Name: חוץ גופית במודל התמיינות תאי הזיכרון האנושי נורמלי B לתאי פלזמה חיים ארוכים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: חקור מודל תרבית חוץ גופית לתמיינות תאי B לתאי פלזמה באמצעות מערכת רב-שלבית עם כלים ביואינפורמטיים פתוחים. שיטה זו מאפשרת חקר שינויים תיעתיקיים ותכונות פנוטיפיות של תאי פלזמה בבני אדם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים צרפתית האינקה (Institut סרטן דו לאומית) המכון (PLBIO15-256), ANR (תיקו-דלג) וסרטן ITMO (מ מ & TT).

הפרוטוקול עוקב אחר ההנחיות בהתאם הצהרת הלסינקי והסכמה של מרכז בית החולים של אוניברסיטת מונפלייה עבור המשאבים הביולוגיים.
1. במודל חוץ גופית רגילה תאים פלזמה בידול
הערה: מחשבים נוצרים עד12,11,תרבות ארבעה שלבים13.
<ol><li>
תא b הגברה ובידול
	<ol>
<li>השתמש כדוריות הדם ההיקפיים של מתנדבים בריאים זיכרון תא B טיהור.</li>
		<li>לדלל 7.5 מ של דם עם 24.5 mL RPMI 1640 בינוני.</li>
		<li>להוסיף מ"ל של טמפרטורת החדר צפיפות הצבע (לדוגמה, Ficoll) צינור חרוטי סטרילי 50 מ. בעדינות מכסים את המילוי ההדרגתי של צפיפות 32 מ של דם מדולל. מזער מערבוב שני השלבים.</li>
		<li>צנטריפוגה 20 דקות ב 500 x g עם הבלם חופש. לאסוף את PBMCs מממשק מעבר צבע מדולל פלזמה/צפיפות למקם את התאים בשפופרת סטרילי 50 מ ל, להשלים עד 45 מ"ל עם תמיסת מלח מאוזנת של האנק.</li>
		<li>Centrifuge את התאים עבור 5 דקות ב 500 x g. בזהירות להסיר את תגובת שיקוע ולשמור בגדר.</li>
		<li>להוסיף 45 מ של RPMI1640/10% עגל עוברית סרום (FCS), צנטריפוגה 5 דקות ב 500 x g. בזהירות להסיר את תגובת שיקוע ולשמור בגדר. להוסיף 30 מ של PBS/2% FCS.</li>
		<li>
הסר CD2 + תאים באמצעות אנטי-CD2 beads מגנטי. להוסיף חרוזים 4 עבור תא היעד אחד. דגירה 30 דקות ב 4 º C.
		<ol>
<li>נפרד חרוז מכורך תאים תאים לא מאוגד באמצעות מגנט ליישום הפרדת תאים. איסוף תאים לא מאוגד, דגירה בגדר תא עם אנטי-CD19 APC ואנטי CD27 PE נוגדנים במשך 15 דקות ב 4 ° C (2 µL של נוגדנים עבור 106 תאים).</li>
			<li>לשטוף פעמיים בנסיוב עזים PBS/10%.</li>
			<li>הסרת מזהמים אירועים על מגרשים FSC והן האס. מגרש ללבישה-FSC-A vs vs FSC-H, האס-A שהאס-H מתווה כדי הסרת לכלוך וכדי לבחור את האוכלוסייה ליקוציט הכולל. בחר תאים זיכרון B CD19/CD27 ו- CD19+CD27+.</li>
			<li>לטהר MBCs באמצעות של סדרן התא עם טוהר 95%.</li>
		</ol>
</li>
		<li>בצע את כל השלבים תרבות באמצעות FCS IMDM ו-10%, בתוספת 50 מ"ג/מ"ל האנושי transferrin ו- 5 מ"ג/מ"ל האנושי אינסולין.</li>
		<li>
צלחת מטוהרים MBCs ב 6-ובכן תרבות צלחות (1.5 x 105 MBCs/mL בבאר/5 מ"ל), במשך ארבעה ימים, עם il-2 (20 U/mL), IL-10 (50 ng/mL), ו- IL-15 (10 ng/mL).
		<ol>
<li>להוסיף Phosphorothioate CpG ODN 2006, מתויג היסטידין רקומביננטי האנושי מסיסים CD40L (sCD40L; 50 ng/mL), mAb אנטי-polyhistidine (5 מ"ג/מ"ל) להפעלה MBCs (איור 1). הפעלה על ידי sCD40L או ODN רק עם הירידה בתשואות באותו קוקטייל ציטוקין הגברה נמוך יותר12. השילוב של אותות ההפעלה המתוארים כאן עופרת למספר המרבי של הפעלת תאי B ו- PrePBs11,12 (איור 1).</li>
			<li>עבור פרופיל ביטוי גנטי, לטהר CD38 /CD20–– PrePBs, ביום 4, שימוש של סדרן התא (איור 2).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
תא plasmablastic דור
	<ol>
<li>יום 4, לספור את התאים.</li>
		<li>צלחת בתאים תרבות. ובכן 12 צלחות ב 2.5 x 10 /mL5מ ל 2/היטב.</li>
		<li>זירוז בידול על-ידי הסרה של CpG oligonucleotides ו- sCD40L, תוספת של מדיום תרבות חדשה עם ציטוקין חדש קוקטייל כולל il-2 (20 U/mL), IL-6 (50 ng/mL), IL-10 (50 ng/mL) ו- IL-15 (10 ng/mL) (איור 1). התרבות התאים למשך 3 ימים (יום ד' ליום 7) ב 37 º C.</li>
		<li>עבור פרופיל ביטוי גנטי, לטהר CD38+/CD20– PBs, ביום 7, משתמש סדרן התא (איור 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
דור תאים פלזמה מוקדם
	<ol>
<li>יום 7, לספור את התאים.</li>
		<li>צלחת בתאים תרבות. ובכן 12 צלחות ב 5 x 105/mL ב 2 מ"ל/טוב.</li>
		<li>להבדיל PB מוקדם במחשבים שימוש בינוני תרבות טריים עם IL-6 (50 ng/mL), IL-15 (10 ng/mL), IFN-α (500 U/mL) במשך 3 ימים ב- 37 מעלות צלזיוס. עבור פרופיל ביטוי גנטי, לטהר CD20–/CD38+/CD138+ מוקדם במחשבים, ביום 10, שימוש של סדרן התא (איור 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
תאים פלזמה מאריכים דור
	<ol>
<li>להבדיל מחשבים מוקדם אל מחשבים אישיים חיו זמן רב על-ידי שינוי התנאים תרבות.</li>
		<li>התרבות התאים תרבות. ובכן 12 צלחות ב 5 x 105/mL ב 2 מ"ל/או ב- 24-ובכן תרבות צלחות 1 מ"ל/טוב ב 37 מעלות צלזיוס, באמצעות IL-6 וסטרומה תאים ממוזגים בינוני, אפריל (200 ng/mL).</li>
		<li>לקבל סטרומה תאים ממוזגים בינוני על-ידי culturing תאי סטרומה 5 ימים עם תרבות בינוני. לסנן את סטרומה תרבית תאים supernatant (0.2 µm) ו...</li>
		<li>להוסיף 50% של מדיה סטרומה תאים ממוזגים לתרבויות PC עם חידוש כל שבוע. מחשבים מאריכים שנוצר יכול להימשך חודשים13. ההישרדות לטווח ארוך של מחשבים יכולה להיות מושגת עם IL-6, אפריל בלבד כפי שדווח13.</li>
		<li>הפרשת Ig מידה של cytometry זרימה מיון מחשבים אישיים.</li>
		<li>תרבות מחשבים-106 תאים למ"ל במשך 24 שעות ביממה, למסוק את תגובת שיקוע תרבות. למדוד IgG ואיגה באמצעות האדם מקושר-אנזים immunosorbent assay (אליסה) ערכות11,12,13. הפרשה IgG החציוני נע בין 10 pg/תא/יום-יום 10-17 pg/תא/יום-יום 6013.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. אטלס מולקולרית של B ל- PC בידול
הערה: בנינו גישה נוחה ופתוחה ושפור כדי לחלץ את המידע הבולטים של Affymetrix GEP נתונים הקשורים PC בידול (GenomicScape)15באופן חזותי. GEP זמינים בפומבי ממסד ArrayExpress (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) כולל מטוהרים MBCs, PrePBs, PBs, EPCs: E-MTAB-1771, E-MEXP-2360 ו- E-MEXP-3034 ו- BMPC E-MEXP-236014,15. Genomicscape הוא webtool זמינה בחופשיות.
<ol><li>
מבחר B PC הנתונים (dataset)
	<ol>
<li>בחר B PC הנתונים (dataset) בתפריט נתונים עיין בכלי GenomicScape גישה פתוחה bioinformatic (http://www.genomicscape.com) המכונים תאים אנושיים B לתאי פלזמה. ויזואליזציה של ג'ין פרופיל ביטוי של גנים ייחודיים או רשימה של גנים זמין באמצעות כלי ביטוי-Coexpression הדוח ב כלי ניתוח הזמינים בדף הבית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ניתוח תחת פיקוח, ניתוח גורמים ראשיים (PCA)
	<ol>
<li>בחר כלי ניתוח | webSAM כדי לטעון את הכלי סם.</li>
		<li>בחר את ערכת הנתונים תאים אנושיים B לתאי פלזמה ובחר את הקבוצות של דוגמיות להשוואה.</li>
		<li>להשתמש במסננים שונים זמינים להחיל את אפשרויות הסינון של עניין.</li>
		<li>כדי להשוות בין ביטוי גנים פרופילים עם סאם הכלי, לשנות את אפשרויות הסינון כולל קיפול קטן, מספר התמורות, גילוי שקר קצב ואת הסוג של השוואה. GenomicScape לחשב את הניתוח ומספקים גנים ביטוי באופן שונה בין הקבוצות שנבחרו.</li>
		<li>להפעיל ניתוח גורמים ראשיים על-ידי בחירת המנהל רכיב ניתוח בתפריט כלי ניתוח .</li>
		<li>בחר את ערכת הנתונים תאים אנושיים B לתאי פלזמה ובחר את קבוצות עניין.</li>
		<li>הדבק רשימה של הגנים של עניין או בחר הגנים על פי השונות. הדבק רשימה של גנים, בחר Genomicscape כדי לנתח את רשימת גנים/ncRNAs, לחץ כאן. לחשב PCA זה יכול להיות דמיינו והורדת.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Shapiro-Shelef, M., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+plasma-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of plasma-cell development.</a> Nature Reviews Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).</li>
<li>Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+antibody-secreting+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The generation of antibody-secreting plasma cells.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (3), 160-171 (2015).</li>
<li>Shaffer, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blimp-1+orchestrates+plasma+cell+differentiation+by+extinguishing+the+mature+B+cell+gene+expression+program%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Blimp-1 orchestrates plasma cell differentiation by extinguishing the mature B cell gene expression program.</a> Immunity. 17 (1), 51-62 (2002).</li>
