Name: בידוד של תאי אנדותל Microvascular ראשי שריר השלד מאתר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: למד שיטה לבידוד תאי אנדותל מיקרווסקולריים ראשיים משרירי השלד בעכברים. הפרוטוקול משתמש בפרידה אימונומגנטית CD31 ומייצר טוהר גבוה לחקר אינטראקציות שריר-אנדותל ומחלות אוטואימוניות שריריות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי "אחר Kröner-Fresenius-Stiftung" (2018_A03 ל יח), "חדשני Medizinische Forschung (קרן המטבע) מינסטר" (I-RU211811 כדי TR) וקרן מחקר גרמני (DFG, מוסד 2105/27-1, לי 3283/5-1 ולי 3283/6-1 כדי SGM). תמונות מאויר שסופקו על-ידי האיקה בלום.

<ol><li>Rodrigues, S. F., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+cells+and+endothelial+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Blood cells and endothelial barrier function.</a> Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720(2015).</li>
<li>Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell functions.</a> Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).</li>
<li>Pierce, R. W., Giuliano, J. S. Jr, Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+function+and+dysfunction+in+critically+ill+children%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children.</a> Pediatrics. 140 (1), Epub 2017 Jun 1 (2017).</li>
<li>Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transmembrane+tight+junction+protein+selectively+expressed+on+endothelial+cells+and+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).</li>
<li>Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+new+conditionally+immortalized+human+skeletal+muscle+microvascular+endothelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line.</a> Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).</li>
<li>Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natalizumab+treatment+for+multiple+sclerosis%3A+Updated+recommendations+for+patient+selection+and+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring.</a> Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).</li>
<li>Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+pericyte+subtypes+differ+in+their+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential.</a> Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).</li>
<li>Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+murine+brain+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52204(2014).</li>
<li>Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+expression+of+occludin%2C+zona+occludens-1%2C+and+junction+adhesion+molecule+A+in+the+duodenum%2C+ileum%2C+colon%2C+kidney%2C+liver%2C+lung%2C+brain%2C+and+skeletal+muscle+of+C57BL+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice.</a> Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).</li>
<li>Frye, C. A., Patrick, C. W. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology+-+Animal%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 38 (4), 208-212 (2002).</li>
<li>Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+adenosine+formation+and+release+by+freshly-isolated+vascular+endothelial+cells+from+rat+skeletal+muscle%3A+Effects+of+hypoxia+and%2For+acidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).</li>
<li>Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Isolation of microvascular endothelial cells.</a> Bio-protocol. 8 (12), (2018).</li>
<li>Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+isolation%2C+culture+and+transplant+of+mouse+skeletal+muscle+derived+endothelial+cells+with+angiogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential.</a> PLoS One. 3 (3), e0001753(2008).</li>
<li>Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+vascularized+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Generation of human vascularized brain organoids.</a> Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).</li>
</ol>

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Microvascular תאי אנדותל לספק פונקציות מכשול ברקמות כל התוצאות שלהם לקוי במחלה של האיברים הקשורים 3. יתר על כן, מחקרים ייחודיים של microvascular EC יכול לסלול את הדרך עבור אסטרטגיות טיפוליות חדשות. לכן, הבנה עמוקה יותר של microvascular EC תפקוד בתנאים פיזיולוגיים, הקשורים pathophysiological הוא עניין מדעי רב. אפנון של אינטראקציה ליקוציט/אנדותל משמש בהצלחה לטיפול בחולי טרשת נפוצה עם natalizumab, נוגדנים אשר מונע הידבקות לימפוציט וע י גלגול 6. עם זאת, myopathies שונות כולל את...

