אפליה של שבע קבוצות משנה תא החיסון על ידי שני-fluorochrome לזרום Cytometry
5 במרץ 2019
כאן, אנו מציגים את פרוטוקול cytometric זרימה כדי לזהות CD4+ ו CD8+ T תאים, התאים γδ T, תאים B, תאי NK ומונוציטים בדם היקפי האנושי באמצעות fluorochromes רק שני במקום שבעה. עם גישה זו, ניתן לרשום חמישה סמנים נוספים על רוב זרימה cytometers.
המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא להתרחב מעבר לגבול האופטי של רוב ציטומטרים זרימה על ידי מתן אפשרות לחוקר להקליט חמישה סמנים נוספים לחקור אוכלוסיות תאים מורכבות. באמצעות טכניקה זו, ניתן להשיג immunophenotyping עמוק בעת עבודה עם מכשיר עם מספר נמוך של גלאים או מדגם עם מספר מוגבל של תאים. התחל הליך זה על ידי העברה בזהירות דם נמשך לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר.
לדלל את הדם עם כמות שווה של PBS ללא סידן ומגנזיום. הוסף 15 מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות לתחתית צינור חרוט חדש של 50 מיליליטר. בזהירות כיסוי הדם מדולל על גבי המדיום שיפוע צפיפות, הימנעות כל ערבוב בין בינוני שיפוע צפיפות דם מדולל.
צנטריפוגה ב 400 פעמים g במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ללא בלם, כדי למנוע שיבוש של הממשק. לאחר צנטריפוגה, להשתמש פיפטה כדי לשאוף בזהירות להשליך את השכבה העליונה, לשים לב לא להסיר תאים בממשק בין פלזמה בינוני שיפוע צפיפות. לאסוף כמו תאים mononuclear דם היקפיים רבים, או PBMCs, ככל האפשר מן הממשק מבלי לגעת גלולת התא האדום בתחתית הצינור חרוט 50 מיליליטר, ולהעביר צינור חדש.
הוסף PBS כדי להביא את הנפח הסופי ל 25 מיליליטר, ולהפוך מספר פעמים לערבב. לאחר מכן, שטפו את המחשבים האישיים כפליים מהמצוין בטקסט. לאחר הסרת טסיות הדם וספירת PBMCs כמתואר בטקסט, לעשות שימוש חוזר בתאים ב- PBS, 0.1% נתרן אזיד לריכוז של אחד פעמים 10 לתאים השביעיים למיליליטר.
כדי להכין את המחשבים האישיים לכתמים, העבר 100 מיקרוליטרים של כל דגימה לצלחת V-bottom של 96 בארות. צנטריפוגה הצלחת ב 350 פעמים g במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות שאף את supernatant מבלי להפריע גלולת התא.
לכל באר, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של PBS המכילים צבע חי/מת לתיקון שמגיב עם אמין חופשי על חלבונים, והשקיעו מחדש את תערובת PBMC בזהירות. לאחר מכן, לאפשר את הצלחת לשבת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עבור תיוג של תאים מתים. לכל דגימה, הכינו 30 מיקרוליטרים של תערובת המכילה את כל שבעת הנוגדנים.
בשלב זה, ניתן להוסיף נוגדנים ציטרקטיביים נגד מולקולות מטרה שונות וגם ב פלואורוכרומים שונים. צנטריפוגה צלחת 96 גם ב 350 פעמים g במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר, בזהירות שאף את supernatant מבלי להפריע גלולת התא. מוסיפים את קוקטייל הנוגדנים לכל באר, ומוסיפים מחדש בזהירות מבלי לייצר בועות.
דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר 30 דקות, מוסיפים 150 מיקרוליטרים של חיץ כתמים לכל באר, וצנטריפוגה את הצלחת ב 350 פעמים גרם במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות שאף את supernatant מבלי להפריע גלולת התא, ו resuspend התאים ב 200 microliters של PBS.
התאים מוכנים כעת לניתוח ציטומטריית זרימה. נוגדנים נגד CD3, CD8, CD14, CD19 ודלתא גמא TCR הם titrated עם עקומת אינדקס כתמים מקסימלית. טיטרציה נוגדנים היא הצעד הקריטי ביותר בפרוטוקול זה כדי לזהות כראוי שבעה תת-קבוצה של תאים חיסוניים באמצעות שני פלואורוכרומים.