<li>Minnich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+role+of+the+transcription+factor+Blimp-1+in+coordinating+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Multifunctional role of the transcription factor Blimp-1 in coordinating plasma cell differentiation.</a> Nature Immunology. 17 (3), 331-343 (2016).</li>
<li>Klein, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+IRF4+controls+plasma+cell+differentiation+and+class-switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transcription factor IRF4 controls plasma cell differentiation and class-switch recombination.</a> Nature Immunology. 7 (7), 773-782 (2006).</li>
<li>Gass, J. N., Gunn, K. E., Sriburi, R., Brewer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stressed-out+B+cells%3F+Plasma-cell+differentiation+and+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Stressed-out B cells? Plasma-cell differentiation and the unfolded protein response.</a> Trends in Immunology. 25 (1), 17-24 (2004).</li>
<li>Goldfinger, M., Shmuel, M., Benhamron, S., Tirosh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+in+plasma+cells+is+regulated+by+crosstalk+between+endoplasmic+reticulum+stress+and+mTOR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis in plasma cells is regulated by crosstalk between endoplasmic reticulum stress and mTOR signaling.</a> European Journal of Immunology. 41 (2), 491-502 (2011).</li>
<li>Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XBP1+mRNA+is+induced+by+ATF6+and+spliced+by+IRE1+in+response+to+ER+stress+to+produce+a+highly+active+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor.</a> Cell. 107 (7), 881-891 (2001).</li>
<li>Shaffer, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XBP1%2C+downstream+of+Blimp-1%2C+expands+the+secretory+apparatus+and+other+organelles%2C+and+increases+protein+synthesis+in+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">XBP1, downstream of Blimp-1, expands the secretory apparatus and other organelles, and increases protein synthesis in plasma cell differentiation.</a> Immunity. 21 (1), 81-93 (2004).</li>
<li>Reimold, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+cell+differentiation+requires+the+transcription+factor+XBP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Plasma cell differentiation requires the transcription factor XBP-1.</a> Nature. 412 (6844), 300-307 (2001).</li>
<li>Jourdan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+transitional+preplasmablast+population+in+the+process+of+human+B+cell+to+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a transitional preplasmablast population in the process of human B cell to plasma cell differentiation.</a> Journal of Immunology. 187 (8), 3931-3941 (2011).</li>
<li>Jourdan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+differentiation+of+memory+B+cells+into+plasmablasts+and+plasma+cells+including+detailed+phenotypic+and+molecular+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of differentiation of memory B cells into plasmablasts and plasma cells including detailed phenotypic and molecular characterization.</a> Blood. 114 (25), 5173-5181 (2009).</li>
<li>Jourdan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-6+supports+the+generation+of+human+long-lived+plasma+cells+in+combination+with+either+APRIL+or+stromal+cell-soluble+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">IL-6 supports the generation of human long-lived plasma cells in combination with either APRIL or stromal cell-soluble factors.</a> Leukemia. , (2014).</li>
<li>Kassambara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+miRNA+expression+analysis+identifies+novel+key+regulators+of+plasma+cell+differentiation+and+malignant+plasma+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Global miRNA expression analysis identifies novel key regulators of plasma cell differentiation and malignant plasma cell.</a> Nucleic Acids Research. 45 (10), 5639-5652 (2017).</li>
<li>Kassambara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GenomicScape%3A+an+easy-to-use+web+tool+for+gene+expression+data+analysis.+Application+to+investigate+the+molecular+events+in+the+differentiation+of+B+cells+into+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">GenomicScape: an easy-to-use web tool for gene expression data analysis. Application to investigate the molecular events in the differentiation of B cells into plasma cells.</a> PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004077(2015).</li>
<li>Miremadi, A., Oestergaard, M. Z., Pharoah, P. D., Caldas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+genetics+of+epigenetic+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cancer genetics of epigenetic genes.</a> Human Molecular Genetics. 16, Spec No 1 28-49 (2007).</li>
<li>Pei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+methyltransferase+MMSET+regulates+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The histone methyltransferase MMSET regulates class switch recombination.</a> Journal of Immunology. 190 (2), 756-763 (2013).</li>
<li>Le Gallou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-2+requirement+for+human+plasma+cell+generation%3A+coupling+differentiation+and+proliferation+by+enhancing+MAPK-ERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-2 requirement for human plasma cell generation: coupling differentiation and proliferation by enhancing MAPK-ERK signaling.</a> Journal of Immunology. 189 (1), 161-173 (2012).</li>
<li>Cocco, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+long-lived+human+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of long-lived human plasma cells.</a> Journal of Immunology. 189 (12), 5773-5785 (2012).</li>
<li>Leung-Hagesteijn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xbp1s-negative+tumor+B+cells+and+pre-plasmablasts+mediate+therapeutic+proteasome+inhibitor+resistance+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Xbp1s-negative tumor B cells and pre-plasmablasts mediate therapeutic proteasome inhibitor resistance in multiple myeloma.</a> Cancer Cell. 24 (3), 289-304 (2013).</li>
<li>Orlowski, R. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+proteasome+inhibitors+cannot+ERADicate+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Why proteasome inhibitors cannot ERADicate multiple myeloma.</a> Cancer Cell. 24 (3), 275-277 (2013).</li>
<li>Ding, B. B., Bi, E., Chen, H., Yu, J. J., Ye, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-21+and+CD40L+synergistically+promote+plasma+cell+differentiation+through+upregulation+of+Blimp-1+in+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-21 and CD40L synergistically promote plasma cell differentiation through upregulation of Blimp-1 in human B cells.</a> Journal of Immunology. 190 (4), 1827-1836 (2013).</li>
<li>Tsai, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-1+promotes+immunoglobulin+production+during+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Galectin-1 promotes immunoglobulin production during plasma cell differentiation.</a> Journal of Immunology. 181 (7), 4570-4579 (2008).</li>
<li>Tsai, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-1+and+galectin-8+have+redundant+roles+in+promoting+plasma+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Galectin-1 and galectin-8 have redundant roles in promoting plasma cell formation.</a> Journal of Immunology. 187 (4), 1643-1652 (2011).</li>
