3D סריקה תלת-ממדית מיקרומעגלים ותמונות המוח המקברקנה בתלת-ממד הטבעה בפרוטוקול החופף
12 במאי 2019
מאמר זה מציג פרוטוקול ניסיוני באמצעות טכנולוגיית סריקה תלת-ממדית המגשר על שני סולמות מרחביים: הסולם המרחבי המקסקופי של אנטומיה מוחית שלמה המועלת על-ידי MRI ב-> 100 יקרומטר ובקנה המידה המרחבי המיקרוסקופי של הפצות עצבי באמצעות כתמים אימונוהיסטוכימיה ומערכת מערך רב אלקטרודה ושיטות אחרות (~ 10 μm).
פרוטוקול זה הוא הראשון להציג טכנולוגיית סריקה תלת-ממדית בתחום המחקר האנטומי, במיוחד הנוירואנטומי, והשיג ביצועים חופפים מדויקים ביותר. הפרוטוקול הנוירו-הטבעה של 3D חופף, או פרוטוקול נוירו תלת-מימדי, מטמיע שקעים סטריליים בקנה מידה זעיר בתמונות מוח בקנה מידה מאקרו, ומגשר על קשקשים מרחביים שונים אלה בצורה חלקה. אנחנו גם צריכים ליישם את פרוטוקול נוירו 3D על MRIs אנושיים ומוח שלאחר המוות.
החפיפה מאפשרת לנו לזהות דפוסי ניגודיות MRI ידועים הקשורים למחלות. מערכות סריקה תלת-מימדיות רגישות למים המקיפים את האורגניזם הביולוגי המופק, ולכן חיוני לנגב את המים בזהירות רבה. יתר על כן, ההליך חייב להתבצע מהר ככל האפשר.
התחל הליך זה עם הכנת עכבר, כמו גם רכישות MRI והכנות ציוד כמתואר בפרוטוקול הטקסט. ביום השני, חותכים את הקרקפת של עכבר שהומת בעבר לאורך התפר הסגיטלי באמצעות מספריים כירורגיים. השתמש במספריים כירורגיים כדי לחתוך את הגולגולת בכיוונים אלכסוניים מנקודת lambda לנקודה קצת מול bregma.
לאחר מכן, לקלף בעדינות את הגולגולת מהמוח באמצעות פינצטה מעוגלת. הרם את המוח עם מרית והעבר אותו לצלחת פטרי עם פתרון חיתוך קר כקרח. באמצעות פצצת גז חיצונית עם מהירות משאבה מסתובבת מבוקרת, אוויר זרימה המכיל 95%חמצן ו-5% פחמן דו-חמצני כדי ליצור בועות קטנות בתת פתרון החיתוך הקר כקרח.
לאחר 1-2 דקות, לשים את המוח על בד מיקרופייבר אשר פני השטח מכוסה מעט על ידי מנון קמח. יש לנגב בעדינות את הנוזל מפני השטח של המוח באמצעות מטלית המיקרופייבר. שים את המוח, עם ההיבט הגבי שלו למעלה, על דוכן הדגימה.
לאחר מכן, מקם את דוכן הדגימה במרכז הסובב האוטומטי. להכהות את החדר במהלך סריקת 3D ולבצע סריקה 3D על הסובבן. כדי לבדוק אם הסריקה תלת-מימדית פועלת היטב, לחץ על סריקה תלת-מימדית על-ידי בחירת הזווית בין שתי יריות כ- 22.5, זווית ההתחלה כאפס והזווית הסופית כ- 360.
מעבירים את המוח לצלחת פטרי ומבעבעים את המוח בתת פתרון החיתוך למשך כ-10 שניות. חותכים את המוח לשני בלוקים באמצע מישור הקורונה, באמצעות אזמל. לאחר מכן, להעביר את שני המוח בלוקים בעדינות אל פני השטח השטוחים באמצעות מרית כירורגית.
חבר את גושי המוח של בסיס בלוק המוח באמצעות דבק מיידי. יש לנגב את הנוזל בעדינות ובזהירות מפני השטח של המוח תוך שעה עד שתי דקות, באמצעות מטלית המיקרופייבר. לאחר מכן, בצע שוב סריקה תלת-מימדית.