דרך מחזור הדם, תאים ואיברים, מסופקים עם חמצן, מצעים, מולקולות אחרות הדרושות. מחלף זה מתרחש בנימים, בכלי הדם הקטנים. נימים נוצרות על ידי שכבת תאי אנדותל הפנימי (EC) שלמות אשר נשאר תנאי לביצוע מוצלח ההסדרה של הומאוסטזיס שריר בין המרחב קרישה תוך-כלית, interstitial. כדי להבטיח מעבר סלקטיבי של גורמים מסיסים ותאים, EC מהוות של טפט מחוברים על ידי חזק צמתי adherens 1. מלבד תפקידה כמחסום חומרים מזינים או מוצרים מטבולית, EC לווסת את גיוס לויקוציטים בתהליכים דלקתיים. נזק דלקת או רקמה מוביל למעלה-רגולציה של מולקולות אדהזיה על פני EC ו ייצור של נוגדנים הקלת ליקוציט המצורף, גלגול לתוך רקמת המטרה 2. כתוצאה מכך, EC אנושות מעורבים בוויסות תהליכים דלקתיים כגון ההגנה נגד פתוגנים או רקמות תיקון.
תפקוד EC הוא ישירות הקשורים עם מחלות לב וכלי דם, אי ספיקת כליות כרונית, פקקת ורידים חמורה הפתוגן זיהומים. יתר על כן, EC כמעט תמיד מעורבים מחלת חיסון עצמי ייחודיים כגון סוכרת או טרשת נפוצה 3. הפונקציה מחסום בין זרם הדם ואיברים ולכן נשלטת על ידי המרצד מתואמת סוגי תאים שונים. בתאי שריר השלד microvascular אנדותל (MMEC) יחד עם תאי שריר, fibroblasts ו pericytes יוצרות יחידה פונקציונלית, יחידת"myovascular" (MVU). לכן, תפקוד MVU עשוי לשחק תפקיד קריטי הפתופיזיולוגיה של myopathies. אולם, הבנה עמוקה יותר של מנגנונים רגולטוריים אלה עדיין נעדר, כיום מונע זיהוי מטרות חדשות, בדחיפות, טיפולי myopathies.
כדי לחקור את המנגנונים הפיזיולוגיים ואת pathophysiological מורכבים, מודלים בעלי חיים משמשים. עם זאת, מודלים במבחנה מציעים היתרון להתמקד על נושא מעניין על ידי למעט מגוון גורמים מבלבלים. לחקור תהליכי הפריה זה הכרחי בידוד תאי יסוד טהור בר -קיימא. בניגוד שורות תאים, התאים הראשי שבודדו מבעלי הטרנסגניים מאפשרים לחקור את ההשלכות של שינויים גנטיים במבחנה.
. הנה, שיטה לבודד את ראשי MMEC מאתר מתואר באמצעות דיסוציאציה מכני, אנזימטי ואחריו מגנטי תא מופעל מיון טכניקות (MCS) לטיהור. למטרה זו, משמשים beads מגנטי נגד סמני פני שטח מסוים. טסיות תא אנדותל אדהזיה מולקולה-1 (PECAM1, CD31), מתבטאת בעיקר על EC והוא יכול לשמש כדי להעשיר את סוג התא. כדי להצדיק טוהר גבוהה תא, תאים ממוצא hematopoietic יוצאו על ידי בחירה שלילי עבור סוג קולטן טירוזין phosphatase חלבון C (PTPRC, CD45). בהמשך, מוצגים פקדים איכות, טיפוח של MMEC מאתר ראשי, יישומים פוטנציאליים, מגבלות, כמו גם שיקולים מיוחדים.

