באמצעות את Protozoan סנדלית caudatum כמו רכב עבור זיהומים שמקורם במזון הזחלים דג זברה

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה על הדינמיקה של קולוניזציה וזיהום על ידי מיקרואורגניזמים במערכת העיכול. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם כי היא מייצגת יותר של זיהומים המועברים במזון בבני אדם, כי זה מקטין את הנזק לרקמות פוטנציאליות בדגים לעומת gavage אוראלי. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כמו צעדי הכביסה יכול להיות קשה לבצע בגלל האופי מאוד מוטיבציה של paramecia.

מתרבות גידול חיה, להוסיף מיליליטר אחד של תרבות paramecium ומיליליטר אחד של תרבות e-coli MG1655 לבקבוק תרבות רקמה עשרה מיליליטר המכיל שמונה מיליליטר של מדיום E3. מערבולת קלה את הבקבוק לפני הצבתו ב 22 מעלות צלזיוס עובר מיליליטר אחד של התרבות שיתוף לתוך בקבוק חדש עשרה מיליליטר רקמה תרבות המכיל תשעה מיליליטר של מדיום E3 טרי, בתוספת 108 מושבה להרכיב יחידות למיליליטר של e-coli MG1655, כל שבועיים. כדי לקבוע את מחצית החיים החיידקית בתוך פרמקיום לספור את מספר paramecia מצפיפות אופטית של 600 חיידקים paramecia שיתוף תרבות ולהוסיף aliquot מיקרוליטר 50 של על טבעי חדש 1.5 מיליליטר מיקרוצנטריפוגה צינור כל שעה במשך שש שעות.

הוסף 950 מיקרוליטרים של חומר שטח לא יוני באחוז אחד ב-PBS לצינורות. ו lyse paramecia בכל מדגם עם דקה אחת של מערבולת, ולאחר מכן לעשות אחד מכל עשרה דילולים של כל מדגם PBS סטרילי. וצלחת 100 microliters של כל דילול על צלחות סלקטיביות לדגירה 16 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.

למחרת, ספור רק את המושבות הבודדות והמבודדות כדי לקבוע את מספר המושבות החיידקיות על הצלחת. ולזהות צלחת עם דילול המניב 30-300 יחידות יוצרות מושבה. ביום שלפני הזיהום, לאסוף נפח אחד של חיידקים מצפיפות אופטית של 600 תרבות לטיפול על ידי צנטריפוגה.

ולהשעות מחדש את כדורי במיליליטר אחד של E3 בינוני לכל צינור. לאחר מכן, מוסיפים מיקרוליטר אחד של כתם חיידקי מתאים לכל השעיה חיידקית. ולהגן על הצינורות צילום הלבנה עם רדיד אלומיניום.

לפני הדגירה דגימות חיידקים עם סיבוב סוף מעל סוף במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לשטוף את החיידקים פעמיים בנפח גדול של E3 בינוני כדי להסיר את הצבע העודף. ולהשעות מחדש את כדורי במיליליטר אחד של מדיום E3 טרי לכל צינור.

לאחר מכן, מוסיפים מיליליטר אחד של השעיה חיידקית לכל אחד משני flasks של paramecia טרי לכל תנאי עבור דגירה של שעתיים בטמפרטורת החדר. משוך את התוכן של שני flasks לכל תנאי לתוך צינורות חרוט בודדים 50 מיליליטר. וכדור הדגימות על ידי צנטריפוגה.

באמצעות פיפטה sterilogical, להחליף כעשרה מיליליטר של על טבעי E3 בכל צינור עם עשרה מיליליטר של מדיום E3 טרי עבור 3 שוטף על ידי צנטריפוגה. לאחר הכביסה האחרונה, להסיר כעשרה מיליליטר של על טבעי E3, דואג לא לשבש את כדורי, ולהשעות מחדש את כדורי בעשרה מיליליטר הנותרים של מדיום E3. להעביר 500 microliters של כל השעיה לתוך צינורות microcenrifuge בודדים 1.5 מיליליטר גלולה paramecia על ידי צנטריפוגה.

השליכו 400 מיקרוליטרים של העל-טבעיים, והוסיפו 20 מיקרוליטרים של 36.5 אחוז פתרון פורמלדהיד ל-100 המיקרוליטרים הנותרים של פרמנסיה עם צינורות עדינים. לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, למדוד את הנפח הכולל בפועל בכל צינור על ידי פיפטה לפני ספירת מספר paramecia מת למיליליטר. עבור זיהום המועבר במזון של דג הזברה, לדלל את דגימות paramecia פעמיים עשר לחמש paramecia למיליליטר של ריכוז בינוני E3.

ולהוסיף 3 מיליליטר של כל תרבות paramecia ל באר אחת של צלחת 6 גם לכל מצב. לאחר מכן, להעביר עשרה דגי זברה הרדמה לכל באר בנפח מינימלי של נוזל. ודורגים את התרבויות המשותף במשך שעתיים ב-30 מעלות צלזיוס באינקובטור של היום בתנאי אור יום.

כדי לקבוע את קצב הטרף, צפה בדג הזברה הניזון תחת מיקרוסקופ סטריאו תוך רכישת צילומי וידאו של לכידת הטרף. לכידת טרף מאופיינת בפגיעה של דג זברה לכיוון הטרף. כל שביתה מוערכת כאירוע לכידת טרף אחד.

בסוף הדגירה, לשטוף את דג הזברה ב 5 בארות שונות המכילות 3 מיליליטר של טרי E3 בינוני בתוספת 100 מיליגרם לליטר של tricaine לגם. ולהטביע כל דג זברה ב 3 מיליליטר של 1 אחוז נמוך להמיס אגורוז בצלחת שחורה היטב שש באר. כאשר כל הדגים הוטבעו, מניחים את הצלחת תחת מיקרוסקופ סטריאו ולהשתמש קצה טעינת ג'ל קצוץ כדי לוודא כי הראשים הם בצד שמאל ואת הזנבות הם בצד ימין בכל שדה צפייה.

המתן 5 דקות עד שהאגרוז יגדיר, ולאחר מכן שכב על הדג המוטבע עם מדיום E3 טרי בתוספת tricaine, ותמונה דג הזברה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להעריך את ההתקדמות של זיהומים חיידקיים. עבור e-coli פתוגניים, צפיפות החיידקים הראשונית היא 790 חיידקים לכל פרמקיום, והחיידקים מושפלים בתוך vacuoles של כל אטום חתך paramecium עם זמן מחצית חיים של כ 2.3 שעות. הטרף מלווה בהתנהגות בולטת אופיינית, וקביעת שיעור הטרף מבוססת על ההנחה שכל שביתה מובילה להפנמה של פרמקיום אחד.

לאחר העיכול, חיידקים חופשיים לנוע מן foregut לאמצע המעי האחורי, שם הם מזוהים כ 1 עד 2 שעות לאחר תחילת הטרף. S-enterica, למשל, לוקליזציה בעיקר רירית המעי עם כמה פלישה אפיתל המוביל חדירה של נויטרופילים לתוך האפיתל. אל תשכח כי עבודה עם סוגים מסוימים של חיידקים יכול להיות מסוכן מאוד, כי אמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי הנכון תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.