חבר להב למחזיק הלהב של הרטט. חבר את הסרט השחור המכסה את מרכז בסיס בלוק המוח למרכז שלב החיתוך עבור רטט. יוצקים פתרון חיתוך לתוך שלב החיתוך ולהגדיר את שלב החיתוך על הרטט.
כוונן את מהירות החיתוך ואת משרעת. הפוך שתיים עד חמש פרוסות coronal של 300 מיקרון עבה משני בלוקים המוח. שמור על הפתרון בשלב החיתוך מבעבע במידת האפשר.
מטב את מהירות החיתוך, התדירות משרעת הרטט של המערכת על ידי הגדרת אותם כמו 12.7 מילימטרים לדקה עבור המהירות, 87 כדי 88 הרץ עבור התדר, ו 0.8 כדי 1.0 מילימטרים עבור רוחב הנדנדה. בעת חיתוך פרוסות המוח, רשום את הקואורדינטות הפרוסות בתבנית, כולל הקואורדינטות הקדמיות-אחוריות, חצי הכדור ותנאים אחרים. מעבירים בעדינות את פרוסות המוח לתוך מלאה ב- ACSF מחומם מראש באמצעות פיפטה פלסטיק עבה.
להדק את פרוסות המוח בפקק בערך 34 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. במהלך תקופה זו, לבצע סריקה 3D של בלוקים המוח הנותרים על שלב החיתוך. כעת, הגדר מערך רב-אלקטרוני, או שבב MEA, ביחידת הקלטה.
חבר את השבב למשאבה פריסטואלית באמצעות שני צינורות. השתמש בצינור אחד כדי להנחות את אותו ACSF לתוך שבב MEA ואת הצינור השני כדי להנחות את ACSF מתוך שבב MEA. חבר שני מחטים, מחוברים בטיפים של שני הצינורות, לראש הקיר של שבב MEA.
לתקן את עמדותיהם עם הטיפים שלהם בעקבות הקיר הפנימי של שבב MEA. הגדר את קצב הזרימה של ה- ACSF ל- 4.1 סל"ד. בצע עיבוד נתוני MRI כדי לחלץ אמצעי אחסון קליפתיים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
כדי לבצע עיבוד תמונת MRI, הורד את התוכנה החינמית של כלי פריסה תלת-מימדי. פתח את תמונות MR של המוחות שחולצו שהופקו באמצעות עיבוד עוצמת הקול ומודולים עורך בכלי פריסה 3D. שנה את המצב מעורך לעיבוד עוצמה ולחץ על לחצן יעד כדי לגרום לתמונה של המוח להגיע למרכז המסך.
בחר את מצב המוח MRT-2 וכוונן את ערכי הסף על-ידי הזזת סרגל ההזזה. לאחר מכן, חזור מעיבוד עוצמת הקול לעורך ולחץ על לחצן אפקט הסף. החל את התווית 41, קליפת המוח.
לאחר מכן, שמור את נתוני פני השטח של המוח כקובץ STL על-ידי שינוי תבנית הקובץ מ- VTK ל- STL ברשימה לביצוע של הטופס. בצע ליבה אוטומטית בין שמונה או 16 תמונות שצולמו משמונה או 16 זוויות שונות בתוך רצף של סריקה כדי לתקן אי-התאמות קטנות. לשם כך, לחץ על רישום כללי הכלול באפשרות היישור וכלול את התמונות.
חזור על סריקות מזוויות שונות כדי להשיג את כל משטח המוח. אם השילוב בין תמונות שנסרקו מזוויות שונות לא הצליח, לחץ על יישור ידני ובחר זוג תמונה קבועה ותמונה נעה. התחל את היישור הידני של התמונות על-ידי בחירת שלוש או ארבע נקודות נפוצות בתמונות שונות.
לאחר מכן, לחץ על אישור. אלגוריתם המיטוב הוא אלגוריתם הנקודה הקרובה ביותר ואינו כולל עיוות לא ליניארי. צור רשת שינוי של כל התמונות המיושרות על-ידי בחירת כל התמונות ולחיצה על לחצן יצירת רשת שינוי. לאחר מכן, בחר באפשרות , אובייקט אמנותי קטן, כדי לקבל את רשת שינוי ברזולוציה הגבוהה ביותר.