<table><tbody><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Fisher</td><td>25200-056</td><td>מוכן לשימוש</td></tr><tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> ACK <td>150 מ"מ NH4Cl, 10 מ"מ KHCO3, 0.1 mM EDTA במים ב-pH של 7.3</td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD31-FITC (clone MEC13.3)</td> <td>Biolegend</td><td>102506</td><td>בקרת איזוטיפ: FITC Rat IgG2a, &kappa; איזוטייפ Ctrl</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD45-PE (שיבוט 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103106</td><td>בקרת איזוטיפ: PE חולדה IgG2b, &kappa; איזוטיפ Ctrl</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>CD31 עכבר MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-418</td><td></td></tr><tr><td>CD45 עכבר MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase-Dispase</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td>קולגנאז מ-V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa</td></tr><tr><td>Corning Costar TC-Treated TC-Multiple 6-Well Plates</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-Conjugated Anti-RG IgG anti-rat</td><td>dianova</td><td>712-166-153</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (ProLong Gold antifade Reagent with DAPI)</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Desoxyribonuclease</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4513</td><td>Deoxyribonuclease I מלבלב בקר</td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonat מים מטופלים</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9916</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, המכיל תוסף גלוטמין ופירובט</td><td>Thermo Fisher</td><td>31966-021</td><td>מתחמם עד 37 מעלות; C לפני השימוש</td></tr><tr><td>dNTP Mix (10 מ"מ)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>R0192</td><td>1 מ"ל</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>צינורות FACS</td><td>Sarstedt</td><td>551,579</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 &mu; m מסננת תאים</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>FC מאגר</td><td></td><td></td><td>0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA</td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>סרום עגל עוברי</td></tr> צבע <tr><td>כדאיות לתיקון eFluor780</td><td>Thermo Fisher</td><td>65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים (משוננים, ישרים, 12 ס"מ)</td> <td>Fine Science Tools</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים (משוננים, ישרים, 12 ס"מ)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11009-13</td><td></td></tr><tr><td>מזרק אינסולין 100 סולו 1 מ"ל (אומניפיקס)</td><td>בראון</td><td>9161708V</td><td></td></tr><tr><td>עמודות מגנטיות גדולות (עמודות LS)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>עבור CD45-MACS-step</td></tr><tr><td>MCS buffer</td><td></td><td></td><td>0.5% BSA, 2 mM EDTA ב-PBS ב-pH של 7.2</td></tr><tr><td>עמודה מגנטית בינונית (עמודת MS)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>עבור CD31-MACS-step</td></tr><tr><td>מים ללא נוקלאז</td><td>תרמו פישר</td><td>R0581</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td></td><td>פוספט חוצץ מלח, מוכן לשימוש</td></tr><tr><td>מאגר PCR (5x)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>EP0742</td><td>בערכה עם הטרנסקריפטאז ההפוך</td></tr><tr><td>Pecam1 חולדה &alpha;-עכבר</td><td>SantaCruz</td><td>Sc-52713</td><td>100 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>תאי שריר עכברים ראשוניים</td><td>celprogen</td><td>66066-01</td><td></td></tr><tr><td>פריימר Cdh15 (M-Cadherin)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Mm00483191_m1</td><td>FAM עם תווית</td></tr><tr><td>פריימר Cldn5 (קלודין-5)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Mm00727012_s1</td><td>FAM עם התווית</td></tr><tr><td>Primer Ocln (occludin)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Mm00500912_m1</td><td>FAM שכותרתו</td></tr><tr><td>Primer Pax-7</td><td>Thermo Fisher</td><td>Mm01354484_m1</td><td>FAM שכותרתו</td></tr><tr><td>Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>Mm00493699_m1</td><td>FAM שכותרתו</td></tr><tr><td>Primer 18s rRNA (בקרה אנדוגנית Eukaryotic)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>4310893E</td><td>VIC עם תווית</td></tr><tr><td>qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>K0231</td><td>2 x 1,25 מ"ל; עבור 200 תגובות כל אחת</td></tr><tr><td>תערובת אקראית של פריימר חד-גדילי</td><td>Thermo Fisher</td><td>SO142</td><td>Random Hexamer Primer</td></tr><tr><td>Reverse Transcriptase (200 U/&mu; L) + מאגר PCR (5x)</td> מעכב Rnase <td>Thermo Fisher</td><td>EP0742</td><td></td></tr><tr><td>(40 U/&mu; L)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>מספריים (קצה חיתוך 23 מ"מ, חד / חד)</td> <td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td></td></tr><tr><td>מספריים (קצה חיתוך 42 מ"מ, חד / קהה)</td> <td>Fine Science Tools</td><td>14001-13</td><td></td></tr><tr><td>פתרון ציפוי מהיר</td><td>PeloBiotech</td><td>PB-LU-000-0002-00</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של תאי אנדותל microvascular ראשי שריר השלד מאתר

