מערכת אינדוקציה מקובצים באשכולות הפיוניות על ידי סוכר פתרון טבילה טיפול בשתילי תודרנית לבנה
15 בפברואר 2019
המטרה של פרוטוקול זה היא כדי להדגים כיצד לגרום הפיוניות באשכולות בפסיגי הזרע של שתילים תודרנית לבנה על ידי טיפול טבילה עם פתרון בינוני המכילים סוכר וכיצד להתבונן מבנים תאיים כגון מהכלורופלסט microtubules בתאי המשמר באשכולות באמצעות קונאפוקלית לייזר מיקרוסקופ.
שיטה זו ענתה על שאלת מפתח של ביולוגיה התפתחותית של הצמח. כלומר, מה החשיבות של הפצה מרחבית של stomata? מערכת אינדוקציה שלנו עבור stomata מקובצים באמצעות פתרון סוכרוז הוא די קל וישים ישירות קווים מהופנטים או מוטציה של ערבידופסיס thaliana.
כדי להתחיל, להוסיף 1.1 גרם של מלחים בינוניים Murashige-Skoog ו 15 גרם של סוכרוז לסק. מוסיפים 490 מיליליטר של מים מזוקקים לבקבוק ומערבבים עם בר הערבוב. השתמש אשלגן הידרוקסידי כדי להתאים את ה- pH ל 5.8.
לאחר מכן לדלל את הפתרון עם 500 מיליליטר של מים מזוקקים ולהעביר את הפתרון מדולל לבקבוק בינוני. לאחר מכן, תסגור אוטומטית את הפתרון. הכן את פתרון הסטריליזציה בהתאם לפרוטוקול הטקסט.
לאחר מכן, עובדים בתנאים אספטיים, מניחים כ -50 זרעי A.thaliana מהוססים הנושאים סמן פלואורסצנטי לתוך צינור 1.5 מיליליטר. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של 70% אתנול לצינור ומערבבים על ידי היפוך הצינור חמש פעמים. לאחר מתן הזרעים לשקוע לתחתית הצינור, בעדינות להסיר את האתנול עם micropipette.
מוסיפים מיליליטר אחד של פתרון עיקור לזרעים והפוך את הצינור חמש פעמים כדי לערבב. בעדינות להסיר את פתרון עיקור מן הזרעים עם micropipette. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של מים סטריליים.
הוסף 1.5 מיליליטר של פתרון Murashige-Skoog לכל באר של צלחת 24 באר. לאחר מכן מוסיפים שני זרעים מעוקרים לכל באר. באמצעות שתי שכבות של פרפילם, תדביק את המכסה לצלחת.
לאחר מכן, להעביר את הצלחת לתא צמיחה כדי דגירה במשך 14 ימים. ראשית, להעביר 30 microliters של פתרון Murashige-Skoog מצלחת 24 באר למרכז מגלשת זכוכית. באמצעות ניתוח מספריים, הסר את הקוטילדון משנייה בת 14 יום.
לצוף הקוטילדון עם צד התצפית פונה כלפי מעלה על טיפת פתרון Murashige-Skoog. הכן את הקוטילדון על פי השיטות שתוארו בעבר בכתב העת של ניסויים חזותיים. שים את הדגימה על הבמה של מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי.
לבסוף, השתמש בתאורה של שדה בהיר כדי לבחור תאי מגן מקובצים באשכולות לתצפית. בפרוטוקול זה, אשכולות stomatal היה המושרה שתילים A.thaliana. תאי השמירה המקובצים באשכולות הגדלים בסוקרט המכילים מדיום בעל כלורופלסטים גדולים יותר מאשר תאי שמירה הגדלים בתנאים נטולי סוכרוז.
הגדלה של כלורופלסטים אושרה עם סמן כלורופלסט סטרומה ושפעת אוטומטית כלורופיל, מה שמרמז כי טיפול סוכרוז הביא הצטברות תבואה עמילן בכלורופלסטים. בנוסף, תצפית קונפוקאלית של אמבט GFP-6 גילתה כי המיקרוטובולים קליפת המוח היו מכוונים באופן רדיאלי בתאים שטופלו בסוקורוז, בדיוק כמו בתאי השמירה נטולי סוכרוז. למעשה גילינו את השיטה הזו בטעות.
לאחר הממצא, בדקנו את התגובה הסביבתית של stomata מקובצים. אנחנו מאמינים שהמערכת שלנו יכולה לעזור לבחון את המשמעות של התפלגות הסטומטה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מדגים כיצד להשרות הופCעת פקיקים מקובצים בעלי cotyledons של נבטי Arabidopsis thaliana באמצעות מצע המכיל סוכר. כמו כן, הוא מתאר את התצפית על מבנים תוך-תאיים, כגון כלורופלסטים ומיקרוטובוליים, בתאי השמירה באמצעות מיקרוסקופיית לייזר קונפוקלית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התפתחות צמחים
- תפקוד פיתחים
- טכניקות מיקרוסקופיה
רקע
- הפיוניות ממלאות תפקיד מכריע בחילוף גזים ובוויסות מים בצמחים.
- ההפצה המרחבית של הפיוניות משפיעה על הפיזיולוגיה וההתפתחות של הצמח.
- Arabidopsis thaliana הוא אורגניזם מודל לחקר הביולוגיה של הצמחים.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית בלייזר מאפשרת תצפית מפורטת על מבנים תאיים.
מטרת המחקר
- השראה של סטומות מקובצות בנבטי Arabidopsis thaliana.
- בחינת המבנים התוך-תאיים בתאי שמירה.