שמור את התמונה כ- STL בינארי או בתבנית ASCII. עכשיו, לפתוח את משטח MRI ולמזג אותו עם משטח סריקה 3D באמצעות תוכנת עיבוד פני השטח. בצע תהליך יישור ידני כבעבר.
לאחר מכן, שמור שוב את תמונות המשטח המרכזיות האלה. במידת הצורך, נקה את נתוני פני השטח הבודדים על-ידי מחיקת רעשים קטנים המקיפים את אזור המוח, במיוחד במקרה של נתוני ה- MRI, ועל-ידי מילוי חורים כלשהם, במיוחד במקרה של נתוני הסריקה תלת-מימדית. לבסוף, פתח את נתוני פני השטח באמצעות תוכנה לניתוח נתונים כגון MATLAB.
צור והערך את ההיסטוגרמות של המרחקים המינימליים בין שני המשטחים. מרחקים הוערכו בין משטחים קליפת המוח המיוצרים על ידי הפשטת נפח MRI ומשטחים המתקבלים סריקות תלת מימד של מוחות שחולצו. ערכי המצב של ההיסטוגרמה של המרחקים הם רק 55 מיקרון.
בנוסף, בעת צבירת ההיסטוגרמה מהנקודה שבה המרחק שווה לאפס, הערך המצטבר מגיע ל-90% מכלל מספרי הדגימה בכ- 300 מיקרון. ההיסטוגרמה הסופית של המרחקים בין שני משטחים הראתה שיא טיפוסי סביב 50 מיקרון. מנקודת מבט מקרוסקופית, ערך מצב זה תואם למגבלה הגיאומטרית, שהייתה 100 מיקרון מגודל הווקסל של MRIs.
נקודה זו מרמזת בעקיפין כי האלגוריתם החופף בין סריקת ה- MRI לסריקת תלת-מימד עבד מצוין, ושרמות הרעש של ה- MRI וסריקת תלת-מימד דוכאו כערך נמוך. פרוטוקול זה הוא הראשון לעלות באמצעות טכנולוגיית הסריקה לביו-אורגניזם. הטכנולוגיה נוצל במקור לדרישות הנדסיות גרין.
החלת טכנולוגיה זו על רפואה יכולה לענות על שאלות חדשות. לאחר סריקה תלת מימדית, אנו יכולים להשתמש בהקלטות גרם של תיקון קיר הדמיה סידן כדי לקבל ידע משלים במונחים של זמני ואת הרזולוציה spacial ומספרים לרישום של תאים. הביצועים החופפים המדויקים ביותר שפרוטוקול זה מספק יהפוך את הקשר החלק בין הסולם המרחבי האנטומי לסקאלה האפס מרחבית למציאותי יותר מבעבר.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול ניסוי חדשני המנצל טכנולוגיית סריקת תלת-ממד המשלבת גם אנטומיה של מוח מקרו-סקלטית המוצגת על ידי MRI (>100 μm) וגם התפלגויות עצביות מיקרו-סקלטיות באמצעות אימונוהיסטוכימיה ומערכי אלקטרודות מרובות (~10 μm). גישה זו מאפשרת מיפוי מדויק של מבנים עצביים והפונקציות המתאימות להם.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירו-אנטומיה
- דימות עצבי
- אלקטרופיזיולוגיה
רקע
- המחקר מתמקד בהתמודדות עם האתגר של גישור בין קנה מידה מקרוסקופי ומיקרוסקופי במחקר נוירו-אנטומי.
- הוא בוחן את האמינות והדיוק של טכנולוגיית סריקת תלת-ממד במיפוי מבני המוח.
- שיטה זו מאפשרת חקירה מפורטת של דפוסי ניגודיות MRI ידועים הקשורים למחלה.
- פרוטוקולים קיימים מורחבים כדי לכלול גם נבדקים חיים וגם דגימות לאחר המוות.
מטרת המחקר
- לפתח פרוטוקול תלת-ממד שמשובץ מידע מיקרו-סקלטי בתמונות אנטומיות מקרו-סקלטיות.
- להקל על זיהוי פתולוגיות הקשורות במבני מוח מובחנים.
