Name: אפליה של שבע קבוצות משנה תא החיסון על ידי שני-fluorochrome לזרום Cytometry (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: למדו פרוטוקול ציטומטריית זרימה לזיהוי שבע קבוצות תאי חיסון בדם פריפרי אנושי באמצעות שני פלואורוכרומים בלבד. שיטה זו מאפשרת רישום חמישה סמנים נוספים לניתוח אוכלוסיות תאים מורכבות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי של דלקת מפרקים, השלד והשרירים ועל מחלות עור, < https://www.niams.nih.gov/>, פרס מספר P30-AR053503; קרן גם אני, www.stablerfoundation.org; לאומי המכון לאלרגיה, מחלות זיהומיות, www.niaid.nih.gov, T32AI007247; נינה אירלנד תוכנית עבור ריאות בריאות (NIPLH), https://pulmonary.ucsf.edu/ireland/.

<ol><li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deep+profiler%27s+guide+to+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A deep profiler's guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33 (7), 323-332 (2012).</li>
<li>Boin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+discrimination+of+seven+lineage+markers+by+using+two+fluorochromes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric discrimination of seven lineage markers by using two fluorochromes.</a> PLoS ONE. 12 (11), (2017).</li>
<li>Zola, H., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZola%2C+H+%22Leukocyte+and+Stromal+Cell+Molecules%3A+The+CD+Markers%22">Leukocyte and Stromal Cell Molecules: The CD Markers</a>. , Wiley. (2007).</li>
<li>Lambert, C., Genin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD3+bright+lymphocyte+population+reveal+%CE%B3%CE%B4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+B%3A+Clinical+Cytometry%22%5BJournal%5D)">CD3 bright lymphocyte population reveal γδ T cells.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 61 (1), 45-53 (2004).</li>
<li>Ginaldi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+T+cell+antigens+in+normal+peripheral+blood+lymphocytes%3A+a+quantitative+analysis+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Differential expression of T cell antigens in normal peripheral blood lymphocytes: a quantitative analysis by flow cytometry.</a> Journal of Clinical Pathology. 49 (7), 539-544 (1996).</li>
<li>Park, J., Han, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-color+Multitarget+Flow+Cytometry+Using+Monoclonal+Antibodies+Labeled+with+Different+Intensities+of+the+Same+Fluorochrome%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single-color Multitarget Flow Cytometry Using Monoclonal Antibodies Labeled with Different Intensities of the Same Fluorochrome.</a> Annals of Laboratory Medicine. 32 (3), 171-176 (2012).</li>
<li>Mansour, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple+labeling+with+two-color+immunoflorescence+using+one+light+source%3A+A+useful+approach+for+the+analysis+of+cells+positive+for+one+label+and+negative+for+the+other+two%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Triple labeling with two-color immunoflorescence using one light source: A useful approach for the analysis of cells positive for one label and negative for the other two.</a> Cytometry. 11 (5), 636-641 (1990).</li>
<li>Bocsi, J., Melzer, S., Dähnert, I., Tárnok, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OMIP-023%3A+10-Color%2C+13+antibody+panel+for+in-depth+phenotyping+of+human+peripheral+blood+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">OMIP-023: 10-Color, 13 antibody panel for in-depth phenotyping of human peripheral blood leukocytes.</a> Cytometry Part A. 85 (9), 781-784 (2014).</li>
<li>Van Dongen, J. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EuroFlow+antibody+panels+for+standardized+n-dimensional+flow+cytometric+immunophenotyping+of+normal%2C+reactive+and+malignant+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes.</a> Leukemia. 26 (9), 1908-1975 (2012).</li>
<li>Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-intensity+multiplexing%3A+Simultaneous+seven-marker%2C+two-color+immunophenotyping+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-intensity multiplexing: Simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 61 (2), 142-152 (2004).</li>
<li>Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Modular+Assay+for+Detailed+Immunophenotyping+of+Peripheral+Human+Whole+Blood+Samples+by+Multicolor+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (8), (2016).</li>
<li>Hønge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., Møller, B. K., Erikstrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+recovery+of+frozen+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry.</a> PLOS ONE. 12 (11), e0187440(2017).</li>
<li>Roederer, M. K. FACS analysis of lymphocytes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoederer%2C+MK+%22Handbook+of+Experimental+Immunology%22">Handbook of Experimental Immunology</a>. 49, Blackwell Science. (1997).</li>
