Name: בידוד של רקמות עובריים ועל היווצרות האיברים Chimeric שליו-עוף לפי הדוגמה בלוטת התימוס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: למדו שיטה לבידוד רקמות עובריות מעופות לביצוע ניסויים בביטוי גנים ומחקרים פונקציונליים. הטכניקה משמרת את התכונות הביולוגיות ומאפשרת ניתוח תבניות ביטוי גבוה ברזולוציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים על איזבל Alcobia על קריאה ביקורתית של כתב היד, מריו אפונשו הקריינות וידאו וכדי Vitor Proa מן השירות היסטולוגיה של ה-e Histologia דה אינסטיטוטו Biologia לעשות Desenvolvimento, Faculdade דה רפואה de Lisboa. Universidade de Lisboa, לקבלת תמיכה טכנית. אנחנו חבים במיוחד פאולו Caeiro, הוגו סילבה מ Unidade דה audiovisuais (יחידת אורקולי), Faculdade דה רפואה de Lisboa, Universidade de Lisboa על מחויבותם מצטיינים לייצור של וידאו זה. אנו להכיר לייקה מיקרוסיסטמס בחביבות לספק סטריאוסקופ מצויד עם מערכת וידאו, כדי Interaves - שימור אורח אגרו-Pecuária, s. A משתמשינו שליו מופרית ביצים. עבודה זו נתמכה על ידי דה Faculdade רפואה de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).

כל הניסויים בצע טיפול בבעלי חיים והנחיות אתיות של דה Centro Académico דה רפואה Lisboa.
1. מופרית שליו ועוף דגירה
<ol><li>המקום מופרית ביצים של שליו יפני (שליו שליו יפני) בחממה humidified 38 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים. דגירה הביצים (ביצה הקהה) פונה למעלה בחדר של אוויר. הערה: הסביבה humidified מושגת על-ידי הצבת מכולה מים בתחתית של החממה.</li>
	<li>דגירה הביצים של עוף (גאלוס גאלוס) 2.5 ימים בחממה humidified 38 ° C. דגירה הביצים במצב אופקי ולסמן בצד העליון באמצעות פיסת פחם לזהות את מיקומו של העובר. הערה: להתחיל עם ביצי שליו 40 ו- 60 ביצי תרנגולת בעת יצירת ניסוי זה.</li>
</ol>2. בידוד של שליו האנדודרם המכיל את תחום פוטנציאליים תחילתו הרתי
הערה: השתמש תא אופקי למינארי, בכלים סטיריליים וחומרים עבור הביצה מניפולציה שגרות בתנאים סטריליים.
<ol><li>הסר את האזור עובריים המכיל השטח הרב, שעורר של rudiment הרתי, אזור קשת פרינגיאלית המכיל את 3rd ו- 4th קשתות (3/4PAR), כמו שמתואר7,8.<ol>
<li>ממלאים קערה גדולה זכוכית בורוסיליקט (100 מ"מ x 50 מ"מ; 100 ס מ3) 60 מ ל תמיסת מלח קרות באגירה פוספט (PBS).</li>
		<li>בעזרת מספריים מעוגלים, הקש, לחתוך חור עגול במעטפת של שליו ביצה זה יש כבר מתפשט במשך 3 ימים. תרחיב את החור הנגדי של הביצה בוטה ולהעביר את החלמון (עם העובר) לקערה עם PBS קר.</li>
		<li>הסר את העובר החלמון על ידי חיתוך קרום vitelline חיצונית לכלי במיוחד עובריים באמצעות מספריים מעוגלים.</li>
		<li>בעזרת מלקחיים דק, העברה העובר אל קערה קטנה (60 מ"מ x 30 מ"מ; 15 ס מ3) מלא 10 מ"ל של PBS קר.</li>