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

תאי אנדותל של הנימים שרירי השלד (microvascular אנדותל תאי שריר, MMEC) לבנות את המכשול בין זרם הדם שרירי השלד ויסות חילופי נוזלים, חומרים מזינים, כמו גם את התגובה החיסונית נגד זיהומיות סוכנים על ידי שליטה נדידת תאים חיסוניים. עבור פונקציות אלה, MMEC יוצרים פונקציונלי "יחידה myovascular" (MVU), עם סוגי תאים נוספים, כגון fibroblasts, pericytes, תאי שריר השלד. כתוצאה מכך, תפקוד MMEC ולכן MVU את תורמת למגוון עצום של myopathies. אולם, מנגנוני הרגולציה של MMEC על בריאות ומחלה נותרו מספיק מובן, הבהרה שלהם מקדים טיפולים פרטניים יותר myopathies. בידוד של חקירה מעמיקה של פונקציות MMEC העיקרי בהקשר של MVU עשוי להקל על הבנה טובה יותר של תהליכים אלה.
מאמר זה מספק פרוטוקול כדי לבודד MMEC מאתר העיקרי של שריר השלד מאת דיסוציאציה מכני, אנזימטי כולל טיהור והשלבים תחזוקה תרבות.

יום אחד לאחר בידוד, MMEC מאתר ראשי, ממסר תאים אחרים טופס וקונצרנים, לדבוק התחתון של תרבות מנות (איור 1A יום 1). יום 7 ואילך ניתן לצפות תאים שטוח וארוך. זיהום של אחרים, בעיקר ספרואיד תאים, עם זאת, עדיין גלויים (איור 1A יום 7). לכן, עוד מחזור של CD31 חיובי בחירת דרך MCS נדרש. בעתיד, MMEC מאתר הראשי להתרבות על צפיפות של-80-90%. על הנהרות הם יוצרים בדרך כלל חד שכבתי שאינם חופפים של תאים longitudinally מיושר (<strong class="x...

Microvascular תאי אנדותל של שרירי השלד (MMEC) לעצב את הדופן הפנימית של שריר נימים ולווסת את שניהם, חילופי נוזלים/מולקולות והעברה של תאים (חיסוניים) בין רקמת שריר, דם. בידוד של MMEC מאתר ראשי, כפי שמתואר כאן, מאפשר מקיף חקירות במבחנה של יחידת"myovascular".

