Name: הפקה, טיהור, ובקרת איכות על Adeno-הקשורים וקטורים מבוסס-וירוס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: למדו לייצר ולטהר וקטורי AAV בטיטר גבוה ובטוהר מיטבי לשימושים בתאים ובחיות מודל. פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה לטיפול גני ולמחקר ביולוגי מולקולרי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M.R. נתמך על-ידי voor Fonds Vlaanderen Onderzoek Wetenschappelijk (FWO), בתר (133722/1204517N) ומקבל תמיכה רציפה של המעבורת קולומביה דה Fundación לב וכלי דם, מחלקת ניהול של המדע, טכנולוגיה וחדשנות (גרנט CT-FP44842-307-2016, קוד פרוייקט 656671250485). ועותרת נתמך על ידי דוקטורט יפה FWO (1S48018N). M.G.H. נתמך על ידי מענק מוסדיים VIB תמיכה חיצונית מן תיירי Latran קרן (SOD-VIP), קרן עבור אלצהיימר מחקר (סאו-FRA) (P #14006), את FWO (גרנט 1513616N) את אירופה מחקר המועצה (ERC) (גרנט מתחיל 281961 - AstroFunc; הוכחה של המושג גרנט 713755 - AD-VIP). המחברים להכיר הוטון לספרים נדירים Jeason על עזרתו עם העכבר גידול, סטפני Castaldo עזרה ביצוע זריקות וריד הזנב, קרוליין Eykens למתן את הדימויים transfected תאים HEK293T. M.G.H. מאשר מייקל דנלופ, פיטר היקמן ו דין הריסון.

<ol><li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+Using+Adeno-Associated+Virus+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy Using Adeno-Associated Virus Vectors.</a> Clinical Microbiology Reviews. 21 (4), 583-593 (2008).</li>
<li>Duque, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+Administration+of+Self-complementary+AAV9+Enables+Transgene+Delivery+to+Adult+Motor+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Intravenous Administration of Self-complementary AAV9 Enables Transgene Delivery to Adult Motor Neurons.</a> Molecular Therapy. 17 (7), 1187-1196 (2009).</li>
<li>Bourdenx, M., Dutheil, N., Bezard, E., Dehay, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+gene+delivery+to+the+central+nervous+system+using+Adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Systemic gene delivery to the central nervous system using Adeno-associated virus.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, (2014).</li>
<li>Kantor, B., McCown, T., Leone, P., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Applications+Involving+CNS+Gene+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Clinical Applications Involving CNS Gene Transfer.</a> Advances in Genetics. 87, 71-124 (2014).</li>
<li>Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus%3A+The+First+Effective+In+Vivo+Gene+Delivery+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adenovirus: The First Effective In Vivo Gene Delivery Vector.</a> Human Gene Therapy. 25 (1), 3-11 (2014).</li>
<li>Weinberg, M. S., Samulski, R. J., McCown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+%28AAV%29+gene+therapy+for+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus (AAV) gene therapy for neurological disease.</a> Neuropharmacology. 69, 82-88 (2013).</li>
<li>Henckaerts, E., Linden, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus%3A+a+key+to+the+human+genome%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Virology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus: a key to the human genome?</a> Future Virology. 5 (5), 555-574 (2010).</li>
<li>Howarth, J. L., Lee, Y. B., Uney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+viral+vectors+as+gene+transfer+tools+%28Cell+Biology+and+Toxicology+Special+Issue%3A+ETCS-UK+1+day+meeting+on+genetic+manipulation+of+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Using viral vectors as gene transfer tools (Cell Biology and Toxicology Special Issue: ETCS-UK 1 day meeting on genetic manipulation of cells).</a> Cell Biology and Toxicology. 26 (1), 1-20 (2010).</li>
<li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Associated+Virus+Vector-Mediated+Gene+Transfer+in+Hemophilia+B%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Associated Virus Vector-Mediated Gene Transfer in Hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).</li>
<li>Carter, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+and+the+development+of+adeno-associated+virus+vectors%3A+a+historical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus and the development of adeno-associated virus vectors: a historical perspective.</a> Molecular Therapy. 10 (6), 981-989 (2004).</li>
<li>Schambach, A., Zychlinski, D., Ehrnstroem, B., Baum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosafety+Features+of+Lentiviral+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Biosafety Features of Lentiviral Vectors.</a> Human Gene Therapy. 24 (2), 132-142 (2013).</li>
<li>Van Vliet, K. M., Blouin, V., Brument, N., Agbandje-McKenna, M., Snyder, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+Adeno-Associated+Virus+Capsid+in+Gene+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The Role of the Adeno-Associated Virus Capsid in Gene Transfer.</a> Methods in Molecular Biology. 437, 51-91 (2008).</li>
<li>Rincon, M. Y., VandenDriessche, T., Chuah, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+cardiovascular+disease%3A+advances+in+vector+development%2C+targeting%2C+and+delivery+for+clinical+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for cardiovascular disease: advances in vector development, targeting, and delivery for clinical translation.</a> Cardiovascular Research. 108 (1), 4-20 (2015).</li>
<li>Samulski, R. J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-Mediated+Gene+Therapy+for+Research+and+Therapeutic+Purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Virology%22%5BJournal%5D)">AAV-Mediated Gene Therapy for Research and Therapeutic Purposes.</a> Annual Review of Virology. 1 (1), 427-451 (2014).</li>
<li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-complementary+AAV+Vectors%3B+Advances+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Self-complementary AAV Vectors; Advances and Applications.</a> Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).</li>
<li>Choi, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+AAV+expression+cassettes+to+improve+packaging+capacity+and+transgene+expression+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Optimization of AAV expression cassettes to improve packaging capacity and transgene expression in neurons.</a> Molecular Brain. 7, 17(2014).</li>
<li>Deverman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-dependent+selection+yields+AAV+variants+for+widespread+gene+transfer+to+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 204-209 (2016).</li>
<li>Jackson, K. L., Dayton, R. D., Deverman, B. E., Klein, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+Targeting%2C+Better+Efficiency+for+Wide-Scale+Neuronal+Transduction+with+the+Synapsin+Promoter+and+AAV-PHP.B%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Better Targeting, Better Efficiency for Wide-Scale Neuronal Transduction with the Synapsin Promoter and AAV-PHP.B.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, (2016).</li>
<li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+Manufacturing+of+Recombinant+Adeno-Associated+Viral+Vectors+at+Scale%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Versatile Manufacturing of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors at Scale.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1259-1271 (2010).</li>
<li>Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., LamLa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Analysis+of+Cesium+Chloride-+and+Iodixanol-Based+Purification+of+Recombinant+Adeno-Associated+Viral+Vectors+for+Preclinical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative Analysis of Cesium Chloride- and Iodixanol-Based Purification of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors for Preclinical Applications.</a> Human Gene Therapy Methods. 26 (4), 147-157 (2015).</li>
<li>Jungmann, A., Leuchs, B., Katus, H. A., Rommelaere, J., Müller, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+efficient+generation+and+characterization+of+adeno-associated+viral+%28AAV%29+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Protocol for efficient generation and characterization of adeno-associated viral (AAV) vectors.</a> Human Gene Therapy Methods. , (2017).</li>
<li>Tolmachov, O. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19565899">Designing Plasmid Vectors.</a> Methods in Molecular Biology. 542, 117-129 (2009).</li>
<li>QIAGEN Plasmid Purification Handbook. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=46205595-0440-459e-9d93-50eb02e5707e&lang=en">https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=46205595-0440-459e-9d93-50eb02e5707e&lang=en</a> (2018).</li>
<li>QIAquick PCR Purification Kit Protocol. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://2012.igem.org/wiki/images/a/a3/QIAquick_PCR-purification.pdf">http://2012.igem.org/wiki/images/a/a3/QIAquick_PCR-purification.pdf</a> (2008).</li>
<li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+Determination+of+Single-Stranded+and+Self-Complementary+Adeno-Associated+Viral+Vector+Genome+Titers+by+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute Determination of Single-Stranded and Self-Complementary Adeno-Associated Viral Vector Genome Titers by Droplet Digital PCR.</a> Human Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li>
<li>Sigma. ProteoSilver Silver Stain Kit (PROTSIL1) - Bulletin, ProteoSilver. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/protsil1bul.pdf">https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/protsil1bul.pdf</a> (2018).</li>
<li>Machholz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+Restraint+and+Common+Compound+Administration+Routes+in+Mice+and+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e2771(2012).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Puntel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+rat+brain+using+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors.</a> Current Protocols in Neuroscience. 50 (1), (2010).</li>
<li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+on+Freely+Floating+Fixed+Tissue+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry on Freely Floating Fixed Tissue Sections.</a> Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).</li>
<li>Hordeaux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Neurotropic+Properties+of+AAV-PHP.B+Are+Limited+to+C57BL%2F6J+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">The Neurotropic Properties of AAV-PHP.B Are Limited to C57BL/6J Mice.</a> Molecular Therapy. 26 (3), 664-669 (2018).</li>
<li>Rincon, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+transduction+of+astrocytes+and+neurons+in+the+mouse+central+nervous+system+after+systemic+delivery+of+a+self-complementary+AAV-PHP.B+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Widespread transduction of astrocytes and neurons in the mouse central nervous system after systemic delivery of a self-complementary AAV-PHP.B vector.</a> Gene Therapy. 25 (2), 83-92 (2018).</li>
<li>Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-free+Production+of+Laboratory+Grade+AAV+and+Purification+by+Iodixanol+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Helper-free Production of Laboratory Grade AAV and Purification by Iodixanol Density Gradient Centrifugation.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 10, 1-7 (2018).</li>
<li>Merdan, T., Kunath, K., Fischer, D., Kopecek, J., Kissel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+processing+of+poly%28ethylene+imine%29%2Fribozyme+complexes+can+be+observed+in+living+cells+by+using+confocal+laser+scanning+microscopy+and+inhibitor+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Intracellular processing of poly(ethylene imine)/ribozyme complexes can be observed in living cells by using confocal laser scanning microscopy and inhibitor experiments.</a> Pharmaceutical Research. 19 (2), 140-146 (2002).</li>
<li>Meissner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+gene+expression%3A+recombinant+protein+production+with+suspension-adapted+HEK293-EBNA+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Transient gene expression: recombinant protein production with suspension-adapted HEK293-EBNA cells.</a> Biotechnology and Bioengineering. 75 (2), 197-203 (2001).</li>
<li>Reed, S. E., Staley, E. M., Mayginnes, J. P., Pintel, D. J., Tullis, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+mammalian+cells+using+linear+polyethylenimine+is+a+simple+and+effective+means+of+producing+recombinant+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Transfection of mammalian cells using linear polyethylenimine is a simple and effective means of producing recombinant adeno-associated virus vectors.</a> Journal of Virological Methods. 138 (1-2), 85-98 (2006).</li>
<li>Zolotukhin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene Therapy. 6 (6), 973-985 (1999).</li>
<li>Kaludov, N., Handelman, B., Chiorini, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+Purification+of+Adeno-Associated+Virus+Type+2%2C+4%2C+or+5+Using+Ion-Exchange+Chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Scalable Purification of Adeno-Associated Virus Type 2, 4, or 5 Using Ion-Exchange Chromatography.</a> Human Gene Therapy. 13 (10), 1235-1243 (2002).</li>
<li>Nass, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+Method+for+the+Purification+of+Recombinant+AAV+Vectors+of+Differing+Serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Universal Method for the Purification of Recombinant AAV Vectors of Differing Serotypes.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 9, 33-46 (2017).</li>
<li>Qu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+adeno-associated+virus+type+2+empty+particles+from+genome+containing+vectors+by+anion-exchange+column+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Separation of adeno-associated virus type 2 empty particles from genome containing vectors by anion-exchange column chromatography.</a> Journal of Virological Methods. 140 (1-2), 183-192 (2007).</li>
<li>Holehonnur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viral+serotypes+produce+differing+titers+and+differentially+transduce+neurons+within+the+rat+basal+and+lateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala.</a> BMC Neuroscience. 15, 28(2014).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