<li>Srivastava, P., Sladek, T. L., Goodman, M. N., Jacobberger, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptavidin-based+quantitative+staining+of+intracellular+antigens+for+flow+cytometric+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Streptavidin-based quantitative staining of intracellular antigens for flow cytometric analysis.</a> Cytometry. 13 (7), 711-721 (1992).</li>
<li>Maecker, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selecting+fluorochrome+conjugates+for+maximum+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity.</a> Cytometry Part A. , (2004).</li>
<li>Noonan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+activated+marrow-infiltrating+lymphocytes+induces+measurable+antitumor+immunity+in+the+bone+marrow+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of activated marrow-infiltrating lymphocytes induces measurable antitumor immunity in the bone marrow in multiple myeloma.</a> Science Translational Medicine. 7 (288), (2015).</li>
<li>Mahnke, Y. D., Beddall, M. H., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OMIP-017%3A+Human+CD4%2B+helper+T-cell+subsets+including+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">OMIP-017: Human CD4+ helper T-cell subsets including follicular helper cells.</a> Cytometry Part A. 83 (5), 439-440 (2013).</li>
<li>Bonecchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Expression+of+Chemokine+Receptors+and+Chemotactic+Responsiveness+of+Type+1+T+Helper+Cells+%28Th1s%29+and+Th2s%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Differential Expression of Chemokine Receptors and Chemotactic Responsiveness of Type 1 T Helper Cells (Th1s) and Th2s.</a> The Journal of Experimental Medicine. 187 (1), 129-134 (1998).</li>
<li>Acosta-Rodriguez, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+phenotype+and+antigenic+specificity+of+human+interleukin+17-producing+T+helper+memory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells.</a> Nature Immunology. 8 (6), 639-646 (2007).</li>
<li>Rivino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+Receptor+Expression+Identifies+Pre-T+Helper+%28Th%291%2C+Pre-Th2%2C+and+Nonpolarized+Cells+among+Human+CD4%2B+Central+Memory+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chemokine Receptor Expression Identifies Pre-T Helper (Th)1, Pre-Th2, and Nonpolarized Cells among Human CD4+ Central Memory T Cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200 (6), 725-735 (2004).</li>
<li>Ye, Z. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+recruitment+of+Th9+cells+stimulated+by+pleural+mesothelial+cells+in+human+Mycobacterium+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Differentiation and recruitment of Th9 cells stimulated by pleural mesothelial cells in human Mycobacterium tuberculosis infection.</a> PloS One. 7 (2), e31710(2012).</li>
<li>Speiser, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD8%2B+T+cells+expressing+HLA-DR+and+CD28+show+telomerase+activity+and+are+distinct+from+cytolytic+effector+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human CD8+ T cells expressing HLA-DR and CD28 show telomerase activity and are distinct from cytolytic effector T cells.</a> European Journal of Immunology. 31 (2), 459-466 (2001).</li>
<li>Caruso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+activation+markers+on+stimulated+T+cells+and+their+correlation+with+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation.</a> Cytometry. 27 (1), 71-76 (1997).</li>
<li>Brenchley, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+CD57+defines+replicative+senescence+and+antigen-induced+apoptotic+death+of+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Expression of CD57 defines replicative senescence and antigen-induced apoptotic death of CD8+ T cells.</a> Blood. 101 (7), 2711-2720 (2003).</li>
<li>Palmer, B. E., Blyveis, N., Fontenot, A. P., Wilson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+Phenotypic+Characterization+of+CD57%2BCD4%2B+T+Cells+and+Their+Association+with+HIV-1-Induced+T+Cell+Dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Functional and Phenotypic Characterization of CD57+CD4+ T Cells and Their Association with HIV-1-Induced T Cell Dysfunction.</a> The Journal of Immunology. 175 (12), 8415-8423 (2005).</li>
<li>Focosi, D., Bestagno, M., Burrone, O., Petrini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD57%2B+T+lymphocytes+and+functional+immune+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">CD57+ T lymphocytes and functional immune deficiency.</a> Journal of Leukocyte Biology. 87 (1), 107-116 (2010).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול המובאת כאן הוכח להיות די גמיש וחסר רגישות לשינויים מכתים מאגר בטמפרטורה, תא דם היקפיים הכנה בשל ביטוי גבוהה של שושלת היוחסין סמנים על פני התא. השלב הקריטי ביותר עבור קבלת נתונים באיכות גבוהה, לשחזור הוא נוגדן טיטור. ראוי לציין, מאז טיטרציה של נוגדנים תמיד להתבצע במהלך ההגדרה של לוח cytometric זרימה, שלב זה לא להוסיף ספסל-זמן נוסף בהתקרבות 2-fluorochrome. טיטור של אנטי-CD3,-CD8,-γδ CD14, - CD19 ו- TCR בעקבות הליך רגיל שבו ריכוז נוגדן להפריד בצורה אופטימלית פסגות חיוביים ושליליים נגזר על ידי מקסימום מכתים אינדקס<s...