		<li>עם עוף, להעביר את העובר 100 מ מ צלחת פטרי עם בסיס שחור (ראה טבלה של חומרים) המכיל 10 מ"ל של PBS קר ומניחים אותו תחת stereomicroscope.</li>
		<li>לנתח את 3/4PAR, כפי שתואר לעיל8.</li>
		<li>לשאוב 3/4PAR ואת העברת צלחת זכוכית שלושה רבעים מלא PBS קר באמצעות פיפטה פסטר סטרילי של 2 מ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבודד את האנדודרם המכילה השטח הרב, שעורר של rudiment הרתי (האנדודרם 3/4PP) על-ידי עיכול אנזימטי עם pancreatin.<ol>
<li>בעזרת מלקחיים דק, מרית, העברת 3/4PAR צלחת זכוכית שלושה רבעים מלא pancreatin קר (8 מ"ג/מ"ל; 1:3 דילול של 25 מ"ג/מ"ל עם PBS קר).</li>
		<li>תקופת דגירה של h 1 על הקרח לעיכול אנזימטיות. הערה: הזמן של עיכול אנזימטי תלוי של השלב של פיתוח (טבלה 1).</li>
		<li>מקם את צלחת זכוכית תחת stereomicroscope (40 x-60 x הגדלה) כדי לבודד את האנדודרם מ 3/4PAR. הערה: לשמור על כל המשטחים ופתרונות קר במהלך הליך זה. לשנות פתרון pancreatin קר חדש אם לוקח הרבה זמן לנתח את הרקמות (> 15 דקות). בתור מקור תאורה, להשתמש נוריות ה-LED שילב את stereomicroscope או את סיבים אופטיים, בהתחשב בעומס החום מוגבלת.</li>
		<li>כדי לבודד את האנדודרם מן הרקמות הסובבות, להשתמש microscalpels פלדת אל-חלד שני מחזיקי ה-pin. הערה: השתמש microscalpels בקוטר בין 0.1 מ מ ו- 0.2 מ מ ניקל pin מחזיקי בקוטר פתיחת הלסת של 0 מ"מ עד 1 מ מ.<ol>
<li>תחילה להסיר את שפופרת פגמים בתעלה והמזודרם מחובר המשטח הגבי של האנדודרם לועי.</li>
			<li>עם הצד הגבי למעלה, בזהירות לנתק, להסיר את מזנכימה בין הקשתות לועי ולחשוף את שקיות הקאה. בצע הליך זה משני צידי 3/4PAR.</li>
			<li>הסר את הצינור הלב את מזנכימה סביב השיטה הקדמי.</li>
			<li>עם הצד הבטני למעלה, לחתוך את האאקטודרם של 2nd , קשתות לועי 3rd , הסר בזהירות את מזנכימה המצורפת השיטה. חזור על הליך זה בצד השני של 3/4PAR. בשלב זה תחילתו בלוטת התריס צריכים להיות גלויים.</li>
			<li>הסר את כל התאים mesenchymal שנותרו המצורפת את האנדודרם לועי עם microscalpels שני.</li>
			<li>עושים חתך חציה בין את 2nd 3rd עמודים, בריא את האנדודרם לועי המכיל את 3rd ו- 4 שקיותth מהחלק הקדמי של האנדודרם נתקל תחילתו בלוטת התריס ו 2nd שקית הקאה.</li>
			<li>בעזרת מלקחיים דק, מרית, העברת האנדודרם 3/4PP מבודדים צלחת זכוכית שלושה רבעים מלא 100% קר עוברית שור סרום (FBS).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>שמור את צלחת זכוכית עם הרקמות מבודד על קרח במהלך הכנת assay במבחנה. לחלופין, הרקמות מבודד יכול להישמר three-dimensionally, ניתח באתרו על ביטוי גנים.</li>
</ol>3. בידוד של עוף somatopleura והמזודרם
הערה: בצע ביצה מניפולציה שגרות בתנאים סטריליים באמצעות תא אופקי למינארי, בכלים סטיריליים וחומרים.