בידוד של תאי אנדותל Microvascular ראשי שריר השלד מאתר

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

פרוטוקול זה מתאר טכניקת פלטפורמה לבידוד תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים משרירי השלד. תאים אלה יכולים לשמש, למשל, כדי לקבל תובנות נוספות על תפקודי מחסום שריר הדם. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שניתן לבודד תאים אנדותל microvascular ראשי עם טוהר גבוה.טכניקה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מחלות שרירים מתווכות במערכת החיסון כגון האינטראקציה בין תאים שרירים אנדותל בבריאות ומחלות. ראשית, הכינו את כל הפתרונות הדרושים וצלחות שש בארות כמתואר בפרוטוקול. כדי להתחיל את ההליך המעשי, להשיג זוג מספריים חדים / קהים כירורגית, זוג מספריים חדים / חדים כירורגיים, ומדפים ישרים ומעוקלים.לחטא את כל המכשירים הכירורגיים עם 70% אתנול. מקם עכבר זכר בוגר המתת ים על גבו ולהרים את הרגליים עם 70% אתנול. בעזרת המספריים הכירורגיים החדים/קהים, יש לנתק כל רגל שלמה על-ידי חיתוך במפרק הירך.מניחים את גפיים בצלחת תרבות תא סגור. מעבירים את המנה למכסה המנוע של לזרימת למינאר סטרילית. השתמש מספריים חדים מדפים מעוגלים לחתוך את העור פתוח מן הירך לקצה של בוהן.השתמש במטחנים ישר להחזיק את בוהן או כרית כף הרגל תוך שימוש במקלפים מעוקל לקלף את העור מן בוהן אל הירך. כדי לבודד את השרירים quadriceps femoris, לחתוך את הגיד מן הברך, ולנתק את השריר לאורך עצם הירך אל הירך. נתק את גיד אכילס כדי לבודד את triceps השלד והשריבה surae.לאחר מכן, לחתוך לאורך השוקה לאפוסה popliteal ולהסיר את השריר. כדי להסיר גידים אשר לא ניתן לנתק, להחזיק את השרירים עם מדפים מעוגלים לחתוך כל גיד מתאים. הוסיפו 2, 445 מיקרוליטרים של פתרון עיכול מוכן לצלחת תרבות תאים טרייה עם תווית וקובעים את המשקל.מעבירים את כל חתיכות השרירים לצלחת זו. לאחר מכן, לקבוע את המשקל. ההבדל בין שני הערכים הנמדדים מספק את המשקל היבש של רקמת השריר אשר לא יעלה על גרם אחד.באמצעות מספריים חדים כירורגית, לחתוך את כל רקמת השריר לחתיכות קטנות. דגירה ההשעיה רקמה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך 1.5 שעות, הקפד לערבב את ההשעיה בזהירות עם מזרק אינסולין מיליליטר כל 20 דקות במשך כחמש דקות. לאחר הדגירה, להעביר את ההשעיה מסננת ניילון 70 מיקרומטר להציב על צינור 50 מיליליטר שכותרתו ולאסוף את הזרימה דרך.לשטוף את מסננת התא עם שמונה מיליליטר של DMEM ולאסוף את הזרימה דרך. אם החלקים מחברים את מסננת, תן שימוש חוזר בפתרון המנותק. השליכו את מסננת התאים וצנטריפוגה את ההשעיה בכבידה של פי 300 וב-20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.בזהירות להסיר את supernatant ו resuspend גלולת התא במיליליטר אחד של מאגר אשלגן אמוניום כלורי lysing עבור תזה של כדוריות דם אדומות. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות. לאחר מכן, הוסף תשעה מיליליטר של DMEM המכיל 10%FCS כדי לעצור את התגובה.העבר את ההשעיה התא לצינור 15 מיליליטר. לאחר מכן, השתמש בתא ספירת תאים של Neubauer כדי לקבוע את מספרי התאים. כדי להתחיל לרוקן את התאים החיוביים CD45, צנטריפוגה ההשעיה ב 300 פעמים כבידה בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.הסר את העל-טבעי לחלוטין ולחץ מחדש על גלולת התא ב-90 מיקרוליטרים של מאגר MCS. מוסיפים 10 מיקרוליטרים של חיידקי CD45 ומערבבים את ההשעיה. דגירה במקרר בארבע עד שמונה מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של מאגר MCS. צנטריפוגה בכבידה של פי 300 וב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הסר את העל-טבעי לחלוטין ולחץ מחדש על התאים ב- 500 מיקרוליטרים של מאגר MCS.מקם עמוד מגנטי גדול בשדה המגנטי של המפריד. שטפו את מאגר העמודות בשלושה מיליליטר של מאגר MCS. לאחר מכן, מניחים צינור חרוט 15 מיליליטר מתחת לעמודה כדי לאסוף את הזרימה דרך.החל את כל ההשעיה התא על העמודה ולתת לו לזרום דרך לחלוטין. לשטוף את העמודה שלוש פעמים על ידי הוספת שלושה מיליליטר של מאגר MCS לתוך המאגר עבור כל שלב כביסה והמתנה עד המאגר של העמוד ריק לפני תחילת שלב הכביסה הבא. אסוף את התאים ללא תריס העוברים בעמודה לשימוש בשלבי הפרדה נוספים.כדי להתחיל לצבור תאים חיוביים ל- CD31, השתמש בתא ספירת תאים של Neubauer כדי לקבוע את מספרי התאים. לאחר מכן, צנטריפוגה התאים ללא תכלית ב 300 פעמים כוח הכבידה בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. הסר את העל-טבעי לחלוטין ולחץ מחדש על גלולה ב 90 microliters של מאגר MCS.