הייצור של וקטורים AAV רקומביננטי המתוארים כאן שימושים חומרים וציוד השכיחים ביותר בביולוגיה מולקולרית מעבדות ומתקני תרבות תא. זה מאפשר למשתמש לקבל וקטורים AAV כיתה טהור, פרה, יכול לשמש למטרה מספר סוגי תאים ורקמות על פני מגוון של יישומים במבחנה , ויוו . אחד היתרונות הגדולים של פרוטוקול זה, בהשוואה לאחרים (קרי, המבוסס על CsCl טיהור), הוא זמן העבודה קצר יותר הדרושים. מוכן לשימוש AAV וקטורים הם להשיג מקסימום של 6 ימי עבודה לאחר תרביות תאים הראשונית של תאים HEK293T.
מספר גורמים יכולים להשפיע באופן שלילי על התשואה הסופית או האיכות של הווקטור AAV. תרביות תאים עניים יעילות היא אחת הסיבות העיקריות התשואה נגיפי נמוך33. המלצה העיקרי הוא השימוש של תאים HEK293T, כי יש לא היה passaged יותר מ-20 פעמים וגם אין זרימה תא גדול מ- 90% בזמנו של תרביות תאים21. בנוסף, שיטת תרביות תאים שנבחרה יש השפעה גדולה על התוצאות. פרוטוקול זה מבוסס על השימוש של פיי. פיי הוא פולימר cationic עם היכולת להעביר אקסוגני DNA גרעין התא באמצעות הדור של קומפלקסים של פולימר ו חומצות גרעין, הידועה בשם polyplexes, אשר נלקחים על ידי תא הנסחרות ויה endosomes34. תרביות תאים מבוססת-פיי הוא קל ומהיר לביצוע, לעומת שיטות אחרות בשימוש נרחב, כגון המשקעים שיתוף של ה-DNA עם סידן פוספט35. גם, תרביות תאים מבוססת-פיי הוא הרבה יותר זול בהשוואה הציג לאחרונה בשיטות אחרות, כגון השימוש של ליפידים cationic ותקנים בתיווך מגנט36.
האסטרטגיה טיהור ממלא תפקיד מפתח בפרוטוקול. לעומת שיטות אחרות, purifications iodixanol מבוססי נוטים מכילות אחוז גבוה יותר של חלקיקים נגיפיים ריקה (20%)20. זה קוזז, במידה, על ידי העובדה טיהור מבוסס-iodixanol תוצאות באופן שגרתי AAV וקטור ההכנות עם יחס של חלקיקים-אל-infectivity של פחות מ 100. זה מייצג שיפור משמעותי לעומת נהלים קונבנציונאלי המבוסס על CsCl, אשר הינו אובדן משמעותי של חלקיקים infectivity דיווחו37. עוד שיטה חלופית נפוצות לטהר AAV וקטורים הוא טיהור מבוססי וואקום. עם זאת, שיטה זו יש את החיסרון העיקרי אשר נדרשת עמודה ספציפית לכל capsid וקטור בשימוש: לדוגמה, בעוד AAV2 הוא מבודד בסגנון קלאסי באמצעות עמודות הפארין, מתודולוגיה זו אינה פועלת עם AAV4 ו- AAV5, אשר לא ניחנת הפארין מחייב אתרים על שלהם capsids38. בהתחשב בעובדה לטיהור גזים היא גם יקר, טיהור מבוסס-iodixanol היא בדרך כלל מתאימה יותר עבור מעבדות שרוצים לייצר באיכות גבוהה קבוצות של וקטורים AAV על בקנה מידה קטן33,39, 40. עם זאת, על מנת למקסם את התשואה הסופית וטוהר של וקטור, קיצוני טיפול נחוץ בעת ביצוע מעברי הצבע iodixanol. שברים iodixanol שונים יש להעביר את הצינור ultracentrifugation באמצעות פיפטה פסטר סטרילי עצה אשר נוגעת בקיר של הצינור: iodixanol צריך להיות מגורש מן פיפטה לאט ובאופן רצוף. כל החלקיקים וקטור להצטבר בשכבת iodixanol 40%, טיפול צריך לנקוט כדי להבטיח כי הממשקים ההדרגתי אל תערבב בין20. לבסוף, השבר המכיל את הווקטור צריך להיות התאושש על ידי החדרת מחט בוטה-נירוסטה עם לאמוד לא יותר מאשר 20 G... כדי ששחזור וקטור, השבר ברור צריכים להיות מאוחזרים בשלמותו. במהלך שלב זה, תזמון הוא קריטי. כדי להימנע להתפשר על הטוהר של ההכנה, זה חיוני כדי לעצור את האוסף לפני בשלבים אחרים (מזהמים) של מעבר הצבע נאספים.
הבדלים כייל וקטור שהושג ניתן גם לייחס את היכולת הפנימית של וקטור לייצר חלקיקים הארוזה. השוואה בין שונים AAV אשר נגרמו מהזנים אליהם הראה כי וקטורים AAV מסוימים הם יותר קשה לייצר בבית כייל נוגדנים גבוה יותר מהאחרים (למשל, AAV2)41. משקעים של וקטור, במהלך השלב desalting, יכול להיות סיבה אפשרית כייל נמוך יותר, למנוע בקלות על ידי הימנעות overconcentration33. יתר על כן, זה גם אפשרי כי היעילות של iodixanol מבוססי הדרגתי טיהור מעט שונה בין אשר נגרמו מהזנים אליהם, לכן, סתירות כייל שהושג עם אשר נגרמו מהזנים אליהם שונה יכול להיות שנצפו41.
בסופו של דבר, זה צריך להיות הצביע כי למרות qPCR היא שיטה מאוד מדויק על ה-DNA כימות כמה השתנות הגלום בטכניקה יכול להיות שנצפו. דיוק ב טיטור תלוי בעיקר pipetting מדויקת ואת vortexing נאות של כל הפתרונות. כדי להבטיח כייל המדויקת ביותר את הקריאה, qPCR יכול להיות באופן עצמאי חוזרות ונשנות, חישוב הממוצע הערכים שהושג. הבחירה של תחל הוצג פרוטוקול זה מבוסס על הרצף של האמרגן כקבוצת ממוקם על פלסמיד pTransgene השתמשו במעבדה שלנו. האמרגן כקבוצת הוא יזם סינתטי חזק נעשה שימוש נרחב בתחום וקטור לביטוי נסיעה על פני סוגי תאים מרובים. הוא כולל מספר אלמנטים, כולל cytomegalovirus (CMV) מוקדם משפר רכיב; יזם את אקסון הראשון, את אינטרון הראשון של הגן כקבוצת; את מקבל אחוי של הגן β-גלובין ארנב. עם זאת, ניתן לעצב תחל עבור כמעט כל רכיב ממוקם בתוך בקלטת ביטוי (כולל את המקדם, transgene ורכיבים תקינה). ההשוואה של כייל נוגדנים על פני אצוות הוא אפשרי, גם מתן תחל משמשים נגד באזורים משותפים הווקטורים המדובר.
לסיכום, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לייצר AAV וקטורים עם מגוון רחב של capsids, תצורות הגנום, יזם סוגי transgene וחקלאיים. פעולה זו תאפשר למשתמשים להתאים בקלות את מאפייני הסופי של וקטורים שלהם בצורה הטובה ביותר לצרכים ניסיוני. בדוגמה שהוצגו בתוצאות נציג, השימוש PHP. B capsid, אשר ביעילות חוצה BBB, נתן ביטוי גנים יעילה במיוחד מערכת העצבים, הזרקת וריד הזנב הבאים32. המינהל מערכתית של וקטורים penetrant CNS יתרונות ניכר מבחינת תופעות הלוואי האפשריות-2,17,32. אלטרנטיבה אפשרית הזרקת היקפיים, תוך הימנעות את האזהרות של טכניקות פולשנית, היא משלוח במחלה, אשר מורכב של משלוח של וקטור AAV לתוך הנוזל מוחי שדרתי. המסלול משלוח הוכח להיות יעיל, מציג ביטוי נרחב של transgene על פני מערכת העצבים, פחות תופעות מחוץ-יעד איברים היקפיים, רמות נמוכות של התגובה החיסונית42. עם זאת, זריקות במחלה הם הרבה יותר מאתגר, כפי שהם דורשים כישורים טכניים גבוהים יותר מאשר הזרקה וריד הזנב.
פיתוח נוסף capsid כדי לחדד את הטכנולוגיה הזאת תהיה מונעת על ידי ההזדמנויות לשימוש וקטור AAV ביישומי טיפול גנטי. גישות כאלה מציעים אפשרויות אטרקטיבי לטיפול כיום חשוכת מרפא הפרעות מערכת העצבים המרכזית, כגון נוירודגנרטיביות, מחלת שארקו-מארי-שן, פרקינסון, אלצהיימר18.