Cytometry זרימה היא טכניקה שפותחה כדי לנתח פרמטרים מרובים על חלקיקי יחיד בשיעור של אלפי אירועים לכל השני1. דוגמאות של דגימות נותחו על ידי cytometry זרימה כוללים, אך אינם מוגבלים, תאים, חרוזים, חיידקים, שלפוחית, כרומוזומים. מערכת fluidic מנחה את החלקיקים בשלב החקירה שבו כל חלקיק חותך הנתיב שלו עם לייזרים אחד או יותר, פרמטרים מרובים נרשמים לצורך ניתוח נוסף. קדימה ואת הצד בסורקים, שנוצר על ידי פיזור של האור לייזר טהור, משמשים כדי לזהות אוכלוסית היעד ולאחזר מידע על גודלו היחסי פנימיות מורכבות צפיפות החלקיקים, בהתאמה. כל הפרמטרים האחרים, זה חשבון עבור רוב הנתונים בניתוח cytometric זרימה, נגזרים על ידי הגששים התווית על-ידי fluorochrome מזהה, לאגד מטרות ספציפיות על החלקיקים עניין.
Cytometry זרימה הוא כלי ראשי ללימודי אימונולוגי לזהות ולאפיין אוכלוסיות תאים. לנתח את המורכבות של מערכת החיסון, לוחות ססגוניות מתפתחים כל הזמן כדי להרחיב את מספר סמנים שנרשם בו-זמנית עבור immunophenotyping עמוק של אוכלוסיות תא1. זה מוביל להתפתחות של fluorochromes, והכלים כשרוני עם האחרונים cytometers זרימה באיכות גבוהה העולה על 20 פרמטרים פלורסנט. התוצאה היא תכנון המחקר מורכבים בשל חפיפה ספקטרלי fluorochrome, עלויות גבוהות יותר הקשורים עם מפעילי labelling ומיומנים נוגדנים מותאמים אישית. במספר מקרים, מורכבות ועלויות מופחתים באמצעות לוחות נפרדים של סמנים עבור אוכלוסיות תאים שונים. גישה זו, עם זאת, מועדת לשגיאות, מפחית את המידע בחלונית כל אחד, יכול להיות קשה להחיל על דגימות עם מספר מצומצם של תאים. יתר על כן, הגדלת מספר סמנים מונע עמוק immunophenotyping על מכשירים עם פרמטרים פלורסנט פחות. קודם לכן פיתחנו פרוטוקול מכתימים לזיהוי אוכלוסיית מרכזי המערכת החיסונית (CD4+ ו CD8+ T תאים, התאים γδ T, תאי B, תאי NK, ומונוציטים) בתוך תאי תאי דם היקפיים (PBMCs) על ידי שילוב של שבעה סמנים שושלת היוחסין באמצעות רק שני fluorochromes במקום ה-7 הנדרש באמצעות המסורתי "סמן אחד fluorochrome אחד" הגישה (www.hcdm.org)2,3. הדו ח הראשוני שלנו חקר ואומת הרעיון של שילוב סמני שבע שני fluorochromes עבור immunophenotyping עמוק. בדו ח זה, אנו מציגים פרוטוקול צעד צעד-מאת לבודד, כתם כדוריות דם היקפיים, התמקדות בהיבט המעשי ופתרון צעדים כדי להשיג מכתים מוצלחת.
פרוטוקול זה מתבסס על התצפית כי שושלת היוחסין סמני יש ביטוי קבוע על פני התא, כי האוכלוסייה בכל תא יש שילוב בלעדי של שושלת היוחסין סמנים. ב- PBMCs, ביטוי CD3 subdivides תאים חיסוניים לשתי קטגוריות עיקריות: CD3-חיובי T לימפוציטים ותאי CD3-שלילי. בתוך קבוצת חיובית CD3, CD4+, CD8+ γδ T תאים יכולים להיות מופרדים באמצעות נוגדנים המיועדים אך ורק CD4, CD8, הקולטן γδ. באופן דומה, בתוך קבוצת שלילי CD3, בתאי B, תאי NK, ומונוציטים יכול להיות ייחודי מזוהה באמצעות נוגדנים נגד CD19, CD56 ו- CD14, בהתאמה. בגישה fluorochrome-אחד סמן סטנדרטי אחד, נגד-CD3,-CD4,-CD8, - CD14,-CD19, - CD56 ו- TCR נוגדנים γδ מזוהים עם שבעה fluorochromes שונים. הגישה שלנו משלבת אנטי CD3-CD56, ו- - TCR נוגדנים γδ אחד fluorochrome (הנקראת עבור נוחות fluorochrome A), אנטי-CD4,-CD8, - CD14 ו- CD19 נוגדנים בבית fluorochrome שונים (fluorochrome B). הדבר אפשרי ע י שילוב של נוגדן טיטור וביטוי אנטיגן דיפרנציאלית. CD4 בשני+ ו CD8+ T תאים הן חיוביות עבור נוגדן anti-CD3 ב- fluorochrome A, אבל הם יכולים להיות מופרדים ב- fluorochrome B למקסם את הביטוי של האות CD8 תוך הצבת, עם טיטור אד הוק, האות CD4 בין CD8, התאים חיובי-CD4/CD8 כפול שלילי CD3. תאי T γδ מבטא רמה גבוהה יותר של CD3 מאשר CD4 ו CD8, ולכן הם יכולים להיות מזוהה CD3 גבוהה4. האות הזה הוא מועלה על ידי תיוג γδ תאי T ב- fluorochrome A עם נוגדנים γδ anti-TCR, ובכך לשפר את ההפרדה בין תאי T נמוך CD3 CD3 גבוהה γδ T תאים. בתאי B יכול להיות מזוהה CD3– ב fluorochrome A ו- CD19+ ב- fluorochrome B. כדי להפריד CD3 שליליים תאי NK מתאי B, נוגדן anti-CD56 שימש ב- fluorochrome A האנטי-CD3. דבר זה אפשרי משום CD56 הביע על תאי NK ברמה נמוכה יותר מאשר CD3 על תאי T5. לבסוף, ומונוציטים ניתן לזהות באמצעות שילוב של מאפיינים לפנים לצד פיזור וביטוי של CD14 ב- fluorochrome B.
הרעיון של שילוב עד ארבעה סמנים באמצעות שתי fluorochromes יש ניסיון כבר בהצלחה לפני6,7,8, נעשה שימוש ב פרוטוקול קליני כדי לזהות אוכלוסיות לימפוציטית ממאיר9 . הדוח הקודם גם משולב 7 סמנים (עם ירידה לפרטים שונים של הסמנים פעם בפרוטוקול שלנו) באמצעות שתי fluorochromes, אך גישה זו התבססה על תוויות מתחם של כל נוגדן עם כמות משתנה של fluorochrome10. זהו לעומת השיטה שלנו, אשר משתמשת נוגדנים זמינים מסחרית, ניתן להתאים את תצורת המכשיר והוא יכול לנצל הדור החדש של פולימר fluorochromes.
המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא להרחיב את הגבולות אופטי של רוב cytometers זרימה המאפשר ההקלטה של חמישה סמנים נוספים לחקור אוכלוסיות תאים מורכבים. כתוצאה מכך, ניתן לבצע ניתוח אימונולוגי מתקדמים ב- 6-10 במחיר סביר fluorochrome זרימה cytometers, 2-3 fluorochrome שדה מכשירים ניתן להשיג תוצאות יוצא דופן באזורים עם משאבים מוגבלים. מכשירים מתקדמים יכולים גם ליהנות גישה זו על-ידי שימוש fluorochromes נוספת כדי לבצע ניתוח עמוק יותר של cytometry זרימה כדי ליצור זרימה מודולרי cytometric לוחות מיקוד מספר שושלות באותו הזמן11. זה יכול באופן פוטנציאלי להפחית את מספר לוחות המשמשים cytometry זרימה immunophenotyping מודולרית, להפחית עלויות, שגיאות זמן טיפול. גישה זו מתאימה גם טוב מאוד במקרה של דגימות קלינית עם מספר מצומצם של תאים.