מוסיפים 10 מיקרוליטרים של חיידקי CD31 ומערבבים את כל ההשעיה. דגירה במקרר בארבע עד שמונה מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של חיץ MCS וצנטריפוגה ב 300 פעמים כוח הכבידה בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.הסר את העל-טבעי ולחץ מחדש על התאים ב- 500 מיקרוליטרים של מאגר MCS. מקם את העמודה המגנטית הבינונית בשדה המגנטי של המפריד. שטפו את העמודה ב-500 מיקרוליטרים של מאגר MCS.לאחר מכן, מניחים צינור חרוט 15 מיליליטר מתחת לעמודה כדי לאסוף את הזרימה דרך. החל את ההשעיה של התא כולו על העמודה ולתת לו לזרום לחלוטין דרך. שטפו את העמודה שלוש פעמים על-ידי הוספת 500 מיקרוליטרים של מאגר MCS למאגר עבור כל שלב כביסה, והמתינו עד שהמאגר של העמוד יתרוקן לפני שתתחילו את שלב הכביסה הבא.תאים ללא שם העוברים בעמודה מייצגים את השבר CD45 שלילי, CD31 שלילי. אחסן אותם לפקדי איכות נוספים. לאחר מכן, הסר את העמודה מהמפריד והצב אותה על צינור איסוף מתאים.פיפטה שני מיליליטר של מאגר MCS על העמודה. מיד לדחוף את הבוכנה לתוך העמודה כדי לשטוף את התאים המסווים מגנטית. שבר CD45 שלילי וחיובי זה של CD31 מייצג את מחשבי ה- ECs המועשרים הראשיים של Murine.צנטריפוגה ההשעיה התא ב 350 פעמים כבידה ב 20 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. הסר את העל-טבעי לחלוטין ולחץ מחדש על התאים במיליליטר אחד של מדיום תא אנדותל. מעבירים את התאים ל הבאר אחת של צלחת תרבות מצופה שש בארות המכילה מיליליטר אחד של מדיום תא אנדותל.לטיפוח, חגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני באינקובטור סטרילי, הקפדה לרענן את המדיום כל יומיים עד שלושה ימים. כאשר התאים הם ב 80 עד 90%confluence, לשטוף כל גם המכיל תאים פעמיים עם שני מיליליטר של PBS בשני שלבי כביסה רצופים. לאחר מכן, להוסיף 800 microliters של פתרון EDTA טריפסין לכל באר דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני באינקובטור סטרילי במשך שלוש עד חמש דקות.לאחר מכן, הוסף 1, 200 מיקרוליטרים של DMEM המכילים לפחות 10% FCS כדי לעצור את הפעילות האנזימטית. צנטריפוגה בכבידה של פי 350 וב-20 מעלות צלזיוס לחמש דקות. לאחר מכן, לצבור את התאים CD31 כפי שתואר קודם לכן כדי להגדיל את הטוהר.השתמש בשדה בהיר או במיקרוסקופ חוזה פאזה סטנדרטי עם הגדלה של 20% וצמצם מספרי של עדשה 0.35 כדי לצפות בהתכנסות התאים. במחקר זה, תאי הדם המיקרו-וסקולריים העיקריים של שריר המורין מבודדים. יום אחד לאחר הבידוד, MMECs מורין ראשוני שאריות תאים אחרים יוצרים קונגלומרטים לדבוק בתחתית מנות תרבות.מהיום השביעי ואילך, תאים שטוחים ומוארכים ניתן לראות, עם זאת, זיהום של תאים אחרים, בעיקר כדורית עדיין גלוי. לכן, מחזור נוסף של בחירה חיובית CD31 באמצעות MCS נדרש. להלן, MMECs מורין הראשי להתרבות לצפיפות של כ 80 עד 90% על confluence, הם בדרך כלל יוצרים מונוליאר לא חופף של תאים מיושרים אורך.התפשטות מפסיקה עם ההתכנסות עקב עיכוב מגע. בקרת איכות באמצעות ציטומטריית זרימה מציגה ערכים הן עבור הכדאיות והן עבור טוהר הנעים סביב 70% כל אחד עבור תאים מיד לאחר הבידוד. תאים המעובדים לאחר בחירה חיובית נוספת של CD31 באמצעות MCS מציגים ערכים מספקים לטוהר ולכדאיות, החל מ- 95% כל אחד.תאים שהושגו נחקרים לאחר מכן על ביטוי הגנים של גנים סמן תא לווין שריר מזווג חלבון תיבת 7 ו M-cadherin על רמת mRNA על ידי PCR כמותי. כצפוי, רק השבר CD45 שלילי, CD31 שלילי, כמו גם תאי שריר מורין ראשוניים מבודלים מבוטא חלבון תיבת 7 ו- M-cadherin, ואילו CD45 שלילי, CD31 חיובי MMECs מורין העיקריים הם שליליים עבור סמנים אלה. לאחר השלב השני של CD31 MCS, qPCR משמש להערכת הביטוי של חלבוני צומת הדוקים ב- MMECs מורין ראשוניים.MMECs מורין ראשי נראים להביע רמות גבוהות של קלודין-5, occludin, ו זונולה occludens-1, ואילו PMMC רק להראות ביטוי נמוך של זונולה occludens-1. טכניקה זו יכולה להתבצע בחמש עד שש שעות. בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון בדיקות הגירה או ניסויי לחץ בהגיה נמוכה כדי לענות על שאלות נוספות.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל לבודד תאים אנדותל microvascular ראשוני שרירי השלד על ידי מכונאי דיסוציאציה אנזימטית ומיון תאים מגנטיים.