<ol><li>הסר את השטח עובריים המכיל את והמזודרם somatopleura ברמה של somites 19-24 (ss19-24).<ol>
<li>הסר את ביצת תרנגולת החממה לאחר 2.5 ימי דגירה.</li>
		<li>עם מספריים מעוגלים, לפתוח חור קטן במעטפת. הוספת מחט, תשאף 2 מ של אלבומין עם מזרק 10 מ"ל להוריד נפח אלבומין בתוך הביצה ולמנוע נזק של העובר (ממוקם מתחת האזור המסומן של המעטפת). למחוק את aspirated אלבומין.</li>
		<li>חתך מעגלי חור (עד שני-שלישים של פני השטח העליונים) באזור המסומן של המעטפת באמצעות מספריים מעוגלים.</li>
		<li>לחתוך את הקרום vitelline מבחוץ כלי extraembryonic תוך החזקת העובר עם מלקחיים דק.</li>
		<li>תחת stereomicroscope, מקום העובר ב- 100 מ מ צלחת פטרי עם בסיס שחור המכילה 10 מ"ל של PBS קר. הערה: השתמש stereomicroscope מנקודה זו ואילך עבור הגדלה הדרגתית של כירורגיים.</li>
		<li>השתמש ארבע סיכות חרק דק כדי להחזיק את העובר בתחתית הצלחת. מניחים את הסיכות על אזור extraembryonic ויוצרים צורת ריבוע.</li>
		<li>לבצע שני חתכים בין somites 19 ו 24 באופן רוחבי לציר העובר. חוצים כל הטריטוריה העובר, באמצעות מספריים העין wecker.</li>
		<li>שחרר, ss19-24, אזור העובר, על-ידי חיתוך קצוות עובריים שולית.</li>
		<li>לשאוב ss19-24 רקמות והעברתן ל צלחת זכוכית שלושה רבעים מלא PBS קר באמצעות פיפטה פסטר סטרילי של 2 מ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבודד את והמזודרם הלטראלי מאזור somatopleura (ss19-24) על ידי עיכול אנזימטי עם pancreatin (8 מ"ג/מ"ל; 1:3 דילול של 25 מ"ג/מ"ל עם PBS קר).<ol>
<li>בעזרת מרית, מלקחיים דק, העברת רקמות ss19-24 לכוס מגישים שלושה רבעים מלא עם פתרון pancreatin קר.</li>
		<li>תקופת דגירה של 30 דקות על הקרח לעיכול אנזימטיות.</li>
		<li>תחת stereomicroscope, לבודד את והמזודרם מן הרקמות הסובבות באמצעות שתי microscalpels של בעל. הערה: לשמור על כל המשטחים ופתרונות קר במהלך הליך זה. לשנות פתרון pancreatin קר חדש אם לוקח הרבה זמן לנתח את הרקמות (> 10 דקות.). בתור מקור תאורה, להשתמש נוריות ה-LED שילב את stereomicroscope או את סיבים אופטיים, בהתחשב בעומס החום מוגבלת.</li>
		<li>במהלך והמזודרם בידוד, הסר תחילה את האאקטודרם על פני השטח ואחריו ניתוק זהיר של רקמות splancnopleura ממוקם ventrally.</li>
		<li>שחרר את והמזודרם הימנית של somatopleura על ידי חיתוך זה בתנועה מקבילה כדי הצינור העצבי.</li>
		<li>חזור על ההפרדה והמזודרם של הצד השמאלי של העובר. הערה: ודא להאט תנועות microscalpel במהלך הליך זה. החלבונים מטריקס במיוחד הסלולר חשוף לדבוק רקמות, מכשירים למניעת תנועות זורמות.</li>
		<li>בעזרת מלקחיים דק, מרית העברת והמזודרם מבודדים צלחת זכוכית שלושה רבעים מלא FBS קר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שמור את צלחת זכוכית עם הרקמות מבודד על קרח במהלך הכנת assay במבחנה.</li>
</ol>4. במבחנה organotypic assay: אגודת heterospecific שליו האנדודרם 3/4PP, והמזודרם somatopleura עוף
<ol><li>להכין את המדיום תרבות RPMI-1640 בינונית בתוספת 10% FBS ו 1%-עט/סטרפ-3,-5.</li>
	<li>מקום רשת מתכת 35 מ מ צלחת פטרי עם 5 מ של תרבות בינוני. הערה: להסיר את עודף של נוזלים עד לרמת השטח בינוני עם החלק העליון של הרשת.</li>
	<li>בעזרת מלקחיים דק, טבלו ממברנה מסנן המדיום תרבות ולאחר מכן מקם אותו בראש הרשת כדי לקבל משטח אחד במגע עם האוויר. הערה: רבע האזור ממברנה (בקוטר 13 מ מ) מספיקה עבור שיוך רקמות.</li>
	<li>תחת stereomicroscope, עמית הרקמות מבודד על המסנן ממברנה. קודם להעביר את האנדודרם 3/4PP (שלב 2) מתוך קערה זכוכית על-ידי הזזה עדין עם העזרה של השתלת כפית (או מרית) ורזה מלקחיים. חזור על הליך זה עבור והמזודרם מבודדים (שלב 3). הערה: עם העזרה של microscalpel, מערבבים את רקמות כדי למקסם את השיוך שלו.</li>
	<li>בזהירות מקום הרקמות המשויך חממה humidified ב 37 ° C עם 5% CO2 בשביל לרקמות בתרבית ה 48 יכול להיות הושתל על גבי קרום chorioallantoic (CAM). הערה: איברים חוץ רחמי-צורה קאם היה בעבר מפורט8.</li>
</ol>

<ol><li>Le Douarin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nogent+Institute--50+years+of+embryology%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Nogent Institute--50 years of embryology.</a> The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).</li>
<li>Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+migration+of+neural+crest+cells+to+the+wall+of+the+digestive+tract+in+avian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">The migration of neural crest cells to the wall of the digestive tract in avian embryo.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 30 (1), 31-48 (1973).</li>