<table><tbody><tr><td>CD3</td><td>BD Biosciences</td><td>562426</td><td>נוגדן לצביעה RRID: AB_11152082</td></tr><tr><td>CD56</td><td>BD Biosciences</td><td>562751</td><td>נוגדן לצביעה RRID: AB_2732054</td></tr><tr><td>TCRgd</td><td>BD Biosciences</td><td>331217</td><td>נוגדן לצביעה RRID: AB_2562316</td></tr><tr><td>CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>555347</td><td>נוגדן לצביעה RRID: AB_395752</td></tr><tr><td>CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>555367</td><td>נוגדן לצביעה RRID: AB_395770</td></tr><tr><td>CD14</td><td>BD Biosciences</td><td>555398</td><td>נוגדן לצביעה RRID: AB_395799</td></tr><tr><td>CD19</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>555413 נוגדן לצביעה RRID: AB_395813</td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>555335 נוגדן לצביעה RRID: AB_398591</td></tr><tr><td>CD56</td><td>BD Biosciences</td><td>555518</td><td>נוגדן לצביעה RRID: AB_398601</td></tr><tr><td>TCRgd</td><td>BD Biosciences</td><td>331211</td><td>נוגדן לצביעה RRID: AB_1089215</td></tr><tr><td>CCR7</td><td>Biolegend</td><td>353217</td><td>נוגדן לצביעה RRID: AB_10913812</td></tr><tr><td>CD45RA</td><td>BD Biosciences</td><td>560674</td><td>נוגדן לצביעה RRID: AB_1727497</td></tr><tr><td>CCR4</td><td>BD Biosciences</td><td>561034</td><td>נוגדן לצביעה <חזק>RRID</חזק>: AB_10563066</td></tr><tr><td>CCR6</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>353419 נוגדן לצביעה <חזק>RRID</חזק>: AB_11124539</td></tr><tr><td>CXCR3</td><td>BD Biosciences</td><td>561730</td><td>נוגדן לצביעה <חזק>RRID</חזק>: AB_10894207</td></tr><tr><td>CD57</td><td>BD Biosciences</td><td>562488</td><td>נוגדן לצביעה <חזק>RRID</חזק>:</td></tr><tr><td>AB_2737625 HLA-DR</td><td>BD Biosciences</td><td>563083</td><td>נוגדן לצביעה RRID</חזק>: AB_2737994</td></tr><tr><td>CD16</td><td>BD Biosciences</td><td>563784</td><td>נוגדן לצביעה <חזק>RRID</חזק>: AB_2744293</td></tr><tr><td>תאים מתים</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>L-23105</td><td>חי/מת אפליה</td></tr><tr><td>פלקון 5 מ"ל מבחנה פוליסטירן תחתון עגול עם מסננת תאים מכסה הצמד</td><td>BD Bioscience</td><td>352235</td><td>לסנן תרחיף תאים לפני שהוא עובר דרך ציטומטר הזרימה</td></tr><tr><td>Falcon 5 מ"ל מבחנה פוליסטירן תחתון עגול</td><td>BD Bioscience</td><td>352001</td><td>להכתים דם מלא</td></tr><tr><td>תרבית תאים התאוששות הקפאה</td> בינונית <td>תרמו פישר</td><td>12648010</td><td>תאים</td></tr> <tr><td>מקפיאים96 בארות V-bottom צלחת</td><td>תרמו פישר</td><td>249570</td><td>צלחת לצביעה</td></tr><tr><td>FACSAria IIu Cell Sorter</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>זרימה ציטומטר</td></tr><tr><td>FCS Express 6</td><td>De Novo תוכנה</td><td></td><td>ניתוח FACS</td></tr><tr><td>תוכנת Graphpad פריזמה</td><td>GraphPad ניתוח</td><td></td><td>נתונים</td></tr></tbody></table>

