חוץ גופית במודל התמיינות תאי הזיכרון האנושי נורמלי B לתאי פלזמה חיים ארוכים

תאי פלזמה הם תאים נדירים עם 30 שלבי התברואה המתקיימות במקומות אנטומיים הפוגעים באפיון ביולוגי מלא, במיוחד בבני אדם. מודל ההתברלות של תאי הפלזמה במבחנה B2 שלנו משחזר את ההתברלות וההתבגרות של התאים הרציף המתרחשים באיברים השונים ב- vivo. מודל במבחנה זה מסכם מחדש את השינויים התמלוליים המתואמים ואת הפנוטיפ של שלבי תאי הפלזמה השונים של B2 שניתן לזהות ב- vivo.

בנינו גם כלים ביואינפורמטיים לגישה פתוחה כדי לנתח את המידע הבולט ביותר מנתוני חקירה הקשורים לבידול תאי פלזמה. הדגמת ההליך תהיה הוגס דה בוסק, פוסט-דוק מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, להשיג תאי דם היקפיים ממתנדבים בריאים לטיהור תאי B זיכרון.

לדלל 7.5 מיליליטר של דם עם 24.5 מיליליטר של RPMI 1640 בינוני. לאחר מכן, הוסיפו 12.5 מיליליטר של שיפוע צפיפות טמפרטורת החדר לצינור חרוט סטרילי של 50 מיליליטר. כיסוי עדין של שיפוע הצפיפות עם 32 מיליליטר של דם מדולל, הקפד למזער את הערבוב של שני השלבים.

צנטריפוגה במשך 20 דקות בכבידה של פי 500 כשהבלם כבוי. לאסוף את התאים mononuclear הדם ההיקפיים מפלזמה מדוללת וממשק שיפוע צפיפות. מעבירים את התאים לצינור סטרילי של 50 מיליליטר וממלאים את הצינור עד 45 מיליליטר בתתווית המלח המאוזנת של האנק.

צנטריפוגה בכבידה של פי 500 לחמש דקות. בזהירות להסיר את supernatant ולשמור את גלולה. לאחר מכן, להוסיף 45 מיליליטר של RPMI 1640 בינוני, בתוספת 10%FCS.

צנטריפוגה בכבידה של פי 500 לחמש דקות. בזהירות להסיר את supernatant ולשמור את גלולה. הוסף 30 מיליליטר של PBS, בתוספת 2%FCS.

השתמש חרוזים מגנטיים נגד תקליטורים כדי להסיר תאים חיוביים CD2 על ידי הוספת ארבעה חרוזים עבור תא יעד אחד. דגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. באמצעות מגנט ליישום הפרדת תאים, הפרד את התאים המאוגדים לחרוזים מהתאים הלא מאוגדים.

לאסוף את התאים מאוגדים דגירה אותם עם נוגדנים נגד CD19 APC ו נגד CD27 PE במשך רבע שעה בארבע מעלות צלזיוס. לשטוף את התאים פעמיים PBS המכיל 10% סרום עזים. לאחר מכן, השתמש בסדרן התאים כדי לטהר את תאי הזיכרון B ל- 95%purity.

לאחר מכן, להוסיף ליגנד CD40 מסיס נוגדן חד שבטי אנטי פוליהיסטידין להפעלת תא B זיכרון. צלחת תאי B זיכרון מטוהרים בשש צלחות תרבות במשך ארבעה ימים עם interleukin-2, interleukin-10 ו interleukin-15. לקבלת פרופיל ביטוי גנים, השתמש בסדרן תאים כדי לטהר את ה- CD38-שלילי CD20 שלילי preplasmablasts ביום הרביעי.

ביום הרביעי, לספור את התאים צלחת אותם 12 צלחות תרבות היטב בצפיפות תאים של 250, 000 תאים למיליליטר על ידי הוספת שני מיליליטר של השעיית תא לתוך כל באר. כדי לגרום בידול, להסיר את oligonucleotides CPG ו מסיסים CD40 ליגנד ולהוסיף מדיום תרבות חדש המכיל קוקטייל ציטוקין חדש כולל אינטרלוקין-2, interleukin-6, interleukin-10 ו interleukin-15. תרבו את התאים במשך שלושה ימים ב-37 מעלות צלזיוס.

לקבלת פרופיל ביטוי גנים, השתמש בסדרן תאים כדי לטהר את הפלזמה CD38 חיובית, CD20 שלילית ביום השביעי. ביום השביעי, לספור את התאים. צלחת התאים ב 12 גם לוחות תרבות בצפיפות תאים של 500, 000 תאים ל הבאר, על ידי הוספת שני מיליליטר של השעיית תאים לכל באר.

להבדיל את plasmablasts לתוך תאי פלזמה מוקדמים באמצעות מדיום תרבות טרי המכיל interleukin-6, interleukin-15, ו אינטרפרון אלפא במשך שלושה ימים ב 37 מעלות צלזיוס. עבור יצירת פרופילים של ביטויי גנים, השתמש בסדרן תאים כדי לטהר את תאי הפלזמה המוקדמים השליליים, החיוביים ל- CD38, החיוביים ל- CD138 ביום 10. ראשית, תאים סטרומה תרבות במשך חמישה ימים עם מדיום תרבות.

