גירויים חשמליים ומכניים בו זמנית כדי לשפר את פוטנציאל Cardiomyogenic של תאים

זוהי שיטה ליישם גירוי אלקטרומכני על תאים. יש לו יישומים מרובים כדי ללמוד את השפעותיו על אוכלוסיית התא, אימון מראש עבור משלוח in vivo, התבגרות התא. היתרון הוא כי גירויים חשמליים ומכאניים ניתן ליישם עם אותו מכשיר בנפרד או בו זמנית תוך שמירה על ויראלי סטרילי שלם.

טכניקה זו היא גישה עקיפה לטיפול שלנו. טיפול בתאים נחשב לתאים מגורים אלקטרומכניים עשוי להיות אוכלוסיית תאים מעניינת לטיפול במבוא-שריר הלב. שיטה זו שייכת בדרך כלל לשדה הלב וכלי הדם, אבל זה יכול להיות מיושם גם על מערכת העצבים.

זוהי טכניקה קלה הדורשת סבלנות. החלק הקשה ביותר יהיה לעבוד עם החלקים הקטנים, ולשמור על הסטריליות לאורך כל הדרך. יש מעט פרטים של מניפולציה שקשה להסביר, ולכן ההדגמה החזותית ממש מועילה.

התחל בהעברת 12 מבני PDMS מנוקים לצלחות סטריליות של 10 ס"מ. כדי לבטח עיקור מלא, לחשוף את הצלחות לאור UV במשך חמש דקות. לאחר מכן להעביר כל מבנה לצלחת תרבות תאים נפרדת 35 מילימטר, או 6 בארות צלחות עבור זריעת תאים מיידית.

כדי להתחיל זריעת תאים, לשטוף תחילה בקבוק T75 confluent של ATDPCs לב עם חמישה מיליליטר של 1x PBS. כדי לנתק את התאים, הוסף מיליליטר אחד של 0.05%trypsin-EDTA. ודגירה ב37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.

לאחר מכן, הוסף חמישה מיליליטר של מדיום שלם כדי להשבית את טריפסין-EDTA. לאסוף את כל התאים מנותקים בצינור 15 מיליליטר. לשטוף את זכוכית התא פעמיים עם חמישה מיליליטר של PBS כדי לאסוף את כל התאים הנותרים, ולהוסיף אותם צינור 15 מיליליטר.

צנטריפוגה ב 230 גרם במשך חמש דקות ב 22 מעלות צלזיוס. הסר את העל-טבעי, והשהה מחדש את התאים בשני מיליליטר של מדיום שלם, וספיר אותם באמצעות ההמוציטמטר. זרעים 200 microliters של ATDPCs לב לתוך כל צלחת עם מבני PDMS כדי להשיג כ 80% משטח הזריעה מכוסה על ידי תאים למחרת.

דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, ו 5% CO2. מוסיפים בעדינות 2 מיליליטר של מדיום שלם מחומם מראש לכל צלחת. הדגירה את התאים עם המבנים ב 37 מעלות צלזיוס, ו 5% CO2 לילה.

לפני תחילת הליך זה, להקצות שישה מתוך 12 מבנים עבור גירוי אלקטרומכני, ולשמור שישה עבור פקדים שאינם מגורה. השתמש 70% אתנול כדי לנקות את יחידת הגירוי. מניחים את יחידת הגירוי, אלקטרודות סטריליות, פינצטה בתוך ארון הזרימה.

על מנת לתפעל בקלות את האלקטרודות והמבנהים, הסר 90% מהמדיום מכל לוחית תרבות תאים. מקם את מבני PDMS במיקום הנכון לכיוון המגנט כדי לבטח משיכה מגנטית בין מגנטים קבועים וניידים. שני שלבים קודמים אלה שבהם אתה מטפל במבנוני PDMS הזרעים של התא ובאלקטרודות תוך שמירה על הסטריליות לאורך כל התהליך הם הקריטיים ביותר.