<li>Le Douarin, N. M., Jotereau, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+of+cells+of+the+avian+thymus+through+embryonic+life+in+interspecific+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tracing of cells of the avian thymus through embryonic life in interspecific chimeras.</a> Journal of Experimental Medicine. 142 (1), 17-40 (1975).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li>
<li>Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Bmp4+signalling+in+the+epithelial-mesenchymal+interactions+that+take+place+in+early+thymus+and+parathyroid+development+in+avian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos.</a> Developmental Biology. 361 (2), 208-219 (2012).</li>
<li>Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelio--mesenchymal+interactions+are+critical+for+Quox+7+expression+and+membrane+bone+differentiation+in+the+neural+crest+derived+mandibular+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Epithelio--mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme.</a> Embo Journal. 10 (9), 2387-2393 (1991).</li>
<li>Figueiredo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+and+Hedgehog+in+the+thymus%2Fparathyroid+common+primordium%3A+Crosstalk+in+organ+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation.</a> Developmental Biology. 418 (2), 268-282 (2016).</li>
<li>Figueiredo, M., Neves, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+Approach+to+Explore+Early-and+Late-stages+of+Organ+Formation+in+the+Avian+Model%3A+The+Thymus+and+Parathyroid+Glands+Organogenesis+Paradigm+Video+Link%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualuzed+Experiments%22%5BJournal%5D)">Two-step Approach to Explore Early-and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm Video Link.</a> Journal of Visualuzed Experiments. , (2018).</li>
<li>Nehls, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+genetically+separable+steps+in+the+differentiation+of+thymic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium.</a> Science (New York, N.Y.). 272 (5263), 886-889 (1996).</li>
<li>Morahan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nu+gene+acts+cell-autonomously+and+is+required+for+differentiation+of+thymic+epithelial+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The nu gene acts cell-autonomously and is required for differentiation of thymic epithelial progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5742-5746 (1996).</li>
<li>Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiGeorge+syndrome+phenotype+in+mice+mutant+for+the+T-box+gene%2C+Tbx1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1.</a> Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).</li>
<li>Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Bmp4+from+the+Tbx1+expression+domain+causes+abnormal+pharyngeal+arch+artery+and+cardiac+outflow+tract+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling.</a> Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).</li>
<li>Zou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+of+the+third+pharyngeal+pouch+into+thymus%2Fparathyroid+by+Six+and+Eya1%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1.</a> Developmental Biology. 293 (2), 499-513 (2006).</li>
<li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenetic and Genome Research. 117 (1-4), 231-239 (2007).</li>
<li>Nowak-sliwinska, P., Segura, T., Iruela-arispe, M. L., Angeles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+chorioallantoic+membrane+model+in+biology%2C+medicine+and+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering.</a> Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).</li>
<li>Uematsu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+in+ovo+chorioallantoic+membrane+engraftment+to+culture+testes+from+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Use of in ovo chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice.</a> Comparative Medicine. 64 (4), 264-269 (2014).</li>
<li>Martyn, I., Kanno, T. Y., Ruzo, A., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+a+human+organizer+by+combined+Wnt+and+Nodal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization of a human organizer by combined Wnt and Nodal signaling.</a> Nature. 558 (7708), 132-135 (2018).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

ההליך בידוד מתחלקים מפורט כאן היה חל שיפור טכניקות הקודם כדי לייצר עוברי תרנגולת-שליו chimeric הקשרים ביולוגיים שונים-3,-5,-6.