השתמש במסנן 0.2 מיקרוליטר כדי לסנן את על-טבעי תרבות התאים הסטרומאליים כדי להשיג תא סטרומה מותנה בינוני ולהקפיא עד מוכן לשימוש. לאחר מכן, תרבו את תאי הפלזמה המוקדמים בצלחות תרבות של 12 בארות, תוך שימוש במדיום התא הסטרומאלי שהושג בעבר עם אינטרלוקין-6 ואפריל בצפיפות תאים של 500, 000 תאים ל הבאר, על ידי הוספת שני מיליליטר של השעיית תאים לכל באר. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, חידוש התא סטרומה מותנה בינוני בכל שבוע.

לאחר מכן, למדוד את הפרשת אימונוגלובולין מתאי פלזמה ממוינים cytometry זרימה. תרבו את תאי הפלזמה בצפיפות של מיליון תאים למיליליטר למשך 24 שעות וקצרו את תרבות העל-טבעית. באמצעות ערכת ELISA, למדוד את אימונוגלובולין G, אימונוגלובולין A.First, להשיק את GenomicScape גישה פתוחה bioinformatics כלי אינטרנט.

בתפריט נתוני עיון, בחר את ערכת הנתונים הנקראת תאי B אנושיים לתאי פלזמה. הדמיה של פרופיל ביטוי הגנים של גן ייחודי או רשימה של גנים זמינה באמצעות הכלי Expression/Coexpression Report בכלי הניתוח. לאחר מכן, בחר WebSAM של כלי ניתוח כדי לטעון את הכלי SAM.

בחר את תאי B האנושיים לקבוצת הנתונים של תאי פלזמה ובחר את קבוצת הדגימות להשוואה. השתמש במסננים השונים הזמינים כדי להחיל את אפשרויות הסינון המעניינים. כדי להשוות פרופילי ביטויי גנים לכלי SAM, שנה את אפשרויות הסינון כולל שינוי קיפול, מספר תמורות, קצב גילוי כוזב וסוג ההשוואה.

התוכנה ת לחשב את הניתוח ולספק גנים לידי ביטוי דיפרנציאלי בין הקבוצות שנבחרו. במחקר זה נחקרים שינויי הביטוי של הגורמים האפיגנטיים בהידול תאי פלזמה רגילים. באמצעות ניתוח SAM רב-שכבתי, 71 גנים נראים מבוטאים באופן דיפרנציאלי באופן משמעותי בין תאי הזיכרון B, preplasmablasts, plasmablasts, תאי הפלזמה המוקדמים ותאי פלזמה מח עצם עם שיעור גילוי כוזב של פחות מ 5%שלב התא B זיכרון מאופיין על ידי לחץ יתר של 23 גנים שחקן אפיגנטי, כולל 39.13% של אצטילטרנספראזים histone, 30.43% של היסטון מתילטרנספראזס 21.74% מחלבונים מחייבי מתיל ו-4.35% מחלבוני היסטון דאצטילאזס.

14 גנים של שחקנים אפיגנטיים מדוכאים יתר על כן באופן משמעותי בשלב preplasmablast, כולל 50% של מתילטרנספראזות היסטון, 14.28% של מתילטרנספראזות DNA, 21.43% של deacetylases היסטון, 7.14% של demethylases histone, ו 17.14% של אצטילטרנספראזים היסטון. בעקבות הליך זה, מספר ניתוחים כדי לזהות ולהבין שינויים במבנה כרומטין וארכיטקטורה במהלך אלה בידול תאי פלזמה B2 יכול להתבצע. מודל בידול במבחנה זה יאפשר ליצור מספיק תאים כדי להשלים את הניתוח המולקולרי הזה כדי לחשוף הן את המסלולים המעורבים במודלים שלמים והן את השפעתם התמלולית במורד הזרם במהלך התמדול לתאי הפלזמה B2.

ידע זה הנגזר ממחקר זה יכול ליידע ולהדריך על אסטרטגיות אבחון וטיפולי עבור הפרעות בתאי פלזמה, כגון במקרה של מיאלומה נפוצה, סרטן ללא תרופה סופית, שעבורו פרוגנוזה טובה יותר ואסטרטגיות טיפוליות משופרות נחוצות באופן קריטי. אפיון והבנה של שינויים מבניים ואדריכליים אפיגנטיים המשפיעים על כרומטין במהלך בידול תאי פלזמה B2 יהיה עניין מיוחד. ניתן לעשות זאת באמצעות רצף גנים, ERRBS, רצף ATAC, IC וריווח RNA.

הטרוגניות מתונה ניתן לראות באחוז של תאי B פעילים, preplasmablasts, plasmablasts ותאי פלזמה, בהתאם לדם של תורם בריא, המשמש לטיהור תאי B זיכרון.