במהלך 30 השנים האחרונות, AAVs פראי-סוג יש מהונדס ליצירת וקטורים AAV רקומביננטי, אשר הוכיחו להיות כלי שימושי במיוחד עבור העברה גנטית לתוך מערכת העצבים המרכזית1,2,3,4, 6 5,טיפול גנטי מתקרב ל-4,המחלה (כולל ה-FDA-EMA-אישרה טיפולים)7. להתאמתם לשימוש מערכת העצבים נובעת במידה רבה היכולת שלהם להדביק תאים ללא הפרדה, שלאחר mitotic, נמצאו בדרך כלל ב- CNS8. עם זאת, מבוססת AAV וקטורים יש גם יתרון המאפשר ביטוי לטווח ארוך של כל4,transgene טיפולית נתון9 תוך העלאת לתגובה החיסונית מתון לעומת ויראלי וקטורים אחרים7, 8,10,11,12.
האלמנטים העיקריים של כל וקטור AAV הם הגנום של capsid. AAVs פראי-סוג הם חד-גדילי (הה) ה-DNA וירוסים עם הגנום של 5 kilobases (kb)13. לייצור של וקטורים AAV רקומביננטי, הגנים. נציג ו cap (הכרחי עבור שכפול גנום לבין ההרכבה של capsid ויראלי) נמחקים מן הגנום של AAV פראי-סוג וסיפק טרנס, השארת מקום קלטת ביטוי המכיל את ה-14,transgene15. הפוך מסוף חוזר הרצפים (ITRs) של הגנום הנגיפי המקורי הם האלמנטים יתרת היחידה וקטור AAV, כמו אלה הם חיוניים עבור שכפול ואריזות3,10,14. . ניתן לתכנן AAV וקטורים כדי לשפר את הביטוי transgene; מוטציה באחד ITRs מוביל היווצרות לולאה מכבנה המאפשר ביעילות את הדור של משלים דנ א סטרנד3,7,15. היתרון העיקרי של תצורה זו, כינה את הגנום העצמי-משלימים (sc), הוא זה עוקף את הצורך שנייה-strand סינתזה טיפוסי במחזור החיים המקובלת של AAVs, להגדיל באופן משמעותי את המהירות ואת רמות ביטוי transgene 1. יחד עם זאת, שימוש של הגנום scAAV מפחית את קיבולת מטען של וקטור כ 2.4 kb. זה כולל רצפים transgene, כמו גם כל רצפי רגולטוריות כגון היזמים או אתרים מחייב microRNA, להגבלת ביטוי סוגי תאים מסוים16.
Capsid AAV קביעת האינטראקציה תא וקטור-מארח, מקנה מידה של tropism סוג או רקמת תאים עבור serotype AAV, אשר ניתן לנצל גם כדי להגביל את הביטוי transgene למיקומים ספציפיים. מספר AAV אשר נגרמו מהזנים אליהם נמצאים בטבע, ואילו אחרים הופקו במעבדות באמצעות גישות רקומביננטי (קרי, PHP. B). בנוסף, יש capsids גם להעניק מאפיינים שימושיים אחרים, כגון היכולת חוצה BBB, וכתוצאה מכך המסירה של transgenes ברחבי מערכת העצבים לאחר ניהול מערכתי. זה הוכח AAV9, כמו גם את PHP תיאר לאחרונה. B capsid17. כתוצאה מכך, הם אלה אשר נגרמו מהזנים אליהם להוכיח להיות רלוונטיים במיוחד עבור גישות טיפול גנטי חדשות1817,1,הפרעות ניווניות.
המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר שיטה חסכונית לייצור בקנה מידה קטן של וקטורים AAV עם כייל נוגדנים גבוה וטוהר. למרות התוצאות המובאות כאן להשתמש את PHP. B capsid, קלטת ביטוי scAAV, הפרוטוקול מתאים בייצור של AAV וקטור אשר נגרמו מהזנים אליהם מספר תצורות הגנום, ומאפשר גמישות מקסימלית ניסיוני. עם זאת, התשואה וקטור וטוהר הסופי יכול להשתנות בהתאם serotype שבחרת.
הפרוטוקול עצמו הוא וריאציה של השיטה הקלאסית tri-תרביות תאים לייצור וקטור ויראלי, משלב את השימוש ההדרגתי iodixanol עבור וקטור לנקות, אשר, לעומת השימוש הקלאסי של צסיום כלוריד (CsCl), מעברי צבע, כבר דיווח לייצר AAV וקטורים של טוהר גבוהה יותר יעיל יותר זמן באופן19,20,21.
השלבים תרביות תאים, היטהרות, ריכוז נועדו לבצע לפי מעבדה (GLP) במעבדה תרביות רקמה מדורג לעבודה וקטור ויראלי. כל פעילות צריכה להתבצע בהתאם החקיקה המקומית והארצית הרלוונטיים הנוגעים וקטור ויראלי הייצור ולהשתמש. עבודה צריך להתבצע תחת תא למינארי, בתנאים סטריליים. בתוך המתקן וקטור, מומלץ ללבוש סינר של המעבדה, בנוסף המעבדה תרביות רקמה רגילה. יתר על כן, זוג כפול של כפפות, כמו גם overshoes פלסטיק, צריך להיות משוחק בכל עת.
לפני החל בייצור וקטור, להבטיח את כל הציוד הנדרש, פלסמידים הינם זמינים. 1) פלסמיד pCapsid מכיל את הגן נציג מקודד חלבונים שאינם מבניות ארבע הכרחי עבור שכפול, כלומר Rep78, Rep68, Rep52 ו Rep40, הגן קאפ מקודד חלבונים מבניים capsid שלוש, כלומר VP1 VP2, VP3. 2) פלסמיד pHelper מכיל את הגנים E4, E2Aו- VA אדנו, המספקות AAV ייצור בתאים HEK293T. 3) פלסמיד pTransgene מכיל את הקלטת ביטוי transgene, ולצדו שני ITRs. פלסמידים אלה יכול להיות מסונתז דה נובו במעבדה בעזרת רצפים זמינים באינטרנט22. עבור פלסמידים גרם דה נובו, במיוחד אלה המכילים transgenes הרומן, רצף נדרש, כדי לוודא כי transgene ואת ITRs נכונים. לחלופין, פלסמידים premade ניתן לרכוש ישירות באמצעות מאגרים מקוונים פלסמיד. בעת הצורך, פלסמידים יכולים להיות מוגבר, מטוהרים באמצעות ערכות רגיל, על פי הוראות היצרן23.
וקטור כייל וטוהר עלולה להשפיע לרעה על יכולת התמרה חושית של וקטור. פרוטוקולים נוספים מסופקים כדי להעריך את האיכות של וקטור המיוצר. הווקטורים הסופי יהיה שימושי עבור מחקרים של הפונקציה cell CNS ביישומים גם במבחנה וגם ויוו .