גישה זו מתאימה לבודד רקמות עובריים טהור ללא צורך מניפולציה גנטית או השימוש של רקמות ספציפיות סמנים, שלעיתים קרובות לא נקבע, להגביל את השימוש במודלים מהונדסים. זה יכול לשמש כדי ללמוד אינטראקציות אפיתל mesenchymal במהלך הפיתוח, עם היכולת לבודד את רקמות טהור להיות הגורם המגביל. ל...

בשנות השבעים המוקדמות, מערכת אלגנטיות תרנגולת-שליו כמירה פותחה על ידי Le Douarin, פתיחת דרכים חדשות כדי להבין את התפקיד של נדידת תאים אינטראקציות סלולרי במהלך פיתוח1,2. המודל הומצאה על ההנחה כי התא החליפין בין שני המינים לא כן משמעותית מופרה, מאוחר יותר מאושרת כאשר חקר תהליכים התפתחותיים רבים, כולל הקמת לחוצה, את hematopoietic מערכות1. לוקחים שהאחרון כדוגמה, הגלים מחזורית של אבות hematopoietic colonizing תחילתו אפיתל הרתי קודם נצפתה באמצעות מערכת כמירה שליו-עוף3. בשביל זה, הטריטוריה פוטנציאליים של בלוטת התימוס, האנדודרם של השיטה השלישית, הרביעית בלוע (3/4PP), היה, enzymatically מבודדים מעוברים שליו (q) בשלב 15 עד 30 - somite [היום עובריים (E) 1.5-E2.5]. שלבים אלה תואמות המבורגר ועוף המילטון4 (HH) - שלבים 12-17. ההליכים בידוד התחיל עם השימוש של טריפסין מביצועם enzymatically את האנדודרם מ מזנכימה המצורפת. האנדודרם מבודד היה הושתל לתוך האזור somatopleura של העובר עוף (c) מארח ב- E3-E3.5 (HH-שלבים 20-21). מזנכימה heterologous זה נחשב "מתירניות" להתפתחות אפיתל הרתי לתרום גם היווצרות האיברים3. לאחר מכן, גלים רצופים של עוף מארח נישא בדם ובתאים הסתננו שליו התורמת הרתי אפיתל המקביל לו לתרום התימוס היווצרות העובר מארח3.
לאחרונה, גירסה שונה של גישה זו גם הוכח להיות חשוב ללמוד אינטראקציות אפיתל mesenchymal במהלך השלבים המוקדמים של היווצרות בלוטת התימוס5. במובן זה, הרקמות המעורבים היווצרות של בלוטת התימוס חוץ רחמי העוברים chimeric3 היו מבודדים, שניהם מעוברים התורם ואת המארח, ומקושרת ex-vivo. פרוטוקול משופרת שימש כדי לבודד את האנדודרם 3/4PP שליו (E2.5-E3) ווהמזודרם somatopleura את העוף (E2.5-E3). בקצרה, רקמות עובריים היו מבודדים על ידי תיאום ובכפוף במבחנה pancreatin עיכול. כמו כן, התנאים של עיכול אנזימטי, טמפרטורה וזמן של דגירה אופטימציה על פי סוג הרקמה שלב התפתחותי (טבלה 1).
בשלב הבא, הרקמות מבודד היו משויך של organotypic במערכת חוץ גופית על 48 שעות, כפי שדווחה בעבר5,6. האגודה במבחנה של רקמות מחקה באינטראקציה תאית מקומי העובר, להתגבר על הגבלות מסוימות של המניפולציה ויוו. מערכת זו היא שימושית במיוחד ללמוד באינטראקציה תאית אירועים morphogenic מורכבים, כגון הפיתוח של מנגנון בלוע.