isolation-primary-murine-skeletal-muscle-microvascular-endothelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מתארים פרוטוקול לבידוד והתרבות של Murine לתאי אנדותל ריאתי. שיטה זו כוללת מכונאי דיסוציאציה האנזימטית רקמת הריאות, כמו גם תהליך צעד 2-טיהור באמצעות אנטי PECAM-1 ואנטי ICAM-2 נוגדנים מצומדות כדי חרוזים מגנטיים, אשר מייצר אוכלוסיה טהור תא האנדותל של כלי הדם בעיקר מקור.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

אנו מציגים הכנה להדמית מניפולציה סידן איתות בהאנדותל כלי הדם מקומי, ללא פגע. צינורות אנדותל מבודדים טריים מעורקי התנגדות עכבר אספקת שרירים שלד לשמור במורפולוגיה vivo ואיתות דינמית בתוך ובין תאי שכנים. ניתן להכין צינורות אנדותל מmicrovessels של רקמות ואיברים אחרים.

בידוד של כלי הדם האנדותל צינורות מעורקי עכבר התנגדות

הבידוד והתרבות של אוכלוסייה טהורה של תאי לווין שקטים, אוכלוסיית תאי גזע שריר, הוא חיוני להבנה של ביולוגיה שרירים תאי גזע והתחדשות, כמו גם בתאי גזע להשתלה עבור טיפולים בניוון שרירים ומחלות ניווניות אחרות.