אפליה של שבע קבוצות משנה תא החיסון על ידי שני-fluorochrome לזרום cytometry

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

איפיון תאים חיסוניים מסתמך בכבדות על cytometry זרימה ססגוניות לזהות subpopulations מבוסס על ביטוי דיפרנציאלי של סמני פני השטח. ההתקנה של לוח ססגוניות הקלאסי דורש כלים באיכות גבוהה, נוגדנים עם תוויות מותאמות אישית ועיצוב ללמוד בזהירות כדי למזער חפיפה ספקטרלי. פיתחנו ניתוח multiparametric לזיהוי אוכלוסיית מרכזי המערכת החיסונית (CD4+ ו CD8+ T תאים, התאים γδ T, תאי B, תאי NK, ומונוציטים) בדם היקפי על ידי שילוב של שבעה סמנים שושלת היוחסין באמצעות fluorochromes רק שני. האסטרטגיה שלנו מתבסס על התצפית כי שושלת היוחסין סמני כל הזמן לידי ביטוי שילוב ייחודי לכל אוכלוסיית תאים. שילוב של מידע זה עם טיטור זהיר של הנוגדנים מאפשרת החוקרים להקליט חמישה סמנים נוספים, להרחיב את מגבלת אופטי של רוב cytometers זרימה. השוואה עפות הוכיח כי ניתן לאפיין את הרוב המכריע של אוכלוסיות תאים חיסוניים בדם היקפי עם דיוק השוואה בין השיטה שלנו קלאסי "סמן fluorochrome-אחד אחד הגישה", למרות שהאחרון הוא עדיין מדויקת יותר לזיהוי אוכלוסיות כגון NKT תאים ותאים γδ T. שילוב של שבעה סמנים באמצעות שתי fluorochromes מאפשר הניתוח של אוכלוסיות תא החיסון מורכבות ודוגמאות קליניים ב- 6-10 במחיר סביר fluorochrome זרימה cytometers, וכן 2-3 fluorochrome כלי נגינה שדה באזורים עם משאבים מוגבלים. מכשירים מתקדמים יכולים גם ליהנות גישה זו על-ידי שימוש fluorochromes נוספת כדי לבצע ניתוח עמוק יותר של cytometry זרימה. גישה זו מתאימה גם טוב מאוד לסינון מספר אוכלוסיות תאים במקרה של דגימות קלינית עם מספר מצומצם של תאים.

הגדרה וניתוח של ניסוי cytometry זרימה תאי דם היקפיים האנושי צבעונית עם שבעה סמנים השושלת (anti-CD3,-CD4,-CD8, - CD14,-נוגדנים γδ CD19, - CD56 ו- TCR) משתמשת רק בשני fluorochromes מוצגים.
התוצאות נציג מתוארים אנטי-CD8 ו- CD56 נוגדן טיטור. עבור כל נוגדן (בדוגמה זו, אנטי-CD8), נתונים מ 10 דילולים 2-fold רצופים נרשמו לחישוב עקומת אינדקס הכתם (איור 1 א'-C). ריכוז נוגדן אופטימלית נקבע על ידי13<...

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול cytometric זרימה כדי לזהות CD4+ ו CD8+ T תאים, התאים γδ T, תאים B, תאי NK ומונוציטים בדם היקפי האנושי באמצעות fluorochromes רק שני במקום שבעה. עם גישה זו, ניתן לרשום חמישה סמנים נוספים על רוב זרימה cytometers.