<li>Anginot, A., Espeli, M., Chasson, L., Mancini, S. J., Schiff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin+1+modulates+plasma+cell+homeostasis+and+regulates+the+humoral+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Galectin 1 modulates plasma cell homeostasis and regulates the humoral immune response.</a> Journal of Immunology. 190 (11), 5526-5533 (2013).</li>
<li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homing+and+adhesion+patterns+determine+the+cellular+composition+of+the+bone+marrow+plasma+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche.</a> Journal of Immunology. 188 (3), 1283-1291 (2012).</li>
<li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APRIL+is+critical+for+plasmablast+survival+in+the+bone+marrow+and+poorly+expressed+by+early-life+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">APRIL is critical for plasmablast survival in the bone marrow and poorly expressed by early-life bone marrow stromal cells.</a> Blood. 111 (5), 2755-2764 (2008).</li>
<li>Huard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APRIL+secreted+by+neutrophils+binds+to+heparan+sulfate+proteoglycans+to+create+plasma+cell+niches+in+human+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">APRIL secreted by neutrophils binds to heparan sulfate proteoglycans to create plasma cell niches in human mucosa.</a> Journal of Clinical Investigation. 118 (8), 2887-2895 (2008).</li>
<li>Ame-Thomas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+bone+marrow+and+lymphoid+organs+support+tumor+B-cell+growth%3A+role+of+stromal+cells+in+follicular+lymphoma+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and lymphoid organs support tumor B-cell growth: role of stromal cells in follicular lymphoma pathogenesis.</a> Blood. 109 (2), 693-702 (2007).</li>
<li>Ramachandrareddy, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCL6+promoter+interacts+with+far+upstream+sequences+with+greatly+enhanced+activating+histone+modifications+in+germinal+center+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">BCL6 promoter interacts with far upstream sequences with greatly enhanced activating histone modifications in germinal center B cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (26), 11930-11935 (2010).</li>
<li>Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+of+the+antibody+response%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epigenetics of the antibody response.</a> Trends in Immunology. 34 (9), 460-470 (2013).</li>
<li>Miles, R. R., Crockett, D. K., Lim, M. S., Elenitoba-Johnson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+BCL6-interacting+proteins+by+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of BCL6-interacting proteins by tandem mass spectrometry.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 4 (12), 1898-1909 (2005).</li>
<li>McManus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Pax5+regulates+its+target+genes+by+recruiting+chromatin-modifying+proteins+in+committed+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Pax5 regulates its target genes by recruiting chromatin-modifying proteins in committed B cells.</a> The EMBO Journal. 30 (12), 2388-2404 (2011).</li>
<li>Ahmadnejad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+expression+of+DNMT1+is+associated+with+increased+expansion+and+proliferation+of+hematopoietic+stem+cells+co-cultured+with+human+MSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Research%22%5BJournal%5D)">Elevated expression of DNMT1 is associated with increased expansion and proliferation of hematopoietic stem cells co-cultured with human MSCs.</a> Blood Research. 52 (1), 25-30 (2017).</li>
<li>Beguelin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZH2+is+required+for+germinal+center+formation+and+somatic+EZH2+mutations+promote+lymphoid+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">EZH2 is required for germinal center formation and somatic EZH2 mutations promote lymphoid transformation.</a> Cancer Cell. 23 (5), 677-692 (2013).</li>
<li>Herviou, L., Cavalli, G., Cartron, G., Klein, B., Moreaux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZH2+in+normal+hematopoiesis+and+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">EZH2 in normal hematopoiesis and hematological malignancies.</a> Oncotarget. 7 (3), 2284-2296 (2016).</li>
<li>Beguelin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZH2+enables+germinal+centre+formation+through+epigenetic+silencing+of+CDKN1A+and+an+Rb-E2F1+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">EZH2 enables germinal centre formation through epigenetic silencing of CDKN1A and an Rb-E2F1 feedback loop.</a> Nature Communications. 8 (1), 877(2017).</li>
<li>Herviou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRC2+targeting+is+a+therapeutic+strategy+for+EZ+score+defined+high-risk+multiple+myeloma+patients+and+overcome+resistance+to+IMiDs%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Epigenetics%22%5BJournal%5D)">PRC2 targeting is a therapeutic strategy for EZ score defined high-risk multiple myeloma patients and overcome resistance to IMiDs.</a> Clinical Epigenetics. 10 (1), 121(2018).</li>
<li>Asangani, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+EZH2-MMSET+histone+methyltransferase+regulatory+axis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Characterization of the EZH2-MMSET histone methyltransferase regulatory axis in cancer.</a> Molecular Cell. 49 (1), 80-93 (2013).</li>
<li>Pei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMSET+regulates+histone+H4K20+methylation+and+53BP1+accumulation+at+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MMSET regulates histone H4K20 methylation and 53BP1 accumulation at DNA damage sites.</a> Nature. 470 (7332), 124-128 (2011).</li>
<li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EHMT2+inhibitor+BIX-01294+induces+apoptosis+through+PMAIP1-USP9X-MCL1+axis+in+human+bladder+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">EHMT2 inhibitor BIX-01294 induces apoptosis through PMAIP1-USP9X-MCL1 axis in human bladder cancer cells.</a> Cancer Cell International. 15 (1), 4(2015).</li>
<li>Santo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+activity%2C+pharmacodynamic%2C+and+pharmacokinetic+properties+of+a+selective+HDAC6+inhibitor%2C+ACY-1215%2C+in+combination+with+bortezomib+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Preclinical activity, pharmacodynamic, and pharmacokinetic properties of a selective HDAC6 inhibitor, ACY-1215, in combination with bortezomib in multiple myeloma.</a> Blood. 119 (11), 2579-2589 (2012).</li>
<li>Amengual, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Targeting+of+Protein+Degradation+Pathways+with+the+Selective+HDAC6+Inhibitor+ACY-1215+and+Bortezomib+Is+Synergistic+in+Lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Dual Targeting of Protein Degradation Pathways with the Selective HDAC6 Inhibitor ACY-1215 and Bortezomib Is Synergistic in Lymphoma.</a> Clinical Cancer Research. 21 (20), 4663-4675 (2015).</li>
<li>Schoenhals, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forced+KLF4+expression+increases+the+generation+of+mature+plasma+cells+and+uncovers+a+network+linked+with+plasma+cell+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Forced KLF4 expression increases the generation of mature plasma cells and uncovers a network linked with plasma cell stage.</a> Cell Cycle. 15 (14), 1919-1928 (2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף

