהיר מאוד. הדגמה חזותית של מיקום המחט היא קריטית כדי להבטיח הזרקת שתל נכונה בתוך האומנטום, כמו מחט ממוקם באופן שגוי יכול לגרום דליפה איון.

כדי לגרום לסוכרת, להזריק 75 מיליגרם לקילוגרם של סטרפטוזוטוסין תוך-פרטי לתוך כל ילד בן שישה שבועות, 150 עד 190 גרם לואיס נמען חולדה, ולבדוק את מצב הסוכרת על ידי מדידת גלוקוז בדם יומית במשך ארבעת הימים הראשונים לאחר ההזרקה. כאשר החולדות מפגינות גליקמיה מעל שני גרם לליטר, מזריקות תת עורית שש יחידות של אינסולין ארוך טווח ביום כדי למנוע סיבוכי סוכרת וירידה במשקל. כלול חולדות בקבוצה הניסיונית כאשר שני מדדים של רמת הגלוקוז בדם וריד הזנב גדולים מארבעה עד חמישה גרם לליטר במשך יומיים רצופים, עם רמת C-פפטיד מתחת ל -200 פיקומולר.

עבור השתלת גלולה, לאשר חוסר תגובה קמצוץ בוהן בבעל חיים חולה סוכרת הרדמה ולנקות את הצוואר עם יוד povidone. לגלח את אזור ההשתלה ולנקות את העור החשוף עם יוד povidone נוסף. לאחר שלוש דקות, לנקב אחד 1/2 כדורי אינסולין בתווית יוד אחד עד חמש povidone ולהשתמש 16 מד trocar לנקב את עור הצוואר החשוף.

לאחר מכן, השתמש במדריך ובסגנון כדי להכניס את כדורי ולתפור את הפתח בנקודה אחת. לנקות את התפר עם יותר יוד povidone ולאפשר לחולדה להתאושש בכלוב עם ניטור ומזון, כדי למנוע היפוגליקמיה. כדי למדוד את היעילות של כדורי, למדוד את הירידה גליקמיה כל שבוע במשך חודש לאחר ההשתלה, כולל חולדות בקבוצה הניסוי כאשר מידה של דם וריד הזנב C-פפטיד רמת נשמר תחת 200 picomolar בחודש אחד לאחר השתלת גלולת אינסולין.

למילוי איון מטריצה תוך-אומנטלית, ספור את מספר איוני החולדות המבודדים בחולדות תורמות בריאות שווה ערך לאיים, והכן איון אחד שווה ערך לקילוגרם של נמען בצינורות בודדים של 1.5 מיליליטר. לשטוף כל aliquot עם 500 microliters של מדיום CMRL ללא סרום בקר עוברי resuspend כדורי איון ב 150 microliters של נושא הידרוג'ל אלגינט טרי לכל צינור עם ערבוב זהיר לפני הנחת הצינורות על קרח. לאחר מכן, לטעון מזרקים מיליליטר אחד מצויד מחט 21-מד אטראומטי עם 150 microliters של alginate ריק ללא נפח מת, ואחריו 150 microliters של alginate בתוספת איונים.

מניחים את המזרקים על קרח ומכינים את צווארו של החיה המטופלת הראשונה כפי שהודגם זה הרגע. השתמש אזמל כדי להפוך חתך על הפצע הישן ולהשתמש מדפים כדי להסיר את כדורי. סגור את התפר עם אחת או שתיים נקודות תפר בודדות והצב את החולדה בתצב supine.

לעקר את האזור צפי לגלח. השתמש באזמל כדי ליצור לפרוטומיה אחת של 1/2 ס"מ ממש מתחת לעצם החזה. מניחים גזה מעקרת רטובה סביב החתך ולזהות את כרית השומן omental הממוקם ליד הבטן.

השתמש מטחנים כדי למשוך בעדינות את כרית השומן מתוך חלל צפדית, להפיץ אותו על גזה. לחות את רקמת הומנטל היטב עם שני מיליליטר של מלוחים סטריליים מחוממים מראש, 37 מעלות צלזיוס, ו, מחזיק את הרקמה עם ממטרים מעוגלים קטנים ביד אחת, לחדור את הקצה האומנטלי בין שכבות omental עם המחט של מזרק טעון איון עם השני. בעת החדרת המחט, ודא שהיא מוקפת בשכבה דקה של רקמת אומנטל לפני תחילת ההזרקה.

הכנס את המחט לחלוטין ולאט לאט להתחיל להזריק את הכנת איון תוך נסיגת המחט כדי לאפשר את איונים מוזרק להתפשט בכל הרקמה. במהלך ההזרקה, לסגת את המחט לקצה הרקמות, לעצור את הזריקה כאשר המחט היא כמעט החוצה. לאחר מכן, המתן חמש שניות לפני שתתחיל זריקה חדשה במיקום הבא.

ולהזריק עוד שלושה עד ארבעה אליקוטים כפי שהוכח. כאשר כל הידרוג'ל כבר מחלק, למשוך את המחט בזהירות כדי למנוע את אובדן האיים מוזרק, בודק כי האיים אינם מקובצים במזרק בסוף הזריקה. כאשר כל איונים נמסרו, לחות את omentum ואת הקיר של לפרוטומיה לפני בזהירות להחזיר את רקמת הומנטל לחלל הבטן.

להזריק שני מיליליטר של מלוחים סטריליים מחוממים מראש לתוך חלל הבטן כדי rehydrate החולדה. לאחר מכן סגור את קיר השריר עם תפר חוט רציף ולתפור את השכבה העורית עם נקודת תפר אחת. לאחר חודש עד חודשיים של מעקב מטבולי, פתח את החתך הכירורגי של כל נמען כפי שהוכח, ולהשתמש במדפים כדי להפיץ בזהירות את האומנטה על חתיכות ספוגות מלוחים של גזה הניח ליד החתכים.

החל מהאזור החסיד לזנב הלבלב, השתמש במספריים כדי לבלט את רקמת הומנטל ולהזריק שני מיליליטר של מלוחים מחוממים מראש לפני סגירת כל חיה כפי שהוכח. תקן את האומנטה שאוחזרה בפרפורמלדהיד של 4% לפני הטמעה בפרפין. לאחר מכן, לרכוש חלקים בעובי ארבעה מיקרומטר של הרקמות על microtome ולהחיל המטוקסילין וכתם אאוסין להערכה מורפולוגית של ההשתלות.

חטוזי דקסטרן שהושתלו בשיטת hOMING כפי שהוכח נצפו לעתים קרובות קרוב לכלי הדם והושתלו היטב ברקמת השומן. במחקר isogenic נציג זה, גליקמיה נשלטה לראשונה על ידי השתלה של אחד 1/2 כדורי אינסולין כפי שהוכח ולאחר מכן על ידי איונים מושתלים כפי שהוכח על ידי גליקמיה של כשני גרם לליטר ו C-peptidemia של יותר מ 500 picomolar בבעלי החיים הנמען. בנוסף, ניתוח היסטולוגי של האומנטה המובלטת חשף איונים רב-תאיים, ככל הנראה כתוצאה מקרבתם לכלי הדם.

לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחומים טיפוליים בתאים לחקור מיקרו-וירוס תאי שעבר הנדסה ביולוגית במודלים פרה-קליניים.