אפליה של שבע קבוצות משנה תא החיסון על ידי שני-fluorochrome לזרום Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא להתרחב מעבר לגבול האופטי של רוב ציטומטרים זרימה על ידי מתן אפשרות לחוקר להקליט חמישה סמנים נוספים לחקור אוכלוסיות תאים מורכבות. באמצעות טכניקה זו, ניתן להשיג immunophenotyping עמוק בעת עבודה עם מכשיר עם מספר נמוך של גלאים או מדגם עם מספר מוגבל של תאים. התחל הליך זה על ידי העברה בזהירות דם נמשך לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר.לדלל את הדם עם כמות שווה של PBS ללא סידן ומגנזיום. הוסף 15 מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות לתחתית צינור חרוט חדש של 50 מיליליטר. בזהירות כיסוי הדם מדולל על גבי המדיום שיפוע צפיפות, הימנעות כל ערבוב בין בינוני שיפוע צפיפות דם מדולל.צנטריפוגה ב 400 פעמים g במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ללא בלם, כדי למנוע שיבוש של הממשק. לאחר צנטריפוגה, להשתמש פיפטה כדי לשאוף בזהירות להשליך את השכבה העליונה, לשים לב לא להסיר תאים בממשק בין פלזמה בינוני שיפוע צפיפות. לאסוף כמו תאים mononuclear דם היקפיים רבים, או PBMCs, ככל האפשר מן הממשק מבלי לגעת גלולת התא האדום בתחתית הצינור חרוט 50 מיליליטר, ולהעביר צינור חדש.הוסף PBS כדי להביא את הנפח הסופי ל 25 מיליליטר, ולהפוך מספר פעמים לערבב. לאחר מכן, שטפו את המחשבים האישיים כפליים מהמצוין בטקסט. לאחר הסרת טסיות הדם וספירת PBMCs כמתואר בטקסט, לעשות שימוש חוזר בתאים ב- PBS, 0.1% נתרן אזיד לריכוז של אחד פעמים 10 לתאים השביעיים למיליליטר.כדי להכין את המחשבים האישיים לכתמים, העבר 100 מיקרוליטרים של כל דגימה לצלחת V-bottom של 96 בארות. צנטריפוגה הצלחת ב 350 פעמים g במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות שאף את supernatant מבלי להפריע גלולת התא.לכל באר, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של PBS המכילים צבע חי/מת לתיקון שמגיב עם אמין חופשי על חלבונים, והשקיעו מחדש את תערובת PBMC בזהירות. לאחר מכן, לאפשר את הצלחת לשבת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עבור תיוג של תאים מתים. לכל דגימה, הכינו 30 מיקרוליטרים של תערובת המכילה את כל שבעת הנוגדנים.בשלב זה, ניתן להוסיף נוגדנים ציטרקטיביים נגד מולקולות מטרה שונות וגם ב פלואורוכרומים שונים. צנטריפוגה צלחת 96 גם ב 350 פעמים g במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר, בזהירות שאף את supernatant מבלי להפריע גלולת התא. מוסיפים את קוקטייל הנוגדנים לכל באר, ומוסיפים מחדש בזהירות מבלי לייצר בועות.דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר 30 דקות, מוסיפים 150 מיקרוליטרים של חיץ כתמים לכל באר, וצנטריפוגה את הצלחת ב 350 פעמים גרם במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות שאף את supernatant מבלי להפריע גלולת התא, ו resuspend התאים ב 200 microliters של PBS.התאים מוכנים כעת לניתוח ציטומטריית זרימה. נוגדנים נגד CD3, CD8, CD14, CD19 ודלתא גמא TCR הם titrated עם עקומת אינדקס כתמים מקסימלית. טיטרציה נוגדנים היא הצעד הקריטי ביותר בפרוטוקול זה כדי לזהות כראוי שבעה תת-קבוצה של תאים חיסוניים באמצעות שני פלואורוכרומים.כדי להכין דילול נוגדנים כפול, מלאו 10 בארות של צלחת של 96 בארות עם 40 מיקרוליטרים של חיץ כתמים לגם. לצורך וידאו זה, רק את התיסוס של אנטי CD8 יוצגו. באר הראשונה, להגדיל את הנפח הסופי ל 80 microliters של חיץ כתמים, ולהוסיף אנטי CD8 בריכוז ארבע פעמים את הריכוז המוצע על ידי היצרן.