בשפת בני אדם, PC הם תאים נדיר עם בידול שלבים המתרחשים במקומות אנטומיים ה"בלתי אפיון מלא ביולוגי. פיתחנו של B במבחנה למודל בידול PC, שימוש במערכות רב שלבי תרבות שבו שילובים שונים של מולקולות הפעלה, ציטוקינים מוחלות לאחר מכן כדי לשחזר את הבידול תא רציפים המתרחשים איברים/ברקמות שונות vivo11,12,13.
אחרים B במבחנה יעיל למודלים בידול מחשבים היו שדווחה18,1...

הבידול של תאים B לתאי פלזמה (אישיים) חיוני humoral חסינות ולהגן על המחשב המארח נגד זיהומים1. B ל- PC בידול מזוהה עם שינויים משמעותיים שעתוק קיבולת ואת חילוף החומרים כדי להכיל את הפרשת נוגדנים. גורמי שעתוק השולטים B ל PC בידול נחקרו בהרחבה, חשף רשתות בלעדי כולל שעתוק ספציפיים B או PC גורמים (TFs)2. בתאי B, PAX5, BCL6, BACH2 שר הם השומרים של תא B-זהות-2,-3. אינדוקציה של IRF4, PRDM1 קידוד BLIMP1 ו XBP1 PC TF לכבות את הגנים תא B, זירוז מתואמת מפריש נוגדן תא תוכנית תעתיק3,4,5. שינויים תעתיק מתואם אלה קשורים עם הפעלה שעתוק של גנים Ig יחד עם מתג מהטופס ממברנה מאוגד לטופס המופרש של אימונוגלובולינים שרשרת כבדה2,3, 4. B ל- PC בידול קשורה אינדוקציה של גנים מעורבים רשתית תוך-פלזמית ופונקציות גולג'י בו-זמני עם חלבון פרש התגובה (UPR) הפעלת ידוע לשחק תפקיד מפתח מחשב לפי אדיב הסינתזה של מופרש immunoglobulins6,7. XBP1 TF ממלאת תפקיד מרכזי זה הסתגלות הסלולר8,9,10.
בתאי B מחשבים שחקני המפתח של חסינות humoral בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. הבנת הביולוגי תהליכים פקד זה הייצור והישרדות תאים פלזמה נורמלי הוא קריטי התערבויות טיפוליות צריך להבטיח תגובות חיסוניות יעילה למנוע מחלת חיסון עצמי או חיסוני. PC הם תאים נדיר בשלבים המוקדמים של בידול מתרחש במיקומים אנטומיים ה"בלתי אפיון מלא ביולוגי, במיוחד אצל האדם. שימוש במערכות רב שלבי תרבות, דיווחנו על B במבחנה למודל בידול PC. מודל זה מתרבה התמיינות תאים רציפים של התבגרות המתרחשים באיברים שונים vivo11,12,13. בשלב הראשון, זיכרון B התאים מופעלים קודם במשך ארבעה ימים על ידי שילוב CD40 ליגנד, oligodeoxynucleotides וציטוקינים, להבדיל לתוך preplasmablasts (PrePBs). בשלב השני, preplasmablasts הם המושרה כדי להתמיין plasmablasts (PBs) על-ידי הסרת גירוי CD40L ו oligodeoxynucleotides ושינוי השילוב ציטוקין. בשלב השלישי, plasmablasts הם המושרה להבדיל אל מחשבים אישיים מוקדם על-ידי שינוי ציטוקין שילוב11,12. לצעד הרביעי הוצג להגיע לבגרות מלאה מחשבים על ידי culturing אלה מחשבים מוקדם עם מח עצם סטרומה תאים ממוזגים בינוני או שנבחרו גורמי גדילה13. אלה מחשבים בוגר יכול לשרוד במבחנה מספר חודשים ולא מפרישות כמויות גבוהות של אימונוגלובולינים (איור 1). מעניין, המודל במבחנה שלנו recapitulates את השינויים תעתיק מתואמת ולא על פנוטיפ של B שונים בשלבים PC שניתן ויוו שזוהו11,12,13,14 ,15. מחשבים הם תאים נדיר, מודל בידול במבחנה שלנו מאפשר ללמוד האנושי B ל- PC בידול.