<table><tbody><tr><td>ייצור פלסמיד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pTransgene plasmid</td><td>De novo design או מתקבל ממאגר פלסמיד</td><td>N/A</td><td>ראה שלב 1 של הפרוטוקול הראשי לפרטים נוספים</td></tr><tr><td>pCapsid</td><td>De novo עיצוב או שהושג ממאגר פלסמיד</td><td>N/A</td><td>ראה שלב 1 של הפרוטוקול הראשי לפרטים נוספים</td></tr><tr><td>pHelper</td><td>Agilent</td><td>240071</td><td></td></tr><tr><td>פלסמיד Plus maxi ערכת</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR ערכת טיהור</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>AAV מערכת ללא עוזר</td><td>Agilent</td><td>240071</td><td></td></tr><tr><td><חזק>תרבית תאים וטרנספקציה </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>דולבקו s Modified Eagle Medium (DMEM), גלוקוז גבוה, ללא גלוטמין</td><td>Life Technologies</td><td>11960-044</td><td>תוסף DMEM עם FBS (1% או 10% v/v) ו-GlutaMAX 200 מ"מ (1% v/v) ואז מסנן את המדיום באמצעות 0.22 ומיקרו; מסנן m</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>GIBCO</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>תוסף GlutaMAX</td><td>GIBCO</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>(200 מ"מ)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>מערכת מסנן ואקום על בקבוק קורנינג</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430769</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s תמיסת מלח חוצצת פוספט (DPBS) ללא סידן וללא מגנזיום</td><td>GIBCO</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>תאי HEK293T אוסף</td><td>תרביות רקמה אמריקאיות</td><td>CRL3216</td><td>עם קבלתם, יש להפשיר את התאים והתרבית כמתואר בפרוטוקול. לאחר מספר מינימלי של קטעים, הקפיאו תת-חלק לעתיד ב-aliquots.&nbsp; השתמש תמיד בתאים מתחת לקטע מספר 20. לאחר שתאים מתורבתים עברו יותר מ -20 פעמים, הפעל מחדש תרבית מהאליקוטים המאוחסנים</td></tr><tr><td>כלי תרבית תאים</td><td>Greiner Cellstar</td><td>639160</td><td>צלחות תרבית בקוטר 15 ס"מ</td></tr><tr><td>מגרדי תאים</td><td>VWR</td><td>10062-904</td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילנימין (PEI)</td><td>Polyscience</td><td>23966-2</td><td>PEI בצורת אבקה מומס ב-1 ומיקרו; g/&micro; L במים נטולי יונים (<תת>ddמים) ב-pH=2 (השתמש ב-HCl). מכינים בכוס ומערבבים 2-3 שעות. כאשר הוא מומס, החזירו את ה-pH ל-7 עם NaOH. מסננים, מעקרים ומאחסנים את תמיסת המלאי המושהה ב-1 מ"ל ב-20 מעלות צלזיוס. 
 להקפיא/להפשיר מספר פעמים.</td></tr><tr><td>פתרון Virkon</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9821357</td><td>לחטא כל חומר שהיה במגע עם חלקיקי וקטור מורכבים עם תמיסת Virkon</td></tr><tr><td>סינרים עם שרוולים ארוכים Mutexi</td><td>Fisher Scientific</td><td>11735423</td><td>ללבוש סינר מעל החלק העליון של מעיל מעבדה רגיל</td></tr><tr><td>Fisherbrand הגנה מקסימלית נעליים חד פעמיות</td><td>Fisher Scientific</td><td>15401952</td><td></td></tr><tr><td><חזק>AAV טיהור והתפלה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optiprep מדיום שיפוע צפיפות</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>Optiprep הוא תמיסה של 60% (w/v) של יודיקסנול במים (סטרילי). זהירות. השתמש מתחת לקולט אדים למינארי. ללבוש כפפות</td></tr><tr><td>פנול אדום</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P0290</td><td>זהירות. יש להשתמש מתחת לקולט אדים למינארי</td></tr><tr><td>פיפטה</td><td>פסטר סיגמא-אולדריץ</td><td>' Z627992</td><td>לעקר לפני השימוש</td></tr><tr><td>שפופרות פוליפרופילן</td><td>OptiSeal Beckman</td><td>361625</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase (250 U/&micro; L)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014</td><td>מסופק כפתרון מוכן לשימוש</td></tr><tr><td>מסנן מזרק Acrodisc</td><td>Pall corporation</td><td>4614</td><td></td></tr><tr><td>מזרק אומניפיקס (5 מ"ל)</td> <td>בראון</td><td>4617053V</td><td></td></tr><tr><td>מחט מזרק קהה</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z261378</td><td>מחט מזרק נירוסטה 316, פיפטינג קהה 90&deg; מד קצה 16, L 4 אינץ'. מכונה בטקסט מחט קהה</td></tr><tr><td>Aqua Ecotainer</td><td>B. Braun</td><td>0082479E</td><td>מים סטריליים ללא אנדוטוקסין. המכונה 'מים אולטרה-טהורים'Amicon</td></tr> <tr><td>אולטרה-15 יחידת מסנן צנטריפוגלי</td><td>Millipore</td><td>UFC910024</td><td>מסננים אלו מרכזים את המוצר הסופי על ידי איסוף חלקיקי הווקטור בשלבי צנטריפוגה עוקבים</td></tr><tr><td>Pluronic F68 (100x)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>24040032</td><td>פעילי שטח לא יוניים. לדלל ב-PBS סטרילי לשימוש ב-0.01% (v/v)</td></tr><tr><td>צינורות מיקרו-צנטריפוגה סטריליים של Fisherbrand עם מכסי בורג (2 מ"ל)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-374</td><td>השתמש בצינורות חצאית לטיפול קל</td></tr> <tr><td><חזק>AAV טיטרציה </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אנזים הגבלה: StuI (10 U/&micro; L)</td><td>Promega</td><td>R6421</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I (1 U/&micro; L)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3115852001</td><td>להרכיב מחדש במים טהורים במיוחד ולהשתמש בריכוז סופי של 10 מ"ג/מ"ל. ניתן לאחסן את הפתרון בטמפרטורה של -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>EasyStrip Plus רצועות צינור (עם כובעים מחוברים)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AB2000</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf microtube 3810x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z606340-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler Multiwell צלחות מרובות, 96 בארות</td><td>Roche</td><td>4729692001</td><td>צלחת פוליפרופילן לבנה (עם ברקוד זיהוי ייחודי)</td></tr><tr><td>לוחית PCR Microseal 'A' וסרט איטום