כדי להכין דילול נוגדנים כפול, מלאו 10 בארות של צלחת של 96 בארות עם 40 מיקרוליטרים של חיץ כתמים לגם. לצורך וידאו זה, רק את התיסוס של אנטי CD8 יוצגו. באר הראשונה, להגדיל את הנפח הסופי ל 80 microliters של חיץ כתמים, ולהוסיף אנטי CD8 בריכוז ארבע פעמים את הריכוז המוצע על ידי היצרן.
מערבבים היטב ומעבירים 40 מיקרוליטרים לגם השני. מערבבים היטב וחוזרים על שלב זה עבור כל הבארות האחרות. כתמים 10 דגימות של PBMCs או דם שלם עם 30 microliters של 10 דילולים שונים כפולים של אנטי CD8 בעקבות הפרוטוקול הפגינו קודם לכן.
להשיג נתונים עם ציטומטר זרימה, ולתהות את האות מכל דילול. לאחר חישוב מדד הכתמים עבור כל ריכוז נוגדנים כמפורט בטקסט, התווה את מדד הכתמים לעומת ריכוז הנוגדנים שבא לידי ביטוי כשבר בדילול הנוגדנים, וזהה את ריכוז הנוגדן עם ערך מדד הכתמים המרבי. כדי לתייג את הנוגדנים נגד CD4 ואנטי-CD56, התחילו באסטרטגיית הדילול הדו-פי שניים שהוכחה קודם לכן, והוסיפו ריכוזים נוספים ביניהם כדי לזהות היטב את טווח הריכוז שיאפשר הפרדה של תאי T ותאי NK חיוביים CD4 מאוכלוסיות התאים האחרות.
תטטר את הנוגדן נגד CD4 על-ידי הצבת האות נגד CD4 בין האות החיובי ל-CD8 הכפול, החיובי ל-CD3, לבין האוכלוסיה החיובית הבודדת CD3. Titrate נוגדן נגד CD56 בעקבות אסטרטגיה דומה טיטרציה נוגדנים נגד CD4, על ידי הצבת תאי NK בין CD3 שלילי לבין אוכלוסיות CD3 חיובי. כדי להתחיל את אסטרטגיית הגט של שני פלואורוכרום, שבעה סמן, בחר את שער הלימפוציטים, וצור חלקת נקודה עם אחד משני הפלורוכרומים המשמשים בפרוטוקול זה בכל ציר.
שער בתאי T חיוביים ל- CD8 המזוהים כתאי CD3 ו- CD8 חיוביים כפולים בפינה השמאלית העליונה של התוויית הנקודה. אל תכלול את אוכלוסיית CD8 העמומה שעשויה להכיל תאי NKT. שער בתאי T חיוביים ל- CD4 המזוהים כאוכלוסיה בין תאי T חיוביים ל- CD8 לבין האוכלוסיות החיוביות היחידות של CD3.
שער בתאי דלתא T של גמא שזוהו כתאי CD3 גבוהים. Subdivide גאמא דלתא T תאים כדי CD8 חיובי ו CD8 שלילי. שער בתאי NK המזוהים כאוכלוסיה בין תאים חיוביים ל- CD3 ו- CD3 שליליים.
חלק את תאי ה- NK ל- CD8 חיובי ו- CD8 שלילי. שער בתאי B המזוהים כאוכלוסייה CD3 שלילית, CD19 חיובי בפינה הימנית התחתונה של התוויית הנקודה. בחר את שער המונוציטים וצור חלקת נקודה עם אחד משני הפלורוכרומים המשמשים בפרוטוקול זה בכל ציר.
שער על CD3 שלילי, CD14 חיובי אוכלוסייה. באמצעות אסטרטגיה זו, לימפוציטים של חולה עם מיאלומה נפוצה היו מגודרים על בסיס פיזור קדימה שלהם פיזור הצד ואת הפרופיל הציטומטרי זרימה שלהם. תקליטורים חיוביים לזיכרון ותאי T נאיביים זוהו על ידי ביטוי של CD45RA ו- CCR7.
ביטוי של HLA-DR ו- CD57 שימש לחקר הפעלת תאי T בתאים נאיביים, זיכרון, זיכרון מרכזי, זיכרון אפקטר ותאים חיוביים לזיכרון אפקטים CD45RA. באופן דומה, תאי T נאיביים וזיכרון חיוביים CD4 זוהו. בתוך אוכלוסיית הזיכרון, CCR4 ו- CCR6 שימשו לזיהוי תת-אוכלוסייה מסייעת T בתאי T חיוביים ל- CD4.
