טיהור וניתוח של נוגדן חד שבטיים מן הסינית שחלות אוגר תאים באמצעות מערכת Microbioreactor חקן אוטומטי

פרוטוקול זה מטפל בניתוח של דגימות מוגבלות המתקבלות ממיקרוביורקטורים כדי לחלץ מידע חיוני על תכונות האיכות הקריטיות של המוצרים. יתרון נוסף של טכניקות אלה הוא שהם משתמשים בזמנים מינימליים של ניתוח כדי לקבוע את תכונות המפתח המכתיבות את הפרמטרים האיכותיים של המוצר המיוצר. ההליך המדגים יהיה דיוויד פאוורס, טליה פייסון ופיליפ אנגרט, עמיתי מחקר מהמעבדה שלי.

התחל על ידי פתיחת התוכנה המחוברת למערכת הטיהור והצבת 15 צינורות חרוטיים מיליליטר כדי לאסוף את הנוגדן המטוהר eluate ו 50 צינורות חרוט מיליליטר כדי לאסוף את הזרימה דרך במהלך לשטוף מלח גבוה לתוך אספן השבר. לאחר מכן, להוסיף 0.22 מיקרומטר נקבובית מסוננת נזילת תרבות התא שנקטפו למזרק ריק 12 מיליליטר עם חריר כתרים. לאחר הסרת המכסה, הכנס את חריר המזרק ליציאת ההזרקה הידנית של מערכת הטיהור.

סובב את המזרק כדי להדק אותו במקום ולדכא את הבוכנה עד שכל נפח המדגם מוזרק וגלוי בלולאת דגימת נפח גדולה של 10 מיליליטר. בחר את השיטה השמודת ולחץ על הפעל כשתתבקש על-ידי תוכנת הכלי. כאשר כל הנוגדן כבר חמק, מיד לנטרל את החלבון המטוהר עם בסיס אחד טריס טוחן ל- pH של כ 5.5.

כדי לרכז את הנוגדן המטוהר על ידי צנטריפוגה, מניחים 100 מסנני קילודלטון לתוך צינורות איסוף סינון. לשטוף את המסננים עם 500 microliters של מים מזוקקים כפולים, ולאחר מכן צנטריפוגה. חזור על שטיפה של המסנן פעמיים.

לאחר הכביסה השנייה, להשליך את הסינון ולהעביר את המסננים שטף צינורות צנטריפוגה חדשים. לאחר מכן, להוסיף 500 microliters של מדגם לכל מסנן עבור צנטריפוגה. בסוף הספין, להפוך את המסנן לתוך צינור אוסף חדש כדי לקבל את המדגם מרוכז עם צנטריפוגה סופית.

לתיוג ובידוד של N-glycan, יש לדלל 7.5 מיקרוליטרים של כל דגימת נוגדנים מרוכזת. עם 15.3 מיקרוליטרים של ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפיה נוזלית או מים ברמה LCMS בצינורות מיליליטר מההערכה, ולפרק את הנוגדנים עם שישה מיקרוליטרים של 5% פתרון של חומר שטח ידידותי לאנזימים וספקטרומטריה המונית ב 90 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. בסוף denaturation, לאפשר את הדגימות להתקרר לטמפרטורת החדר במשך שלוש דקות לפני הוספת 1.2 microliters של פפטיד N-glycosidase F עבור דגירה של חמש דקות ב 50 מעלות צלזיוס.

לאחר קירור הדגימות במשך שלוש דקות לטמפרטורת החדר, סמן את הדגימות עם 12 מיקרוליטרים של תיוג פלואורסצנטי reagent מומס ב dimethylformamide נטול מים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לדלל את תערובת N-גליצן שכותרתו עם 358 microliters של אצטוניטריל ולהמקם צלחת כרומטוגרפיה אינטראקציה הידרופילית בסעפת ואקום עם שימס ומגש פסולת. מצב בארות עם 200 microliters של מים עם ואקום מותאם 10 כדי 15 kilopascals כדי להבטיח כי הנוזל ייקח 15 עד 30 שניות לעבור את שרפי כרומטוגרפיה אינטראקציה הידרופילית.

לצייד את בארות עם 200 microliters של 85%acetonitrile במשך 15 עד 30 שניות לפני טעינת 400 microliters של כל תערובת גליצן שכותרתו על כל באר, החלת ואקום לאחר כל נוזל חדש מתווסף. כאשר כל הדגימות נוספו, לשטוף את בשרף פעמיים עם 600 microliters של 1% חומצה פורמית ו 90% אצטוניטריל לכל לשטוף ולהחליף את מגש הפסולת עם צינורות איסוף 600 מיקרוליטר. לאחר מכן לחמוק N-glycans שכותרתו עם שלושה 30 מיקרוליטר כרכים של חיץ אלוטיום ספקטרומטריה לדלל את דילול הבריכה עם 310 microliters של dimethylformamide באצטוניטריל שנדגם אלגנט.