מערבבים היטב ומעבירים 40 מיקרוליטרים לגם השני. מערבבים היטב וחוזרים על שלב זה עבור כל הבארות האחרות. כתמים 10 דגימות של PBMCs או דם שלם עם 30 microliters של 10 דילולים שונים כפולים של אנטי CD8 בעקבות הפרוטוקול הפגינו קודם לכן.להשיג נתונים עם ציטומטר זרימה, ולתהות את האות מכל דילול. לאחר חישוב מדד הכתמים עבור כל ריכוז נוגדנים כמפורט בטקסט, התווה את מדד הכתמים לעומת ריכוז הנוגדנים שבא לידי ביטוי כשבר בדילול הנוגדנים, וזהה את ריכוז הנוגדן עם ערך מדד הכתמים המרבי. כדי לתייג את הנוגדנים נגד CD4 ואנטי-CD56, התחילו באסטרטגיית הדילול הדו-פי שניים שהוכחה קודם לכן, והוסיפו ריכוזים נוספים ביניהם כדי לזהות היטב את טווח הריכוז שיאפשר הפרדה של תאי T ותאי NK חיוביים CD4 מאוכלוסיות התאים האחרות.תטטר את הנוגדן נגד CD4 על-ידי הצבת האות נגד CD4 בין האות החיובי ל-CD8 הכפול, החיובי ל-CD3, לבין האוכלוסיה החיובית הבודדת CD3. Titrate נוגדן נגד CD56 בעקבות אסטרטגיה דומה טיטרציה נוגדנים נגד CD4, על ידי הצבת תאי NK בין CD3 שלילי לבין אוכלוסיות CD3 חיובי. כדי להתחיל את אסטרטגיית הגט של שני פלואורוכרום, שבעה סמן, בחר את שער הלימפוציטים, וצור חלקת נקודה עם אחד משני הפלורוכרומים המשמשים בפרוטוקול זה בכל ציר.שער בתאי T חיוביים ל- CD8 המזוהים כתאי CD3 ו- CD8 חיוביים כפולים בפינה השמאלית העליונה של התוויית הנקודה. אל תכלול את אוכלוסיית CD8 העמומה שעשויה להכיל תאי NKT. שער בתאי T חיוביים ל- CD4 המזוהים כאוכלוסיה בין תאי T חיוביים ל- CD8 לבין האוכלוסיות החיוביות היחידות של CD3.שער בתאי דלתא T של גמא שזוהו כתאי CD3 גבוהים. Subdivide גאמא דלתא T תאים כדי CD8 חיובי ו CD8 שלילי. שער בתאי NK המזוהים כאוכלוסיה בין תאים חיוביים ל- CD3 ו- CD3 שליליים.חלק את תאי ה- NK ל- CD8 חיובי ו- CD8 שלילי. שער בתאי B המזוהים כאוכלוסייה CD3 שלילית, CD19 חיובי בפינה הימנית התחתונה של התוויית הנקודה. בחר את שער המונוציטים וצור חלקת נקודה עם אחד משני הפלורוכרומים המשמשים בפרוטוקול זה בכל ציר.שער על CD3 שלילי, CD14 חיובי אוכלוסייה. באמצעות אסטרטגיה זו, לימפוציטים של חולה עם מיאלומה נפוצה היו מגודרים על בסיס פיזור קדימה שלהם פיזור הצד ואת הפרופיל הציטומטרי זרימה שלהם. תקליטורים חיוביים לזיכרון ותאי T נאיביים זוהו על ידי ביטוי של CD45RA ו- CCR7.ביטוי של HLA-DR ו- CD57 שימש לחקר הפעלת תאי T בתאים נאיביים, זיכרון, זיכרון מרכזי, זיכרון אפקטר ותאים חיוביים לזיכרון אפקטים CD45RA. באופן דומה, תאי T נאיביים וזיכרון חיוביים CD4 זוהו. בתוך אוכלוסיית הזיכרון, CCR4 ו- CCR6 שימשו לזיהוי תת-אוכלוסייה מסייעת T בתאי T חיוביים ל- CD4.תתי-תתי-פיפוזיציה של תאי NK התאפיינו בביטוי CD16 ו- CD57. אסטרטגיה זו שימשה כדי לחקור את הדינמיקה באוכלוסיות החיסון של דגימות אורך מתורם עם מיאלומה נפוצה קבלת השתלת תאי גזע. אפיון של תתי-תפוקות CD8 ו- CD4 לאורך זמן הראה הפעלת תא T חיובית ו- CD8 חיובית מתמשכת והטייה של מסייע T לפנוטיפ T-helper-one.אבל ביום 60, אחוז תאי B גדל באופן דרמטי, מנבא את ההתדרדרות של המטופל. הכנת תאים נכונה טיטרציה נוגדנים הם צעדים קריטיים כדי להשיג תוצאות אמינות באמצעות טכניקה זו. נוגדן מיקוד סמנים אחרים ניתן להוסיף כדי להשיג ניתוח cytometry זרימה עמוקה יותר וליצור לוחות ציטומטרי זרימה מודולרית מיקוד מספר שושלת באותו זמן.גישות דומות שמטרתן להרחיב את מספר סמנים לתיעוד ניתן גם לפתח באמצעות סטים שונים של סמן או לשימוש במודלים שונים של בעלי חיים. אל תשכח כי נתרן אזיד יכול לגרום כוויות לעור ולעיניים. לכן, חלוק מעבדה, משקפי מגן, וכפפות תמיד צריך להיות משוחק בעת טיפול זה reagent.