תתי-תתי-פיפוזיציה של תאי NK התאפיינו בביטוי CD16 ו- CD57. אסטרטגיה זו שימשה כדי לחקור את הדינמיקה באוכלוסיות החיסון של דגימות אורך מתורם עם מיאלומה נפוצה קבלת השתלת תאי גזע. אפיון של תתי-תפוקות CD8 ו- CD4 לאורך זמן הראה הפעלת תא T חיובית ו- CD8 חיובית מתמשכת והטייה של מסייע T לפנוטיפ T-helper-one.
אבל ביום 60, אחוז תאי B גדל באופן דרמטי, מנבא את ההתדרדרות של המטופל. הכנת תאים נכונה טיטרציה נוגדנים הם צעדים קריטיים כדי להשיג תוצאות אמינות באמצעות טכניקה זו. נוגדן מיקוד סמנים אחרים ניתן להוסיף כדי להשיג ניתוח cytometry זרימה עמוקה יותר וליצור לוחות ציטומטרי זרימה מודולרית מיקוד מספר שושלת באותו זמן.
גישות דומות שמטרתן להרחיב את מספר סמנים לתיעוד ניתן גם לפתח באמצעות סטים שונים של סמן או לשימוש במודלים שונים של בעלי חיים. אל תשכח כי נתרן אזיד יכול לגרום כוויות לעור ולעיניים. לכן, חלוק מעבדה, משקפי מגן, וכפפות תמיד צריך להיות משוחק בעת טיפול זה reagent.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול של ציטומטריית זרימה לזיהוי סוגים שונים של תאי מערכת החיסון בדם פריפריאלי אנושי באמצעות שני פלואורוכרומים בלבד. שיטה זו מאפשרת תיעוד של חמישה סמנים נוספים, ובכך משפרת את הניתוח של אוכלוסיות תאים מורכבות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה
- cytometry זרימה (Flow Cytometry)
- ביולוגיה של התא
רקע
- ציטומטריה של זרימה היא כלי רב עוצמה לניתוח אוכלוסיות תאים.
- שיטות מסורתיות דורשות לעיתים קרובות מספר רב של פלואורונומים, מה שמגביל את מספר הסמנים שניתן לנתח בו-זמנית.
- מחקר זה נועד לפשט את התהליך תוך הרחבת היכולות האנליטיות.
- הבנת אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון חיונית ליישומים שונים במחקר ביו-רפואי.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול המאפשר זיהוי של סוגי תאי חיסון מרובים תוך שימוש בפחות פלואורוכרומים.
- הסייעה לביצוע אימונופנוטיפינג מעמיק יותר עם משאבים מוגבלים.
- שיפור היעילות של ניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה במסגרות מחקריות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מדגימי דם מדוללים עם PBS ומונחים מעל מדיום בעל מדרג צפיפות.
- בוצעת ציטומטריית זרימה כדי לזהות אוכלוסיות תאים.
- נעשה שימוש בשני פלואורוכרומים לסמימון התאים.
- חמישה סמנים נוספים נרשמו כדי לשפר את הניתוח.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מזהה בהצלחה תאי T מסוג CD4 + ו-CD8 +, תאי T רגולטוריים, תאי B, תאי NK ומונוציטים.
- ניתן לנתח חמישה סמנים נוספים מבלי לפגוע באיכות הנתונים.
- שיטה זו מדגימה את ההיתכנות של שימוש במספר מועט יותר של פלואורוכרומים בציטומטריה זרימתית.
- התוצאות מעידות על יעילות משופרת בניתוח אוכלוסיות מורכבות של תאי מערכת החיסון.
מסקנות
- הפרוטוקול שפותח משפר את ניתוח ציטומטריית הזרימה על ידי הפחתת מספר הפלואורוكرומים הנדרשים.
- גישה זו מאפשרת הבנה מקיפה יותר של אוכלוסיות תאי מערכת החיסון.