<table><tbody><tr><td>חרוזים מגנטיים נגד CD2</td><td>Invitrogen</td><td>11159D</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-CD138-APC</td><td>בקמן-קולטר&nbsp;</td><td>B49219</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-CD19-APC</td><td>BD</td><td>555415</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-CD20-PB</td><td>בקמן-קולטר&nbsp;</td><td>B49208</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-CD27-PE</td><td>BD</td><td>555441</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-CD38-PE</td><td>בקמן-קולטר&nbsp;</td><td>A07779</td><td></td></tr><tr>מו"פ<td>אנטי-היסטידין</td><td> D Systems</td><td>MAB050</td><td></td></tr><tr><td>CpG ODN(PT)</td><td>סיגמא</td><td></td><td>T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C* G*T*T*T*T</td></tr><tr><td>טרנספרין אנושי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T3309</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&alpha;</td><td>Merck</td><td>Intron A</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>31980-022</td><td></td></tr><tr><td>רקומבינן אנושי CD40L-hi</td><td>R& D Systems</td><td>2706-CL</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי אפריל</td><td>R& D Systems</td><td>5860-AP-010</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי IL-10</td><td>מו"פ D Systems</td><td>217-IL-רקומביננטי</td><td></td></tr> <tr><td>אנושי IL-15</td><td>Peprotech</td><td>200-15-10ug</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי חלבון IL-2 אנושי</td><td>R& די סיסטמס</td><td>202-IL-רקומביננטי</td><td></td></tr> <tr><td>אנושי IL-6</td><td>פפרוטק</td><td>200-06</td><td></td></tr></tbody></table>