לאחר מכן, חבר את חוט הפלטינה למחברי האלקטרודה. כוון את חלק ה- PTFE של האלקטרודות בחללים המיועדים להן במבנונים של PDMS. הוסף 2.5 מיליליטר של מדיום שלם טרי, מחומם מראש לכל מבנה.

לאחר שכל מבני ה-PDMS ממוקמים ומחוברים חשמלית לפלטפורמה, הנח את הפלטפורמה בחזרה ב-37 מעלות צלזיוס ובאינקובטור 5%CO2. לאחר מכן חבר את המקור החשמלי והמכני. כדי להגדיר את תוכנית הגירוי, לציין משטרים גירוי חשמלי ומכאני באמצעות ממשקי המשתמש של ממריצה חשמלית ואת היישום, אשר שולט על גירוי מכני.

כדי להגדיר את הסנכרון, הפעל את המריצה החשמלית והמתן עד שהתפריט הראשי יופיע בתצוגה. לאחר מכן בחר באפשרות שתיים, ערוך רצף, בנוסף ל- Enter. כדי לערוך את תפריט הרצף, השתמש בכרטיסיה מצב כדי לבחור הנוכחי"על-ידי לחיצה על פלוס" והקשה על Enter"עבור התקופה, בחר 1000"עם פלוס/מינוס והקש Enter"וללשונית מצב הדק, בחר חיצונית לפי תוכנה והקש Enter"עבור הכרטיסיה משרעת, בחר 1"עם פלוס/מינוס והקש Enter"לאחר מכן, בחזרה בתפריט הראשי, בחר באפשרות 4 ולאחר מכן צור רצף והקש Enter"במקטע הגירוי המכאני של לוח היישום של הבקרה, כתוב תחילה 1000"בפקד הטקסט של תקופת החיבור.

לאחר מכן כתוב 500 אינץ' בבקרת הטקסט בזמן ON, כדי להגדיר את משך הדופק המכאני. לבסוף, כתוב 2000"בפקד טקסט הטיול כדי לספק התארכות של 10%.. שנה את מדיית התא פעמיים בשבוע, על-ידי הסרה תחילה של המדיה הישנה ולאחר מכן הוספת מדיה חמה ורעננה בצידי התמיכה ב- PDMS.

ביום השביעי, בסוף הניסוי, אוספים את הדגימות כמתואר בכתב היד. ATDPCs לב מגורה אלקטרומכנית שיפרה את הפוטנציאל הלבבי שלהם. זה היה מסומן על ידי PCR בזמן אמת מראה ביטוי מוגבר של גנים לב מוקדם ומאוחר במיוחד גורם שעתוק לב GATA-4, הסמן המבני בטא מיוסין שרשרת כבדה, ואת הגן הקשורות לסידן Connexin43.

כתמי פאלודין נגד סיבי actin הראו כי רוב התאים מיושרים על פי התבנית האנכית. התפלגות Connexin43 הייתה בעיקר בציטופלסמה, וב קרום הפלזמה, ותרמה לתקשורת תאית דרך צמתים של פערים. גורמי שעתוק MEF2 ו- GATA-4 אותרו בגרעינים ב- ATDPCs לבביים.

אבל GATA-4 לא זוהה ב ATDPCs תת עורית. סמנים ציטופלסמי SERCA2, ו סרקומרי אלפא-actinin, לא הראה ארגון סרקומר בוגר אופייני קרדיומיוציטים. ומכות לא נצפו בשליטה ואוכלוסיות תאים מגורה.

מונוליאר תאים בריא בתחילת פרוטוקול זה ושמירה על הסטריליות לאורך כל ההליך הם קריטיים. לאחר איסוף הדגימה, ניתן לבצע את טכניקות ביטוי החלבון הגנום הסטנדרטיות. טכניקה זו מסייעת להבין טוב יותר את ההשפעה של גירויים חשמליים ו/או מכניים של תאים.

עד לאחרונה, זה היה בלתי אפשרי להשתמש באותו מכשיר עבור שניהם גירוי, אשר עשה את התוצאות קשה יותר להשוות.