צלחת</td><td>PCR Bio-Rad</td><td>msa5001</td><td></td></tr><tr><td>AAV בקרת טוהר </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td>מרכיבים מחדש במים טהורים במיוחד ל-10% (v/v). זהירות. השתמש מתחת לקולט אדים למינארי. ללבוש כפפות</td></tr><tr><td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td>זהירות. השתמש מתחת לקולט אדים למינארי. ללבוש כפפות</td></tr><tr><td>Tris Base ULTROL Grade</td><td>Merck</td><td>648311</td><td>זהירות: השתמש מתחת לקולט אדים למינארי. ללבוש כפפות</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Thermo Fisher</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Rotiphorese&reg; ג'ל 30 (37,5:1)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.3</td><td>תמיסת מלאי מימית 30% אקרילאמיד וביסקרילאמיד ביחס של 37.5:1. זהירות: השתמש מתחת לקולט אדים למינארי. ללבוש כפפות</td></tr><tr><td>Serva Blue G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6104-58-1</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus טוש מוכתם</td><td>מראש Bio-Rad</td><td>1610374edu</td><td></td></tr><tr><td>1-Butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7906</td><td>זהירות: השתמש מתחת למכסה זרימה למינרית. ללבוש כפפות</td></tr><tr><td><חזק>אימונוהיסטוכימיה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ארנב אנטי-GFP</td><td>מערכות סינפטיות</td><td>132002</td><td>1:300 דילול</td></tr><tr><td>אנטי-ארנב Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>1:1,000 דילול</td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק> </td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Vector production lab</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotina 380 צנטריפוגה ספסל *</td><td>Hettich</td><td>1701</td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN 80 אולטרה-צנטריפוגה *</td><td>Beckmann Coulter</td><td>A95765</td><td></td></tr><tr><td>Type 50.2 Ti רוטור טיטניום בזווית קבועה *</td><td>Beckmann Coulter</td><td>337901</td><td></td></tr><tr><td>Entris Digital סולם *</td><td>Sartorius</td><td>2202-1S</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים חמים *</td><td></td><td></td><td>מוגדר ב-37 מעלות; C</td></tr><tr><td>דלי קרח *</td><td>VWR</td><td>10146-290</td><td>שמור על החומר המשמש במעבדת ייצור הווקטור בנפרד מזה המשמש באזורי מעבדה סטנדרטיים</td></tr><tr><td>Pipetboy pro *</td><td>Integra</td><td>156,400</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות מדורגות: כוכב תא *</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>606180</td><td>קיבולת של 5 מ"ל</td></tr><tr><td>פיפטות מדורגות: כוכב תא *</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>607180</td><td>קיבולת של 10 מ"ל</td></tr><tr><td>פיפטות בוגרות: כוכב תא *</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>760180</td><td>קיבולת של 25 מ"ל</td></tr><tr><td>CO2 חממה CB150 *</td><td>קלסר</td><td>9040-0038</td><td>מוגדר ב-37 מעלות; C, 5% CO2 ו-95% לחות</td></tr><tr><td>ארון בטיחות Nuaire NU 437-400E *</td><td>Labexchange</td><td>31324</td><td>נקה את כל המשטחים עם 70% אתנול ווירקון לפני ואחרי השימוש</td></tr> <tr><td><חזק>מעבדה קונבנציונלית</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T100 תרמית *</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Instrument II *</td><td>Roche</td><td>5015278001</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer *</td><td>Eppendorf</td><td>C 5382000015</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop *</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND 2000</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean Tetra Cell*</td><td>Bio-Rad</td><td>1658001FC</td><td>לשימוש עם ג'לים בעבודת יד או טרומיים</td></tr><tr><td>ערכת כתמי כסף ProteoSilver</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PROTSIL1</td><td>זיהוי חלבון ברגישות גבוהה עם רקע נמוך</td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5804 R * </td><td>Eppendorf</td><td>B1_022628045</td><td>צנטריפוגה במהירות גבוהה לצרכי קיבולת בינונית (עד 250 מ"ל)</td></tr> <tr><td>פיפטות מדורגות כוכב תא *</td><td>גריינר ביו-אחד</td><td>606180</td><td>5 מ"ל</td></tr><tr><td>פיפטות מדורגות כוכב תא *</td><td>גריינר ביו-אחד</td><td>607180</td><td>25 מ"ל</td></tr><tr><td>פיפטות מדורגות כוכב תא *</td><td>גריינר ביו-אחד</td><td>760180</td><td>25 מ"ל</td></tr><tr><td>קצות סינון *</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>750257</td><td>1250 ומיקרו; L</td></tr><tr><td>טיפים לסינון *</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>738257</td><td>300 ומיקרו; L</td></tr><tr><td>טיפים לסינון *</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>771257</td><td>10 ומיקרו; L</td></tr><tr><td>דלי קרח עם מכסה *</td><td>VWR</td><td>10146-290</td><td></td></tr><tr><td>משאבת ואקום מיני דיאפרגמה, VP 86 *</td><td>VWR</td><td>181-0065</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P2</td><td>Gilson</td><td>F144801</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P20</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P100</td><td>Gilson</td><td>F123615</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P200</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P1000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>* חומרים המסומנים בכוכבית הם חלקי ציוד יקרים ובדרך כלל הם פריטי תשתית מרכזיים המשותפים בין מספר מעבדות. ניתן גם להחליף פריטים אלה בפריטים מקבילים אם הם זמינים. שימו לב, כאשר משתמשים באולטרה-צנטריפוגה אחרת, יש להקפיד על בחירת צינורות הרוטור והצנטריפוגה הנכונים.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הפקה, טיהור, ובקרת איכות על adeno-הקשורים וקטורים מבוסס-וירוס