חוץ גופית במודל התמיינות תאי הזיכרון האנושי נורמלי b לתאי פלזמה חיים ארוכים

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

תאים פלזמה (אישיים) מפרישים כמויות גדולות של נוגדנים, לפתח מתאי B שעברו. מחשבים הם נדירים תאים ממוקם במח העצם או רירית ולהבטיח humoral חסינות. בשל תדירות נמוכה והמיקום שלהם, המחקר של מחשבים קשה-אנוש. דיווחנו a B ל- PC מודל בידול במבחנה באמצעות שילובים הנבחר של מולקולות ציטוקינים והפעלה המאפשרות לשחזר את הבידול תא רציפים המתרחשים ויוו. במודל זה במבחנה, הזיכרון בתאי B (MBCs) להבדיל לתוך טרום plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs), מוקדם מחשבים ולבסוף, חיים ארוכים, מחשבים אישיים עם פנוטיפ קרוב המקבילים אצל אנשים בריאים. בנינו גם ביואינפורמטיקה גישה פתוחה כלים לנתח את המידע הבולטים GEP נתונים הקשורים PC בידול. משאבים אלה ניתן ללמוד B האנושי PC בידול, במחקר הנוכחי, חקרנו את הביטוי הכונה של גורמים epigenetic במהלך האנושי B ל- PC בידול.

ההליך הכולל של בידול PC רגיל אין ויטרו מיוצג באיור1. באמצעות פרוטוקול המובאת כאן, אנו יכול לייצר כמות מספקת של תאים לא הצליחה עם ex-vivo דגימות אנושי. למרות התפקיד של הרשת מורכבת של גורמי שעתוק מעורב PC בידול נחקר, מנגנוני ויסות רשתות שעתוק של בידול PC מפתח יישארו מוכרים. התמיינות הוא מונע בעיקר על ידי שינויים epigenetic, גנים ברמת השעתוק. באמצעות המודל במבחנה שלנו, את B ל- PC GEP אטלס, חקרנו את השינויים ביטוי הגורמים epigenetic התמיינות תאים פלזמה נורמליים.<...

שימוש במערכות רב שלבי תרבות, מדווחים תא B במבחנה למודל התמיינות תאים פלזמה.

חוץ גופית במודל התמיינות תאי הזיכרון האנושי נורמלי B לתאי פלזמה חיים ארוכים

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...