discrimination-seven-immune-cell-subsets-two-fluorochrome-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מדגימים את השירות של זרימת cytometry ססגוניות אפיון פנוטיפי ופונקציונלי מפורט הכולל, כמו גם תת זיכרון מסוג CD4 + ו - CD8 + T תאים של קופי רזוס, המודל האידיאלי עבור HIV / איידס מחקרים החיסון.

Cytometry ססגוניות אנליזות זרימה של תגובה חיסונית תאית של קופי רזוס

סרטון זה מדגים טכניקה מבוססת ציטומטריית זרימה באמצעות שני פלואורוכרום לזיהוי תאי T CD4+ ו- CD8+, תאי T γδ, תאי B, תאי הרג טבעי (NK) ומונוציטים בתאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים (PBMCs). לאחר הדגירה על התאים עם נוגדנים מצומדים פלואורוכרום כנגד סמני פני השטח, תת-קבוצות התא מזוהות באמצעות אסטרטגיית גטינג ציטומטרית אופטימלית של זרימה.

בדיקת ציטומטריית זרימה לזיהוי תת-קבוצות של תאי חיסון בתאים חד-גרעיניים היקפיים בדם

ניתוח של אינטראקציה nanoparticle עם אוכלוסיות מוגדרות של תאי מערכת החיסון על ידי cytometry זרימה.

איתור של פלורסנט אינטראקציות Nanoparticle עם אוכלוסיות ראשוניות של תא חיסון על ידי זרימת cytometry

הדור של מודל עכברים orthotopic של מזותליומה pleural הממארת על ידי השתלה של תאי II-45 מזותליומה לתוך חלל pleural של חולדות המוסמכות חיסוניים מוצג. שיטת cytometric זרימה לנתח שבע תת תא חיסון בבעלי החיים אלה מדגימת דם 25 μl גם מתוארת.

ניטור נייד Orthotopic השרשה והיקפי חיסון במודל השני-45 syngeneic עכברוש מזותליומה

דלקת ממלאת תפקיד מרכזי בפתוגנזה של שבץ איסכמי. עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שהוא פועל כחרב פיפיות המחמירה פגיעה מוחית מוקדמת, אך גם תורמת לתיקון מאוחר יותר. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של תאי חיסון מהמוח האיסכמי ואת הפנוטיפ הציטומטרי הזרימה שלהם לאחר מכן.

בידוד תזרים Cytometric ניתוח של תאים חיסוניים ממוח עכבר איסכמי

מאמר זה מתאר ספקטרלי cytometry, גישה חדשה ב cytometry הזרימה המשתמשת צורות של ספקטרום פליטה להבחין fluorochromes. אלגוריתם מחליף פיצויים יכול לטפל קרינה אוטומטית כפרמטר עצמאי. גישה חדשה זו מאפשרת הניתוח הראוי של תאים מבודדים איברים מוצקים.

ניתוח של המתלים תא מבודד מרקמות Solid ידי זרימת cytometry ספקטרלי

. הנה, עבור בידוד ואפיון של CD4 פרוטוקול+ T-cell קבוצות משנה של דם היקפיים אדם מתואר. לטהר CD4+ תאי-T הם נותחו על ידי cytometry זרימה כדי לקבוע את הפרופורציות של T-הזקיקים תא מסייע קבוצות משנה.

בידוד של CD4+ תאי-T וניתוח של מחזורי Helper T-הזקיקים (cTfh) קבוצות משנה תא מ באמצעות דם היקפיים של Cytometry זרימה 6-צבע

במסמך זה, אנו מציגים פרוטוקול להכנת תאים בודדים של בלוטת התימוס מאתר הלבלב ניקוז הלימפה והטחול ללימוד נוסף תאים אלה באמצעות cytometry זרימה. בנוסף, פרוטוקול זה שימש לקביעת תת-קבוצות של הרגולציה ותאי T באמצעות cytometry זרימה.

קביעת קבוצות משנה תא T רגולטורי ב מאתר התימוס, הלבלב ניקוז הלימפה והטחול באמצעות Cytometry זרימה

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ציטומיטרי זרימה מפורט ושחזור כדי לזהות מונוציט / מקרופאג ותת-תאים T-ערכות באמצעות שניהם אקסטרה-ותוך תאי כתמים כתמים בתוך הטחול murine, מח עצם, בלוטות הלימפה ורקמות synovial, ניצול מודל כירורגי מבוסס של דלקת מפרקים ניוונית מורין.

ניתוח ציתום זרימה של תת-סטים של תאים חיסוניים בתוך הטחול מורין, מח העצם, בלוטות הלימפה ורקמות Synovial במודל דלקת מפרקים ניוונית

בידוד תאים משתלים מנותחים ואפיונם לפי ציטומטריית זרימה יכולים לתרום משמעותית להבנת דפוס התגובה החיסונית נגד שתלים. מאמר זה מתאר שיטה מדויקת לבידוד תאים משתלים מנותחים וצביעתם לצורך אנליזה ציטומטרית של זרימה.

ציטומטריית זרימה בממדיות גבוהה לניתוח תפקוד מערכת החיסון של רקמות שתל מנותחות

למדו פרוטוקול ציטומטריית זרימה לזיהוי שבע קבוצות תאי חיסון בדם פריפרי אנושי באמצעות שני פלואורוכרומים בלבד. שיטה זו מאפשרת רישום חמישה סמנים נוספים לניתוח אוכלוסיות תאים מורכבות.

אפליה של שבע קבוצות משנה תא החיסון על ידי שני-fluorochrome לזרום Cytometry

גלה סרטונים נוספים