Production, Purification, and Quality Control for Adeno-associated Virus-based Vectors

ג'ין משלוח כלי מבוסס על וירוסים adeno-הקשורים (AAVs) הם בחירה פופולרית עבור מסירת transgenes על מערכת העצבים המרכזית (CNS), כולל יישומים טיפול גנטי. וקטורים AAV הם ללא שכפול, מסוגל להדביק החלוקה והן הלא-חלוקת תאים ולספק ביטוי transgene לטווח ארוך. חשוב, כמה אשר נגרמו מהזנים אליהם, כגון PHP שתואר לאחרונה. B, יכול לחצות-מחסום הדם המוח-(BBB) במודלים של בעלי חיים, שלאחר משלוח מערכתית. וקטורים AAV יכול להיות מיוצר באופן יעיל במעבדה. עם זאת, פרוטוקולים לשחזור ועמיד נדרשים להשיג AAV וקטורים עם רמות טוהר מספיק וערכי כייל נוגדנים גבוה מספיק עבור יישומים ויוו . פרוטוקול זה מתאר את אסטרטגיית לשחזור ויעילה לייצור וקטור AAV, המבוסס על אסטרטגיית טיהור הדרגתיות iodixanol. שיטת טיהור iodixanol מתאימה להשגת קבוצות של וקטורים AAV כייל גבוה של טוהר גבוהה, בהשוואה לשיטות טיהור אחרות. יתר על כן, הפרוטוקול הוא בדרך כלל מהר יותר מאשר שיטות אחרות כיום המתואר. בנוסף, שרשרת פולימראז כמותיים התגובה (qPCR)-אסטרטגיה מבוסס מתואר לקבלת החלטה מהיר ומדויק של כייל את וקטור, כמו גם כסף מכתים שיטה לקבוע את הטוהר של אצוות וקטור. לבסוף, התוצאות נציג של המסירה הגן מערכת העצבים, בעקבות ניהול מערכתי AAV-PHP. B, מוצגים. תוצאות כאלה צריך להיות אפשרי במעבדות כל באמצעות פרוטוקולים המתוארות במאמר זה.

AAV9 נחשב, עד לאחרונה, להיות serotype וקטור AAV היעיל ביותר חוצה BBB ו transducing תאים של מערכת העצבים, בעקבות ניהול היקפיים. הושגה התקדמות משמעותית בעיצוב capsid כאשר Deverman et al. דיווח על השימוש של שיטת הבחירה capsid בשם Cre מבוססי רקומבינציה האבולוציה, ממוקדות AAV (צור)17. באמצעות שיטה זו, הם זיהו capsid חדש, בשם PHP. B, הם דיווחו מסוגל מגלי רוב האסטרוציטים הנוירונים באזורים CNS מרובים, בעקבות הזרקת מערכתית17. בשלב זה, זה צריך להיות ציין כי למרות PHP. B מספק תוצאות חיוביות בעכברים C57/Bl6 (אשר היה המתח המשמשים את הניסויים בידוד הראשוני), דיווח ראשוני מציע שהיעילות שלה עשויים להשתנות באופן תלוי-זן. לניסויים נוספים וויל, בלי ספק, לשפוך אור נוסף על בעיה זו31.
עם זאת, למרות בעיות אלה, PHP. B מציע אפשרויות מרגשות עבור מניפולציה ג'ין לא פולשנית של מערכת העצבים של עכברים, כולל הוכחה הרעיון ג'ין טיפול ניסויים במודלים של המחלה. לכן, בחרנו להעריך את היעילות של transgene ביטוי באמצעות PHP. B נגד AAV9, אשר היה הווקטור "תקן הזהב" עבור התמרה חושית CNS בעקבות ניהול היקפיים מאז 20092. כדי לבצע השוואה ישירה של שני אשר נגרמו מהזנים אליהם, בתנאים מיטביים עבור ביטוי transgene, השתמשנו תצורה של הגנום sc32. שני וקטורים נשא את transgene של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת השליטה של האמרגן β-אקטין (כקבוצת) עוף בכל מקום. עכברים C57/Bl6 נקבה ביום כמחנכת 42 (כ 20 גר' במשקל) קיבל מנה של עונה 1 פרק 10 vg12 לכל העכבר של גם scAAV2/PHP. B-כקבוצת-GFP או scAAV2/9-כקבוצת-GFP. וקטור המינהל היה שבוצעו באמצעות הזרקת וריד הזנב. הניסויים אושרו על ידי הוועדה האתית של ליובן KU.
Postinjection שלושה שבועות, העכברים עברו transcardial זלוף עם PBS קר כקרח, ואחריו 4% (w/v) paraformaldehyde קר כקרח (PFA). המוח שלהם נבצרו ועברתי עוד יותר postfixation על ידי דגירה לילה אותו לשבועיים, לפני העברת 0.01% (w/v) Na-אזיד/PBS לאחסון עד ניתוח נוסף. לאחר מכן, המוח היו למחלקה באמצעות מיקרוטום רוטטת ולאחר אימונוהיסטוכימיה בוצעה על 50 מיקרומטר חלקים עבה.
כדי להעריך את רמות הביטוי transgene, קטעים היו מוכתמים העיקרי נוגדנים נגד GFP (ארנב אנטי-GFP), עם זיהוי באמצעות נוגדנים משניים מצומדת כדי הפלורסנט (אנטי-ארנב אלקסה עבור חיל הים 488) (איור 4A, B ). מדידות עוצמת קרינה פלואורסצנטית (ביחידות שרירותי [au]) אישר עלייה משמעותית בביטוי GFP כאשר sc הגנום, את PHP. B capsid שימשו ביחס AAV9. העלאות GFP נצפו במוח (2105 ± 161 לעומת 1441 ± 99 au; p = 0.0032), המוח הקטן (2601 ± 196 לעומת 1737 ± 135 au; p = 0.0032), ואת גזע המוח (± 319 3082 לעומת 2485 au ± 88; p = 0.0038) (איור 4C).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58960/58960fig4.jpg"> איור 4: משלוח מערכתית של scAAV2/PHP. B-כקבוצת-GFP מוביל ביטוי GFP גבוהה ב מערכת העצבים. scAAV2/PHP. B-כקבוצת-GFP או scAAV2/9-כקבוצת-GFP (1 x 1012 vg/עכבר) היה מנוהל בת 6 שבועות לעכברים C57/Bl6 באמצעות הזרקת וריד הזנב. GFP זוהה באמצעות אימונוהיסטוכימיה על המוח הילתית סעיפים 3 שבועות postinjection. (א) המוח לבין (B) המוח, גזע המוח מוצגים. גודל ברים = 1 מ מ. (ג) כימות של עוצמות קרינה פלואורסצנטית היחסי בוצע כדי לקבוע את הרמות של אות ה-GFP מושגת עם כל וקטור (סעיפים 10 לכל עכבר; שלושה עכברים לכל וקטור קבוצה). בוצע מבחן ANOVA בכיוון אחד, ואחריו דו-זנבית של סטודנט t-מבחן; הנתונים מבוטא הממוצע ± סטיית התקן; p &lt; 0.01; au. יחידות שרירותיות. pCapsid, המשמש לייצור וקטור AAV, מכיל את הגן נציג של serotype 2 הוא ג'ין קאפ מ serotype PHP. B או AAV9, בהתאם. דמות זו שונתה מ רינקון et al.32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58960/58960fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

כאן, אנו מתארים אסטרטגיית לשחזור ויעילה כדי לייצר כייל נוגדנים, בקרת איכות קבוצות של וקטורים adeno-הקשורים וירוס. היא מאפשרת למשתמש לקבל הכנה וקטור עם כייל גבוה (≥1 x 1013 וקטור הגנום/mL) ואת טוהר גבוהה, מוכן לשימוש במבחנה או ויוו .