- אספקת שיטה שניתן ליישם על קווים טרנסגניים או מוטנטיים.
שיטות שנמצאו בשימוש
- הכנת מצע המכיל סוכר באמצעות מלחים של Murashige-Skoog וסוכרוז.
- כוונון ה-pH ל-5.8 באמצעות פוטסיום הידרוקסיד.
- טיפול בטבילה של שתילים במצע שהוכן.
- תצפית על תאי שמירה באמצעות מיקרוסקופיית לייזר קונפוקלית.
תוצאות עיקריות
- השראה מוצלחת של נקבים מקובצים בעלי cotyledons.
- ויזואליזציה של כלורופלסטים ומיקרוטובולים בתאי שמירה.
- הוכחת התשובתיות של השיטה לקווי Arabidopsis שונים.
- אספקת תובנות לגבי ההתפלגות המרחבית של הנקבים.
מסקנות
- השיטה יעילה למחקר של התפתחות הסטומות.
- היא משפרת את ההבנה של תפקוד הסטומות בצמחים.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על פרוטוקול זה להשגת תובנות נוספות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנת ההתפלגות המרחבית של הפתחים (stomata) מספקת מידע למודלים חיזויים של יעילות שימוש במים וקיבולת פוטוסינתטית בצמחים, אשר רלוונטיים לאופטימיזציה של יבול גידולים ולעמידות למעמקים בביוטכנולוגיה חקלאית. מערכת השראה זו מאפשרת בחינה מכניסטית של ביולוגיית תאי השמירה ללא שינוי גנטי, ובכך תומכת בתיקוף מטרות במסלולי איתות בצמחים. השיטה מספקת פלטפורמה ניתנת להרחבה ולשחזור להערכת השפעות של תרכובות על דפוסי הפתחים ותפקודם במסלולי גילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של מנגנוני דפוס מרחבי בהתפתחות פיוני העלה (stomata) כדי לתקף מטרות במסלולי איתות בצמחים.
- ערך תפעולי: מספק מערכת שאינה גנטית וניתנת להשראה כימית, הישימה לקווי תאים טרנסגניים או מוטנטיים לצורך הפחתת סיכונים של המטרה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר פלטיים פנוטיפיים כמותיים (סטומות מקובצות, הגדלת כלורופלסטים) לסריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening) של תרכובות ביו-אקטיביות.
- ערך תפעולי: משתמש במצע sucrose-MS סטנדרטי ובקריאות מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להבטיח שחזור של הבדיקה במעבדות שונות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר בין צפיפות הפקעים הסטומטליים לסממנים ביולוגיים תוך-תאיים (גודל הכלורופלסט, אוריינטציית המיקרוטובולים) לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים במחקרי תגובה לעקה בצמחים.
- ערך תפעולי: תומך ברצף החוקרי מגילוי גנים/מטרות ועד לאישור פנוטיפי במערכות הרלוונטיות למחלה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של גילוי מוקדם, שבהם סינון פנוטיפי ותיקוף מטרה קודמים לזיהוי מוביל, ובמיוחד בנתיבי פיתוח של חומרים אגרוכימיים ותכונות צמחים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות לגבי משמעות המרווחים הסטומטליים באמצעות התקבצות הניתנת להשראה ללא שינוי גנטי.
- סריקה: מאפשרת מערכות מוכנות לבדיקה עם פנוטיפים כמותיים של תאי שמירה לצורך סריקת ספריות תרכובים.
- אנליטיקה: מספקת תוצאות קונפוקאליות כמותיות (גודל כלורופלסטים, אוריינטציית מיקרוטובוליים) להשוואת השפעות הטיפולים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין תצפיות תוך-תאיות לתפקוד הסטומטלי לצורך מידול חזוי של תגובה למעיקות.
- שימוש חוזר ארגוני: מכוננת פלטפורמת השראה לשימוש חוזר, ישימה על פני קווי Arabidopsis מוטנטיים וטרנסגניים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חזוי בתיקוף מטרות באמצעות הפחתת סיכון פנוטיפית של מנגנוני דפוס פתחים (stomata).
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה באמצעות מצע sucrose-MS מוגדר וכיוון pH מבטיחה הדירות.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מוקדמתים של "המשך/עצור" (go/no-go) לגבי תרכובות המשפיעות על התפתחות הפתחים, ובכך מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתעדוף מטרות מותאם סיכון, בהתבסס על תיקוף פנוטיפי במערכות של פתחים בצבצוב (clustered stomata).
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות רקמה של צמחים, טכניקה סטרילית ומיקרוסקופיה קונפוקלית.
- תלוי בגישה לאוטוקלאב, לתאי גידול ולמיקרוסקופים של סריקת לייזר.
- מחייב סטנדרטיזציה של עיקור זרעים והכנת מצע סוכרוז בין הצוותים.
- התאמה למינים אחרים או לסוגי רקמה שונים עשויה לדרוש אופטימיזציה של ריכוז הסוכרוז ומשך זמן החשיפה.
- מוגבל לפנוטיפים הניתנים לצפייה בעלי דקל (cotyledons); הרחבה לבדיקות של צמח שלם עשויה להזדקק לאישור נוסף.
שאלות נפוצות בתחומי הביו-פארמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:31
Preparation of 3% Sucrose Containing 1/2 Murashige-Skoog Medium Solution
1:12
Induction of Clustered Stomata by Sucrose-containing Medium Solution Immersion Treatment
2:30
Microscopic Observation of Clustered Stomata
3:15
Stomata Clustering Induced in A. thaliana Seedlings
4:06
Conclusion