תאי פלזמה הם תאים נדירים עם 30 שלבי התברואה המתקיימות במקומות אנטומיים הפוגעים באפיון ביולוגי מלא, במיוחד בבני אדם. מודל ההתברלות של תאי הפלזמה במבחנה B2 שלנו משחזר את ההתברלות וההתבגרות של התאים הרציף המתרחשים באיברים השונים ב- vivo. מודל במבחנה זה מסכם מחדש את השינויים התמלוליים המתואמים ואת הפנוטיפ של שלבי תאי הפלזמה השונים של B2 שניתן לזהות ב- vivo.בנינו גם כלים ביואינפורמטיים לגישה פתוחה כדי לנתח את המידע הבולט ביותר מנתוני חקירה הקשורים לבידול תאי פלזמה. הדגמת ההליך תהיה הוגס דה בוסק, פוסט-דוק מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, להשיג תאי דם היקפיים ממתנדבים בריאים לטיהור תאי B זיכרון.לדלל 7.5 מיליליטר של דם עם 24.5 מיליליטר של RPMI 1640 בינוני. לאחר מכן, הוסיפו 12.5 מיליליטר של שיפוע צפיפות טמפרטורת החדר לצינור חרוט סטרילי של 50 מיליליטר. כיסוי עדין של שיפוע הצפיפות עם 32 מיליליטר של דם מדולל, הקפד למזער את הערבוב של שני השלבים.צנטריפוגה במשך 20 דקות בכבידה של פי 500 כשהבלם כבוי. לאסוף את התאים mononuclear הדם ההיקפיים מפלזמה מדוללת וממשק שיפוע צפיפות. מעבירים את התאים לצינור סטרילי של 50 מיליליטר וממלאים את הצינור עד 45 מיליליטר בתתווית המלח המאוזנת של האנק.צנטריפוגה בכבידה של פי 500 לחמש דקות. בזהירות להסיר את supernatant ולשמור את גלולה. לאחר מכן, להוסיף 45 מיליליטר של RPMI 1640 בינוני, בתוספת 10%FCS.צנטריפוגה בכבידה של פי 500 לחמש דקות. בזהירות להסיר את supernatant ולשמור את גלולה. הוסף 30 מיליליטר של PBS, בתוספת 2%FCS.השתמש חרוזים מגנטיים נגד תקליטורים כדי להסיר תאים חיוביים CD2 על ידי הוספת ארבעה חרוזים עבור תא יעד אחד. דגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. באמצעות מגנט ליישום הפרדת תאים, הפרד את התאים המאוגדים לחרוזים מהתאים הלא מאוגדים.לאסוף את התאים מאוגדים דגירה אותם עם נוגדנים נגד CD19 APC ו נגד CD27 PE במשך רבע שעה בארבע מעלות צלזיוס. לשטוף את התאים פעמיים PBS המכיל 10% סרום עזים. לאחר מכן, השתמש בסדרן התאים כדי לטהר את תאי הזיכרון B ל- 95%purity.לאחר מכן, להוסיף ליגנד CD40 מסיס נוגדן חד שבטי אנטי פוליהיסטידין להפעלת תא B זיכרון. צלחת תאי B זיכרון מטוהרים בשש צלחות תרבות במשך ארבעה ימים עם interleukin-2, interleukin-10 ו interleukin-15. לקבלת פרופיל ביטוי גנים, השתמש בסדרן תאים כדי לטהר את ה- CD38-שלילי CD20 שלילי preplasmablasts ביום הרביעי.ביום הרביעי, לספור את התאים צלחת אותם 12 צלחות תרבות היטב בצפיפות תאים של 250, 000 תאים למיליליטר על ידי הוספת שני מיליליטר של השעיית תא לתוך כל באר. כדי לגרום בידול, להסיר את oligonucleotides CPG ו מסיסים CD40 ליגנד ולהוסיף מדיום תרבות חדש המכיל קוקטייל ציטוקין חדש כולל אינטרלוקין-2, interleukin-6, interleukin-10 ו interleukin-15. תרבו את התאים במשך שלושה ימים ב-37 מעלות צלזיוס.לקבלת פרופיל ביטוי גנים, השתמש בסדרן תאים כדי לטהר את הפלזמה CD38 חיובית, CD20 שלילית ביום השביעי. ביום השביעי, לספור את התאים. צלחת התאים ב 12 גם לוחות תרבות בצפיפות תאים של 500, 000 תאים ל הבאר, על ידי הוספת שני מיליליטר של השעיית תאים לכל באר.להבדיל את plasmablasts לתוך תאי פלזמה מוקדמים באמצעות מדיום תרבות טרי המכיל interleukin-6, interleukin-15, ו אינטרפרון אלפא במשך שלושה ימים ב 37 מעלות צלזיוס. עבור יצירת פרופילים של ביטויי גנים, השתמש בסדרן תאים כדי לטהר את תאי הפלזמה המוקדמים השליליים, החיוביים ל- CD38, החיוביים ל- CD138 ביום 10. ראשית, תאים סטרומה תרבות במשך חמישה ימים עם מדיום תרבות.השתמש במסנן 0.2 מיקרוליטר כדי לסנן את על-טבעי תרבות התאים הסטרומאליים כדי להשיג תא סטרומה מותנה בינוני ולהקפיא עד מוכן לשימוש. לאחר מכן, תרבו את תאי הפלזמה המוקדמים בצלחות תרבות של 12 בארות, תוך שימוש במדיום התא הסטרומאלי שהושג בעבר עם אינטרלוקין-6 ואפריל בצפיפות תאים של 500, 000 תאים ל הבאר, על ידי הוספת שני מיליליטר של השעיית תאים לכל באר. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, חידוש התא סטרומה מותנה בינוני בכל שבוע.לאחר מכן, למדוד את הפרשת אימונוגלובולין מתאי פלזמה ממוינים cytometry זרימה. תרבו את תאי הפלזמה בצפיפות של מיליון תאים למיליליטר למשך 24 שעות וקצרו את תרבות העל-טבעית. באמצעות ערכת ELISA, למדוד את אימונוגלובולין G, אימונוגלובולין A.First, להשיק את GenomicScape גישה פתוחה bioinformatics כלי אינטרנט.בתפריט נתוני עיון, בחר את ערכת הנתונים הנקראת תאי B אנושיים לתאי פלזמה. הדמיה של פרופיל ביטוי הגנים של גן ייחודי או רשימה של גנים זמינה באמצעות הכלי Expression/Coexpression Report בכלי הניתוח. לאחר מכן, בחר WebSAM של כלי ניתוח כדי לטעון את הכלי SAM.בחר את תאי B האנושיים לקבוצת הנתונים של תאי פלזמה ובחר את קבוצת הדגימות להשוואה. השתמש במסננים השונים הזמינים כדי להחיל את אפשרויות הסינון המעניינים. כדי להשוות פרופילי ביטויי גנים לכלי SAM, שנה את אפשרויות הסינון כולל שינוי קיפול, מספר תמורות, קצב גילוי כוזב וסוג ההשוואה.התוכנה ת לחשב את הניתוח ולספק גנים לידי ביטוי דיפרנציאלי בין הקבוצות שנבחרו. במחקר זה נחקרים שינויי הביטוי של הגורמים האפיגנטיים בהידול תאי פלזמה רגילים. באמצעות ניתוח SAM רב-שכבתי, 71 גנים נראים מבוטאים באופן דיפרנציאלי באופן משמעותי בין תאי הזיכרון B, preplasmablasts, plasmablasts, תאי הפלזמה המוקדמים ותאי פלזמה מח עצם עם שיעור גילוי כוזב של פחות מ 5%שלב התא B זיכרון מאופיין על ידי לחץ יתר של 23 גנים שחקן אפיגנטי, כולל 39.13% של אצטילטרנספראזים histone, 30.43% של היסטון מתילטרנספראזס 21.74% מחלבונים מחייבי מתיל ו-4.35% מחלבוני היסטון דאצטילאזס.14 גנים של שחקנים אפיגנטיים מדוכאים יתר על כן באופן משמעותי בשלב preplasmablast, כולל 50% של מתילטרנספראזות היסטון, 14.28% של מתילטרנספראזות DNA, 21.43% של deacetylases היסטון, 7.14% של demethylases histone, ו 17.14% של אצטילטרנספראזים היסטון. בעקבות הליך זה, מספר ניתוחים כדי לזהות ולהבין שינויים במבנה כרומטין וארכיטקטורה במהלך אלה בידול תאי פלזמה B2 יכול להתבצע. מודל בידול במבחנה זה יאפשר ליצור מספיק תאים כדי להשלים את הניתוח המולקולרי הזה כדי לחשוף הן את המסלולים המעורבים במודלים שלמים והן את השפעתם התמלולית במורד הזרם במהלך התמדול לתאי הפלזמה B2.ידע זה הנגזר ממחקר זה יכול ליידע ולהדריך על אסטרטגיות אבחון וטיפולי עבור הפרעות בתאי פלזמה, כגון במקרה של מיאלומה נפוצה, סרטן ללא תרופה סופית, שעבורו פרוגנוזה טובה יותר ואסטרטגיות טיפוליות משופרות נחוצות באופן קריטי. אפיון והבנה של שינויים מבניים ואדריכליים אפיגנטיים המשפיעים על כרומטין במהלך בידול תאי פלזמה B2 יהיה עניין מיוחד. ניתן לעשות זאת באמצעות רצף גנים, ERRBS, רצף ATAC, IC וריווח RNA.הטרוגניות מתונה ניתן לראות באחוז של תאי B פעילים, preplasmablasts, plasmablasts ותאי פלזמה, בהתאם לדם של תורם בריא, המשמש לטיהור תאי B זיכרון.

in-vitro-differentiation-model-human-normal-memory-b-cells-to-long

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מתארים שיטה להפקת הפך תא B באמצעות קווי Epstein-Barr הוירוס. אנחנו גם להמחיש assay רומן שיכולה לזהות תאים B עתידה לעבור שינוי מוקדם ככל שלושה ימים לאחר ההדבקה.