- לשפר את המסגרת המתודולוגית למחקר נוירו-אנטומי.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הפלטפורמה העיקרית כוללת טכנולוגיית סריקת תלת-ממד המשולבת עם הדמיית MRI.
- המודל הביולוגי העיקרי כולל מוחות עכבר לאחר המוות, תוך שימוש ב-MRI ואימונוהיסטוכימיה.
- שלבים קריטיים כוללים טיפול זהיר במוח כדי למנוע זיהום ופרוטוקולי סריקה מדויקים.
- כרוכים בתנאי טמפרטורה ותמיסה ספציפיים במהלך הכנת הדגימות.
- תוכנת 3D Slicer משמשת לעיבוד תמונה ומיזוג נתוני משטח.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול משיג דיוק גבוה בקורלציה של נתונים אנטומיים ואלקטרופיזיולוגיים.
- הוא מאמת שיטות לזיהוי אזורי מוח הקשורים בהפרעות נוירולוגיות.
- שיפורים משמעותיים ברזולוציה המרחבית מצוינים בעת מיזוג טכניקות הדמיה מקרו ומיקרו.
- תובנות לגבי קישוריות עצבית ואזורים פונקציונליים משופרות באמצעות מתודולוגיה זו.
מסקנות
- מחקר זה מוכיח את הכדאיות של שימוש בטכנולוגיית סריקת תלת-ממד מתקדמת במחקר נוירו-אנטומי.
- שילוב של קני מידה מרחביים שונים מציע תובנות חדשות במנגנונים עצביים ודגמי מחלה.
- באופן כללי, השיטה משפרת את ההבנה של מערכת היחסים בין מבנה-תפקוד של המוח.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This protocol bridges macroscopic and microscopic brain imaging scales, enabling precise spatial correlation of neural structures. By integrating 3D scanning with MRI and electrophysiology, it supports target validation through improved anatomical fidelity in disease-relevant systems. The method enhances predictive confidence in preclinical models by reducing mechanistic ambiguity in multiscale brain mapping.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating micro-scale neuronal activity with macro-scale anatomical landmarks.
- Operational Value: Supports biological de-risking through accurate embedding of microconnectomes into whole-brain maps.
- Predictive Value: Improves target confidence by validating disease-associated MRI contrast patterns with microscopic resolution.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by preserving natural spiking in living brain cells during scanning.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through precise coregistration of MRI and 3D scan surfaces.
- Scalability: Highlights platform reuse potential via stable performance across individual mice and adaptability to human post-mortem tissue.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance by enabling identification of known MRI contrast patterns relating to pathology.
- Preclinical Alignment: Describes continuity from discovery through preclinical validation via multimodal data fusion.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports mechanistic de-risking by linking anatomical scales to functional electrophysiological readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions itself within the discovery continuum from early target validation to preclinical mechanistic studies, supported by its ability to integrate structural and functional data across scales.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing and pathway clarification through spatial correlation of micro- and macro-scale data.
- Screening: Describes assay readiness and reproducibility via quantitative distance histograms showing 50 μm mode error between modalities.
- Analytics: Highlights measurements and statistical outputs such as minimum distance histograms and accumulated frequency thresholds that enable cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity through disease-related MRI pattern detection in validated anatomical maps.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for multi-modal brain mapping across species and sample types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in multiscale neuroanatomical mapping.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability demonstrated through stable performance across individual mice.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk via improved target-to-mechanism linkage.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions enabled by anatomically precise functional mapping.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in neuroanatomy, 3D imaging, and electrophysiology.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including 3D scanners, MRI systems, vibratomes, and surface processing software.
- Cross-team standardization requirements for sample handling, scanning speed, and environmental control to prevent tissue degradation.
- Adaptation considerations across model systems, including transition from mouse to human post-mortem brains.
- Practical limitations supported by source material: sensitivity to water contamination and necessity for rapid processing to maintain sample integrity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:09
Brain Surface Scan, Slicing, and Multi-electrode Array Recording
5:23
MRI Image Processing to Stripe Cortical Surfaces
6:32
Preprocessing for 3D Scan Data and Coregistration of the MRI Surface and the 3D Scan Surface
8:18
Results: Overlapping Accuracy Between MRIs and 3D Scans
9:17
Conclusion