- הוא מספק כלי בעל ערך לחוקרים עם משאבים או ציוד מוגבלים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למקבלי החלטות
שיטה זו מאפשרת אימונופנוטיפ (immunophenotyping) מעמיק של תתי-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון האנושית תוך שימוש בשני פלואורוכרומים בלבד, ובכך מרחיבה את היכולת האנליטית של ציטומטרים זרימתיים בעלי מספר פרמטרים נמוך. היא תומכת בתיקוף מטרות ובפיתוח בדיקות במחקרי גילוי, על ידי מתן אפשרות לבדיקה סימולטנית של שבעה סמני שושב (lineage markers) ללא צורך בציוד מתקדם. גישה זו בעלת ערך רב במיוחד לסריקת דגימות קליניות מוגבלות, ומאפשרת ניטור חיסוני יעיל מבחינת משאבים במחקרים פרה-קליניים ותרגומיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של תתי-אוכלוסיות של תאי חיסון על ידי אישור שילובי סמנים ספציפיים לשושלת, אשר קריטיים להפחתת סיכונים ביעד.
- ערך תפעולי: מפחית את התלות בפנלים מרובי צבעים מורכבים, ובכך מייעל את בדיקת ההשערות בשלבים מוקדמים בפרויקטים של גילוי הממוקדים באימונולוגיה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מקל על סטנדרטיזציה של הבדיקה על ידי מתן אפשרות לזיהוי עקבי של תאי CD4+, CD8+, γδ T, תאי B, תאי NK ומונוציטים באמצעות פאנל קבוע של שני פלואורוכרומים.
- ערך תפעולי: מגדיל את התפוקה במצבים של דגימות מוגבלות על ידי מתן אפשרות לתיעוד של חמישה סממנים נוספים מעבר למגבלה האופטית של המכשיר.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך בניטור חיסוני לאורך זמן במודלים פרה-קליניים על ידי מתן אפשרות לגילוי סמני הפעלה (למשל, HLA-DR, CD57) ושינויים בהרכב תתי-האוכלוסיות לאורך זמן.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות בהשוואות בין מחקרים על ידי אספקת אסטרטגיית gating סטנדרטית עבור אוכלוסיות חיסוניות עיקריות.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת במסלול העבודה של ביולוגיה גילויית, ומאפשרת פרופיל חיסוני מוקדם המנחה את בחירת המטרה ואת ההבנה המכניסטית לפני זיהוי המולקולה המובילה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקה מונחית-היפותזה של הרכב תאי מערכת החיסון ומצבים תפקודיים במערכות הרלוונטיות למחלה.
- סריקה: מאפשר הכנה של דגימות PBMC סטנדרטיות עבור בדיקות תגובה לתרופות בשלב הבא, על ידי הבטחת זיהוי עקבי של תתי-אוכלוסיות חיסוניות.
- אנליטיקה: מייצר תוצרי קריאה כמותיים ומולטי-פרמטריים המאפשרים השוואה של שכיחות תאי מערכת החיסון ומצבי הפעלה בין תנאים ניסויים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר ממצאי גילוי לאימות פרה-קליני על ידי אפשור ניטור של שיקום חיסוני ודינמיקת תתי-אוכלוסיות בדגימות אורך.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס מודול אימונופנוטיפי בר-שימוש שניתן להחיל על פרויקטים מרובים החוקרים מודולציה חיסונית או דלקת.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף יעדים הקשורים למערכת החיסון על ידי הפחתת העמימות בזיהוי תתי-אוכלוסיות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של הבדיקה באתרים בעלי יכולות שונות של ציטומטריה זורמת.
- ערך אסטרטגי: תומך באימונופנוטיפיקה יעילה מבחינת הון על ידי הרחבת התועלת ממכשירים קיימים בעלי 2–10 פלואורוכרומים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קבלת החלטות מותאמת סיכון בפיתוח אימונותרפיה באמצעות ניטור חיסוני אמין בדגימות פרה-קליניות וקליניות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בפיצוי של ציטומטריית זרימה (flow cytometry compensation), באסטרטגיית gating ובטיטרציה של נוגדנים כדי להפריד אותות חופפים.
- תלוי בגישה לציטומטר זרימה המסוגל לזהות שני פלואורוכרומים ובריאגנטים מתאימים לצביעה (למשל, צבע live/dead, PBS, azide).
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי טיטרציה של נוגדנים בין משתמשים שונים כדי להבטיח רזולוציה עקבית של תתי-האוכלוסיות.
- דורש התאמה בעת הרחבה למינים שאינם אנושיים או למקורות רקמה שונים, בשל הבדלים פוטנציאליים בביטוי הסמנים.
- מוגבל ביכולת להפריד תתי-אוכלוסיות קרובות, כגון תאי NKT, ללא סמנים נוספים או מכשירים בעלי מספר פרמטרים גבוה יותר.