הקמת Epstein-Barr Virus צמיחה הפך שורות תאים Lymphoblastoid

סינתזה של נוגדנים חד-שבטיים אנושיים היא הצעד הראשון במחקרים שמטרתם לחשוף את המנגנונים הפתופיזיולוגיים של תגובות חיסוניות בתיווך נוגדנים עצמיים. פיתחנו פרוטוקול ליצירת נוגדנים חד-שבטיים רקומביננטיים של אימונוגלובולין G (IgG) מתאי B ממוינים בדם, כולל בידוד תאי B, שיבוט נוגדנים וסינתזה במבחנה.

דור של רקומביננטי אדם IgG נוגדנים חד שבטיים מתאים הממוינים B הונצחו

דם היקפי אנושי משמש בדרך כלל להערכת התגובה החיסונית ההומורלית. כאן, מתוארות השיטות לבידוד תאי B אנושיים מדם היקפי, התמיינות תאי B אנושיים לתאי B מפרישי נוגדנים (AB) (ASCs) בתרבית, וספירת סך ה-IgM וה-IgG-ASCs באמצעות בדיקת ELISpot.

הבידוד, בידול, וכימות של האדם נוגדן מפריש תאים B מדם: ELISPOT בתור Readout פונקציונלי של חסינות הלחות

פרוטוקול זה מתאר את דור phenotyping לשחזור של תאי T רגולטוריים מושרה אדם (iTregs) מתאי CD4 + T נאיביים במבחנה. פרוטוקולים שונים לזירוז FOXP3 לאפשר לחקר פנוטיפים iTreg הספציפיים שהושגו עם פרוטוקולי בהתאמה.

במבחנה בידול של האדם CD4 + FOXP3 + מושרה תקינה בתאי T (iTregs) מ נאיבית CD4 + T תאים באמצעות פרוטוקול TGF-β-המכיל

שיטת תמוגה תאי דם אדומה פשוט לצורך ביסוס B-LCLS פותחה עם יעילות גבוהה הנצחה, מחייב כמות קטנה של דם חיסכון בזמן מן החניכה cryopreservation.

תא דם אדום פשוט שיטת תמוגה להקמת שורות תאי B Lymphoblastoid

אנו מתארים שיטה לייצור נוגדנים אנושי ספציפי אנטיגן של עניין, מתחיל מתאי B נדיר במחזור דם אנושי. דור של נוגדנים טבעיים אלה הוא יעיל ומהיר, הנוגדנים שהושג יכול להפלות בין אנטיגנים מאוד קשורות.

דור שמסווגת נוגדנים חד-שבטיים אנושי מתאי B אנטיגן ספציפי נדיר במחזור הדם

מאמר זה מתאר את השיטה הרומן לייצר אנטיגן הגידול-ספציפי המושרה ביותר תאים גזע מהגרים הרתי (iTE) על ידי תלת מימדי (3D) מערכת התרבות הרתי. iTE הינם תת-קבוצה הומוגנית של תאי T הקשורים היטב לתאי T תמימים עם יכולת התפשטות, היווצרות הזיכרון ודיכוי הגידול.

תלת מימדי הרתי תרבות מערכת לייצר Murine המושרה תא גזע Pluripotent-הגידול הנגזר אנטיגן-מהגרים ספציפיים הרתי

שיטת BSelex כדי לזהות ולשחזר נוגדנים ספציפיים אנטיגן ספציפי של הדם היקפיים היקפי תאים מונמונומנט משלבת הזרימה cy, לנסות עם תא בודד PCR ו שיבוט.

שיטת הקרנה של תא בודד לבחירת ושחזור של נוגדנים עם הצורך הרצוי מתוך זיכרון אנושי מועשר B אוכלוסיות תאים

אנו מתארים כאן ניתוח פשוט של ההטרוגניות של תא תאי B החיסוניים המוריניים ברקמות הצפק, הטחול ומח העצם על ידי ציטומטריית זרימה. הפרוטוקול יכול להיות מותאם ומורחב לרקמות עכבר אחרות.

אפיון ציטומטרי זרימה של פיתוח תאי מורין B

פרוטוקול זה מתאר את ההתמיינות של תאי CD4+ T נאיביים לתאי Th17 פתוגניים במבחנה. באופן ספציפי, בשילוב עם גישה מבוססת ציטומטריה של זרימה מרובת פרמטרים, ניתן לקבל 90% טוהר של תאי Th17 פתוגניים מתאי T נאיביים CD4+ באמצעות שיטת התמיינות זו.

התמיינות חוץ גופית של תאי T נאיביים CD4+ לתאי Th17 פתוגניים בעכבר

כדי לחקור התמיינות ותפקוד תאי T של CD8 במבחנה, ניתן לבודד את תאי ה-CD8 T מהעכבר כדי לעבור תרבית משותפת לטווח ארוך עם אורגנואידים אפיתליים נרתיקיים של עכברים שנדבקו מראש. כאן, אנו מתארים תהליך זה ומעריכים את רכישת סמני תאי T בזיכרון התושבים במהלך קו-קולטורציה.

In-Vitro התמיינות תאי T בזיכרון תושב CD8 באמצעות מערכת קו-קולטורציה של תא אורגנואיד-T אפיתל

חקור מודל תרבית חוץ גופית לתמיינות תאי B לתאי פלזמה באמצעות מערכת רב-שלבית עם כלים ביואינפורמטיים פתוחים. שיטה זו מאפשרת חקר שינויים תיעתיקיים ותכונות פנוטיפיות של תאי פלזמה בבני אדם.

חוץ גופית במודל התמיינות תאי הזיכרון האנושי נורמלי B לתאי פלזמה חיים ארוכים

גלה סרטונים נוספים