בידוד, תרבות והשתלה של תאי לווין שריר

כלי דם בתוך אוכלוסיות אנושיות נמל שריר שלד כמה רבת שושלת המבשרת כי הם אידיאליים עבור יישומי משובי. שיטת בידוד זה מאפשרת טיהור בו זמני של שלוש אוכלוסיות תאי מבשר multipotent בהתאמה משלוש שכבות מבניות של כלי דם: תאי myogenic אנדותל מאינטימה, pericytes מתקשורת, ותאי adventitial מadventitia.

בידוד של דם המופק מכולים multipotent מבשרים משרירי שלד אדם

היכולת לבודד תאי אנדותל של מסתמי הלב (VECs) היא קריטית להבנת מנגנוני התפתחות, תחזוקה ומחלות של מסתמים.  כאן אנו מתארים את הבידוד של VECs מעכברי Tie2-GFP עובריים ובוגרים באמצעות FACS שיאפשר מחקרים הקובעים את תרומתם של VECs בתהליכי התפתחות ומחלות.

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח (BMEC) מחוברים זה לזה על ידי חלבוני צומת ספציפיים היוצרים מחסום מווסת מאוד המפריד בין הדם למערכת העצבים המרכזית (CNS), מה שנקרא מחסום דם-מוח (BBB). הבידוד של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים במוח העכברים, כפי שנדון בפרוטוקול זה, מאפשר מחקרי מבחנה מפורטים של BBB.

בידוד של תאים הראשוניים Murine מוח כלי הדם האנדותל

תאי האנדותל של כלי הדם ממלאים תפקיד משמעותי בהפרעות לב וכלי דם חשובות רבות. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה לבידוד והרחבה של תאי אנדותל מאבי העורקים של העכבר ללא שימוש בציוד מיוחד. הפרוטוקול שלנו מספק אמצעי יעיל לזיהוי מנגנונים בפיזיופתולוגיה של תאי אנדותל.

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את טכניקות בידוד וההתרבות של תאי שריר חלק בכלי דם בעכברים עיקריים (VSMCs) מהמחזור כלילית. לאחר VSMCs בודד, הם יכולים לשמש עבור טכניקות תרבות סטנדרטיות רבות.

בידוד של תאי שריר חלק Murine כלילית דם

עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול מבוסס FACS המאפשר בידוד קל בו זמנית של סוג I ו pericytes סוג II של שרירי השלד.

בידוד של סוג אני ו II סוג pericytes של עכבר שרירי השלד

במאמר זה, תאי אנדותל ריאתיים ראשוניים בודדו וגודלו בתרבית מעכברים ילודים.

בידוד תאי אנדותל ריאה ראשוניים של עכבר

פרוטוקול זה מספק שיטה סטנדרטית לבידוד והעשרת מיובלסטים ראשוניים משרירי השלד של עכברים בוגרים ויילודים באמצעות ניתוק רקמות, סינון רציף, ציפוי מוקדם ותנאי תרבית מוגדרים, המאפשר הקמה ותחזוקה של תרביות מיובלסטים שמקורן בתאי לוויין ליישומים ניסיוניים במורד הזרם.

בידוד תאי לוויין שריר השלד למחקרי מיוגנזה במבחנה

למד שיטה לבידוד תאי אנדותל מיקרווסקולריים ראשיים משרירי השלד בעכברים. הפרוטוקול משתמש בפרידה אימונומגנטית CD31 ומייצר טוהר גבוה לחקר אינטראקציות שריר-אנדותל ומחלות אוטואימוניות שריריות.

בידוד של תאי אנדותל Microvascular ראשי שריר השלד מאתר

גלה סרטונים נוספים