כדי לנתח את דגימות האלוטיון של N-glycan המסומן במערכת כרומטוגרפיה נוזלית אולטרה-ביצועים יחד עם גלאי פלואורסצנטי וזמן מרובע של ספקטרומטר מסת טיסה, השתמש ב- 50 מילמולרים אמוניום formate ו- 100% LCMS אצטוניטריל כיתה עבור השלבים הניידים. הגדר את קצב הזרימה הראשוני ל- 0.4 מיליליטר לדקה, כאשר שיפוע LC מספק אמוניום פורמט הולך וגדל במהלך שלב האלוטיון. הגדר את גלאי הפלואורסצנטיות כדי למדוד גירוי של 265 ננומטר ו פליטה של 425 ננומטר עם קצב דגימה של שני הרץ.

הגדר את זמן הטיסה המרובע למצב רגישות ליונים של MS1 חיובי עם טווח מסה של 100 עד 2,000 דלתונים, זמן סריקה של 0.25 שניות ורכישת נתוני רצף. לאחר מכן לטעון את הדגימות לתוך סמפלר אוטומטי להגדיר 10 מעלות צלזיוס ולהפעיל את השיטה טעונה. כדי להפוך דגימה להתפלה כהכנה לניתוח גרסאות טעינה, הצמד את העצור התחתון של עמוד התפלה של 0.5 מיליליטר, שחרר את פקק העליון והצב את עמודת ההתפלה בצינור צנטריפוגה של 1.7 מיליליטר.

העבר את העמודה החדשה לתוך צינור microcentrifuge חדש ולהוסיף 80 microliters של 3.5 מיליגרם לכל פתרון נוגדנים מיליליטר לראש העמוד. ישר את העמודה לכיוון המקורי והפוך את העמודה לצנטריפוגה. ואז להשליך את עמוד ההתפלה ביסודיות לערבב את המדגם מרוכז.

מדללים את הדגימה לריכוז של שני מיליגרם למיליליטר ב-25 מיקרוליטרים של מים אולטרה-חמים באר אחת של צלחת של 96 באר ומוסיפים חמישה מיקרוליטרים של מאגר תיוג וחמישה מיקרוליטרים של תיוג רייג'נט ל באר. לאחר דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר המוגנת מפני אור, מערבבים 60 מיקרוליטרים של מים בדרגת רריג'נט עם הדגימה ומכסים את הצלחת עם חותם צלחת לצנטריפוגה. כדי להכין את שבב משתנה המטען, להסיר את פתרון האחסון ולשטוף בארות אחד, שלוש, ארבע, שבע, שמונה ו -10 עם מים.

החלף את המים במאגר פועל pH 7.2 והוסף 750 מיקרוליטרים של חיץ פועל לצינור החיץ. לחץ על בטל טעינת צלחת בממשק המשתמש של המכשיר והסר את החותם מהצלחת 96 באר. הכנס את הצלחת ואת צינור המאגר לנקודות שצוינו על מגש מדגם GX2 ולחץ על צלחת טעינה.

מניחים את השבב בתא השבב, סוגרים את המכסה לתא השבבים, בוחרים את גרסת טעינת החלבון HT כאשר תתבקשו, ולחצו על 'הפעל'. טיהור דגימת תרבות התאים שנקטפה מהביו-ראקטור המיקרו-צירי האוטומטי על ידי כרומטוגרפיה נוזלית של חלבון מהיר מאפשר אפיון תכונות האיכות הקריטיות של החלבונים המטוהרים בשיטות אנליטיות שונות במורד הזרם, כפי שהוכח. נתוני N-glycan של נוגדנים חד שבטיים המיוצרים על ידי אוגר סיני המעובדים על ידי ספקטרומטריית מסה צריכים להיראות דומים כרומטוגרמות מייצגות אלה.

גודל הדרת כרומטוגרפיה פיזור אור זווית מרובה ניתן להשתמש כדי להעריך את פרופיל הצבירה ואת המשקל המולקולרי של הנוגדן. כמות הדגימה הקטנה וחשיבות הצבירה הן תכונות איכות קריטיות להפוך טכניקה זו לכלי אנליטי משלים בעל ערך רב למערכת המיקרוביורקס האוטומטית. התוצאה של אלקטרופורזה של אזור נימי מיקרו היא אלקטרופרוגרמה ו ניתן להשתמש בה כדי להראות את פרופיל וריאנט המטען לנוגדן חד שבטי, חתימה ייחודית עבור החלבון הנחקר כי הוא רגיש מאוד pH ההפעלה.

צריכת חומצות אמינו יכולה גם להיות במעקב כדי לקבוע אם דלדול גורם לשינויים בתכונות האיכות הקריטיות של הנוגדן. חשוב להבטיח טיהור נכון ויעיל של המוצר המיוצר, גם כאשר השלבים האנליטיים יכולים להתבצע רק עם חלבון מטוהר כראוי. המוצר יכול גם להיות נתון מיפוי פפטיד ובדיקות יציבות.

אבל ברגע שהחלבון שימש לשיטת אפיון אחת, בדרך כלל לא ניתן להשתמש בו לשיטת אפיון אחרת. טכניקות אלה מאפשרות ניתוח של מוצרים המיוצרים מנפח קטן, פלטפורמות סינון ביו-מעבד תפוקה גבוהה כדי להבין את ההשפעה של פרמטרים ביו-מעבדים על איכות המוצר. חלק מטכניקות אלה להשתמש חומצה פרכלורית מרוכזת, חומצה פורמית, N-dimethylformamide, כל אלה מסוכנים ויש לטפל בזהירות תוך לבישת ציוד מגן הנכון.