הפקה, טיהור, ובקרת איכות על Adeno-הקשורים וקטורים מבוסס-וירוס

Gene delivery tools based on adeno-associated viruses (AAVs) are a popular choice for the delivery of transgenes to the central nervous system (CNS), ...

על ידי ביצוע פרוטוקול זה, המשתמש יוכל לייצר וקטורים AAV של טוהר גבוה להיכנע מתאים יישומי במבחנה או in vivo. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לייצר ולטהר מגוון של Serotypes AAV עם הבדלים בתצורות. שילוב שני אלמנטים אלה יכול להיות שימושי כדי להשיג סוג תא וביטוי ספציפי לרקמות.ייצור של כמה serotypes יכול לתת תשואה נמוכה יותר. זהו ייצור שבו יש סרוטיפים קרובים ויש להעריך אותם על בסיס אישי. הפגנת נהלים אלה תהיה שלי פריפונט, טכנאית מהמעבדה שלנו.לאחר גידול תאי HEK, מערבבים 360 מיקרוגרם של פלסמיד עוזר, 180 מיקרוגרם של פלסמיד המקידוד את הווקטור קפסיד, ו-180 מיקרוגרם של פלסמיד המכיל את הטרנסג'נדר ב-18 מיליליטר של נתרן כלורי 150 מילימולאר להכנת תערובת הדנ"א. פזרו את התערובת הזו על פני שלושה צינורות חרוטיים של 50 מיליליטר. בצינור חרוט חדש, מערבבים 840 מיקרוגרם של PEI ושישה מיליליטר של נתרן כלורי 150 מילימולרי כדי להכין את תערובת PEI לשש מנות תרבות תאים.לאחר מכן, להוסיף שישה מיליליטר של תערובת PEI, טיפה אחר טיפה, לאחד הצינורות חרוט המכיל את תערובת ה-DNA. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. לאחר מכן, הסר שש מנות תרבות תאים מהחרם.במכסה המנוע לזרימת למינאר, שאף לחלוטין את המדיום מכל מנה. לשטוף את הכלים עם חמישה מיליליטר של DPBS מחומם מראש כדי להסיר עקבות של המדיום. הטה בעדינות כל מנה כדי להבטיח ש- DPBS יופץ באופן שווה על פני השטח כולו.לאחר מכן, שאפו בעדינות את ה-DPBS. מוסיפים 12 מיליליטר של DMEM אחד לכל מנה לאט, עם פיפטה להציב בקצה המנה. מערבבים את תערובת PEI ו- DNA על ידי צינורות אותו למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים.מוסיפים שני מיליליטר של תערובת זו לכל אחת משש מנות תרבות התאים בצורה טיפה על ידי טיפה, הקפד להפיץ אותו בזהירות על פני השטח כולו. חזור על תהליך זה באמצעות שש מנות תרבות תאים בכל פעם עד שהגיע 18 מנות תרבות התא. לנער בעדינות את מנות תרבות התא כדי להפיץ את תערובת ה- DNA PEI.דגירה התאים המרובים ב 37 מעלות צלזיוס עם 95 אחוז לחות וחמישה אחוז פחמן דו חמצני במשך חמש שעות. לאחר מכן, להוסיף 12 מיליליטר נוספים של DMEM 10 לכל אחד 18 מנות מבלי להסיר את המדיום קיים. המשך להחגירה של התאים המרובים באותם תנאים.ב 72 שעות לאחר transfection, להשתמש מגרד תאים כדי לנתק בזהירות את התאים מכל צלחת תרבות. לאסוף את המדיום ואת התאים של שתי מנות תרבות בצינור חרוט 15 מיליליטר, כל הזמן על קרח. צנטריפוגה הצינורות ב 420 פעמים G ו בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות עם האצה והאטה של הצנטריפוגה מוגדר למקסימום.בזהירות להשליך את supernatant מכל צינור על ידי בעדינות לשפוך אותו לתוך מיכל סילוק פסולת. לאחר מכן, מניחים את הצינורות המכילים את כדורי התא על קרח. אנחנו משהים כל גלולה בשני מיליליטר של חיץ תיזה ומערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה חמש עד 10 פעמים.משוך AAV משלושה צינורות, יחד. כדי להתחיל, להקפיא את התאים מושעה מחדש על ידי הצבת אותם בדלי המכיל קרח יבש מעורבב עם אתנול. ואז להפשיר את התאים על ידי הצבתם מיד באמבט מים להגדיר ב 37 מעלות צלזיוס.חזור על מחזור ההקפאה וההפשרה הזה שלוש פעמים כדי ללחש את התאים ולשחרר את חלקיקי AAV. לאחר צעד ההפשרה השלישי, צנטריפוגה ב 1167 פעמים G ו בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. בזהירות להעביר את supernatants לנקות 50 צינורות חרוט מיליליטר.מוסיפים נוקלאז לכל צינור לריכוז סופי של 50 יחידות למיליליטר של על-טבעי. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, תוך מערבולת הצינורות כל 10 דקות כדי להבטיח כי הגרעין מעורבב ביסודיות עם על טבעי. צנטריפוגה ב 13490 פעמים G ו בארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כדי להבהיר את העל טבעי.לאחר מכן, להסיר את הבוכנה של מזרק 10 מיליליטר, לחבר מסנן 0.45 מיקרומטר למזרק ולהכניס אותו על גבי צינור חרוט נקי 50 מיליליטר. ממלאים בזהירות את המזרק עם העל-טבעי המובהר. השתמש הבוכנה כדי לכפות את lysate דרך המסנן.לאחר מכן, להכין כל אחד שברי יודיקסנול בארבעה צינורות חרוט 50 מיליליטר נפרדים, כפי שמתואר בטבלה אחד מפרוטוקול הטקסט. פיפטה שמונה מיליליטר של 15 אחוז יודיקסנול לתוך כל אחד משלושת צינורות אולטרהצנטריפוגה. פיפטה 5.5 מיליליטר של 25 אחוז יודיקסנול לתוך צינור חרוט נקי 50 מיליליטר.באמצעות פיפטה פסטר לא מדורגת, בזהירות שכבה 5.5 מיליליטר של 25 אחוז יודיקנול פתרון מתחת 15 אחוז יודיקנול פתרון. הוסף את הפתרונות של 40 אחוז ו- 60 אחוז כמתואר בפרוטוקול הטקסט. שברי יודקסנול לא צריכים להתערב בשכבות.באמצעות פיפטה פסטר, שכבת lysate גולמי על גבי 15 אחוז iodixanol שיפוע, טיפה אחר טיפה, כדי למנוע הפרעה הממשק בין ליאזט גולמי פתרון יודיקסנול. מלאו כל צינור אולטרה-מרכזי במאגר תמוגה עד שהמניסקוס יגיע לבסיס צוואר הצינור, כדי להבטיח שהצינור לא יתמוטט תחת הכוחות הגבוהים מאוד הנוצרים במהלך אולטרהצנטריפוגה. סגור את הצינורות באמצעות מכסים מתאימים.באמצעות סולם דיגיטלי, ודא שלכל שלושת צינורות האולטרה-צנטריפוגה יש משקל זהה. התאמת המשקל לפי הצורך, על ידי הוספת מאגר תזה נוסף על גבי lysate גס. השתמש רוטור טיטניום זווית קבועה כדי צנטריפוגה הצינורות ב 301580 פעמים G ו ב 12 מעלות צלזיוס במשך שעה ו 40 דקות באמצעות תאוצה מקסימלית האטה.לאחר מכן, חבר מחט למזרק חמישה מיליליטר. הסר את המרחב מן הצינורות רוטור, לשחזר את הצינורות לאחר צנטריפוגליזציה. שאף רק את שבר יודיקסנול 40 אחוז המכיל את החלקיקים הווקטוריים.או לעבד את המדגם או לאחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס. כאן, הוכח פרוטוקול שניתן להשתמש בו כדי לייצר וקטורים AAV עם מגוון רחב של capsids, תצורות הגנום, סוגי האמרגנים, מטענים מהומשים. בדוגמה זו, ייצרנו וטיהרנו שני וקטורים שונים של AAV שהביעו את החלבון הפלואורסצנטי הירוק מהגנום העצמי המשלים.שני הווקטורים נבדלים על ידי קפציידים שונים:PHPB ו- AAV9. הם נמסרו, באמצעות הזרקת וריד הזנב, לתוך בוגר C57 שישה עכברים שחורים. כדי להעריך את רמות ביטוי הטרנסג'ין שלושה שבועות לאחר ההזרקה, חלקים מוכתמים בנוגדנים ראשוניים נגד GFP עם זיהוי באמצעות נוגדנים משניים נדונים לצבע פלואורסצנטי.מדידות עוצמת פלואורסצנטיות מראות עלייה משמעותית בביטוי GFP כאשר וקטור PHPB משמש ביחס AAV9. עליות GFP נצפו במוח הקטן, במוח הקטן, ובמוח. האוסף המדויק של הווקטור המכיל שבר חיוני לפרוטוקול זה.במקרה זה לא נעשה כראוי, התשואה הווקטורית, כמו גם את טוהר וקטור מושפעים לרעה. להיות מסוגל לייצר וקטורים AAV, מעבדות קטנות יהיה בעמדה לנצל אפשרויות ניסיוניות רבות כדי לספק גנים במערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה דורש שימוש באולטרהצנטריפוגה וחשוב לקבל הכשרה מתאימה לפני הטיפול בזה כדי למנוע תאונות.יתר על כן, וקטורים AAV מסווגים לעתים קרובות biohazards, ולכן, אתה צריך להתייעץ עם תקנות מקומיות לפני הטיפול וניהול אותם.

production-purification-quality-control-for-adeno-associated-virus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

רקומביננטי adeno הקשורים וירוס (rAAVs) וקטורים נעשים חשובים יותר ויותר...

ייצור Titering של Adeno הקשורים ווקטורים רקומביננטי ויראלי

מוצג פרוטוקול ליצירת וקטורים אדנו-ויראליים בעלי קיבולת גבוהה החסרים את כל רצפי הקידוד הוויראליים. שיבוט של טרנסגנים הכלולים בגנום הווקטור מבוסס על אנדונוקלאזות ביות. הגברת הנגיף בתאי יצרן הגדלים כתאים נצמדים ובתרחיף מסתמכת על וירוס עוזר המספק גנים נגיפיים בטרנס.

ייצור שיבוט וקנה מידה גדולה של וקטורי adenoviral בקיבולת גבוהה המבוססים על סוג Adenovirus האדם 5

כאן אנו מספקים הליך מפורט לייצור בקנה מידה גדול של וקטורים AAV ברמה מחקרית באמצעות תאי HEK 293 דבקים הגדלים בערימות תאים וטיהור כרומטוגרפיה של זיקה. פרוטוקול זה מניב באופן עקבי &gt;1 x 1013 גנומים וקטוריים /mL, ומספק כמויות וקטוריות המתאימות למחקרים גדולים בבעלי חיים.

ייצור וקטורים הקשורים אדנו וירוס בערימות תאים למחקרים פרה קליניים במודלים בעלי חיים גדולים

בפרוטוקול זה, וקטור AAV2 מיוצר על ידי פולחן שותף Spodoptera frugiperda (Sf9) תאים חרקים עם baculovirus (BV)-AAV2-חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או גן טיפולי ותאי Sf9 נגועים BV-AAV2-rep בתרבית השעיה. חלקיקי AAV משתחררים מהתאים באמצעות חומר ניקוי, מובהר, מטוהר על ידי כרומטוגרפיה של עמודת זיקה, ומרוכזים על ידי סינון זרימה משיק.

פיתוח תהליכים לייצור וטיהור של וירוס הקשורים לאדנו (AAV)2 וקטור באמצעות מערכת תרבית תאים של חרקים בקלווירוס

וירוס הקשור באדנו מיוצר בתרבית תאי השעיה ומטוהר על ידי צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות יודיקסנול כפולה. צעדים כלולים כדי להגדיל את התפוקה הכוללת של הנגיף, להקטין את הסיכון של משקעים וירוס, ועוד לרכז את המוצר הסופי של הנגיף. הטיטרים הסופיים הצפויים להגיע ל-1012 חלקיקים נגיפיים / מ"ל ומתאימים לשימוש פרה-קליני in vivo .

תרבית תרחיף ייצור וטיהור של וירוס הקשור לאדנו על ידי צנטריפוגת שיפוע צפיפות יודיקסנול עבור יישומי in vivo

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט ליצירה וטיהור של וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו באמצעות שיטת כרומטוגרפיית זיקה אופטימלית מבוססת הפרין. הוא מציג גישה פשוטה, ניתנת להרחבה וחסכונית, ומבטל את הצורך באולטרה-צנטריפוגה. הווקטורים המתקבלים מפגינים טוהר גבוה ופעילות ביולוגית, מה שמוכיח את ערכם במחקרים פרה-קליניים.

בידוד של וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו באמצעות פרוטוקול כרומטוגרפיית זיקה הפרין חד-שלבי וחצי אוטומטי

ככל שתחום הריפוי הגנטי ממשיך להתפתח, יש צורך הולך וגובר בשיטות חדשניות שיכולות להתמודד עם אתגרים אלה. כאן מוצגת שיטה ייחודית, המייעלת את תהליך יצירת וקטורי AAV בעלי תפוקה גבוהה וטוהר גבוה באמצעות פלטפורמה של מפעל תאים, העומדים בתקני האיכות למחקרי in vivo .

הליך יעיל וסטנדרטי ליצירת וקטורי וירוסים הקשורים באדנו באיכות גבוהה ובאיכות גבוהה תוך שימוש בפלטפורמת מפעל תאים

כימות מדויק של עותקים גנומיים וקטוריים הקשורים לנגיף אדנו (AAV) הוא קריטי, אך פרוטוקול סטנדרטי טרם נקבע. פרוטוקול זה מתאר שיטה מתוקפת להכנת דגימות AAV מטוהרות וביצוע תגובת שרשרת פולימראז טיפתית דיגיטלית (dd_PCR) כדי לכמת באופן אמין את טיטר הגנום הנגיפי.

כימות גנומים נגיפיים הקשורים באדנו בדגימות וקטוריות מטוהרות על ידי תגובת שרשרת של פולימראז טיפתי דיגיטלי

כאן אנו מציגים את הזריקה תוך גולגולתי של וקטורים AAV תיוג הניאון של גליה נוירונים בקליפת המוח הראייתית.

הזרקה תוך גולגולתי של Adeno הקשורים וקטורים ויראליים

בפרוטוקול זה אנו מתארים, ייצור טיהור טיטרציה של וקטורים lentiviral. אנו מספקים דוגמה משלוח וקטור בתיווך lentiviral הגן בנוירונים בתרבית ו האסטרוציטים ראשוניים. השיטות שלנו עשוי לחול גם על סוגי תאים...

הפקה של וקטורים lentiviral עבור תאים Transducing ממערכת העצבים המרכזית

למדו לייצר ולטהר וקטורי AAV בטיטר גבוה ובטוהר מיטבי לשימושים בתאים ובחיות מודל. פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה לטיפול גני ולמחקר ביולוגי מולקולרי.

הפקה, טיהור, ובקרת איכות על Adeno-הקשורים וקטורים מבוסס-וירוס

גלה סרטונים נוספים