התרומה של כל רקמות התימוס histogenesis, כמו גם את היכולת של האגודה heterospecific כדי להפיק התימוס יכול להיות עוד יותר בחנו באמצעות מצלמת מתודולוגיה, מפורט בעבר5,7,8. תמציתי, הרקמות בתרבית היו הושתל אל מצלמת cE8 עוברי, מותר לפתח ovo במשך 10 ימים. לאחר מכן, היווצרות בלוטת התימוס הוערך על ידי ניתוח מורפולוגי ב explants שנקטפו. כמו לימודים קלאסיים שליו-עוף3, האפיתל הרתי שליו היה התנחלו מאת hematopoietic ובתאים (HPCs) נגזר מן העובר עוף, אשר הוצגה מאוחר יותר כדי לתרום איברים פיתוח9,10 . HPCs היגרו העובר את בלוטת התימוס chimeric חוץ רחמי דרך מאוד vascularized מצלמת5,7,8. שליו אפיתל הרתי נגזר ניתן לזהות באמצעות אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדנים תלויי מין (קרי, QCPN - MAb שליו PeriNuclear), התגברות על הצורך של סמנים מולקולריים רקמות ספציפיות.
זו השיטה הניסיונית, כמו הגישה שני שלבים דיווחו הפרסום הקודם8, מאפשרת את האפנון של מסלולים האיתות על ידי הממשל הרגיל של סוכנים תרופתי במהלך במבחנה, בפיתוח ovo. כמו כן, ניתן לקצור explants בכל נקודת זמן הקורס של ניסוי8.
לבסוף, הבידוד פרוטוקול מפורט כאן מאפשר השימור של מאפיינים טבעיים 3D-ארכיטקטורה של רקמות עובריים, שימושי במיוחד עבור המפרט את דפוסי ביטוי גנים באתרו של השטחים עובריים אחרת נגיש על ידי שיטות קונבנציונליות. בנוסף, גישות ניתוח transcriptome, כולל ה-RNA-seq או מיקרו-מערכים, ניתן להחיל גם ברקמות מבודדת ללא צורך גנטיים תוך מתן ניתוח "טכנולוגיות" תפוקה גבוהה רקמות ספציפיות.

<table><tbody><tr><td>ביצי עוף מופרות (Gallus gallus)</td><td>Pintobar, פורטוגל</td><td></td><td>חוות עופות&nbsp;</td></tr><tr><td>ביצי שליו מופרות (Coturnix coturnix)</td><td>Interaves, חוות ציפורי פורטוגל</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה PP 15 מ"ל צינורות צנטריפוגה</td><td>PP קורנינג</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות צנטריפוגה</td><td>PP קורנינג</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>60 x 20 מ"מ כלי פיירקס</td><td>קבוצת דוראן</td><td>21 755 41</td><td></td></tr><tr><td>100 x 20 מ"מ כלי פיירקס</td><td>קבוצת דוראן</td><td>21 755 48</td><td></td></tr><tr><td>רשת מתכת</td><td>Goodfellows</td><td></td><td>רשת משובחת&nbsp; רשת נירוסטה</td></tr><tr><td>מסנן ממברנה</td><td>Millipore</td><td>DTTP01300</td><td>0.6 מ"מ פילטר ממברנה איזופור</td></tr><tr><td>צלחת פטרי, 35 x 10 מ"מ</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P5112&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>קערות פיירקס 60X30 מ"מ (גודל קטן)</td><td></td><td></td><td>מהסופרמרקט&nbsp;</td></tr><tr><td>קערות פיירקס 100X50 מ"מ (גודל גדול)</td><td></td><td></td><td>מהסופרמרקט&nbsp;</td></tr><tr><td>העברת פיפטות</td><td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>2041S</td><td>2 מ"ל פלסטיק פיפטה</td></tr><tr><td>זכוכית פסטור</td><td>נורמקס</td><td>5426015</td><td></td></tr><tr><td>סרט</td><td></td><td></td> פלסטיק שקוף <td>מהסופרמרקט&nbsp;</td></tr><tr><td>ציטוקרטין (פאן; חומצי ובסיסי, ציטוקרטינים מסוג I ו-II), שיבוט Lu-5</td><td>BMA Biomedicals</td><td>T-1302</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Standart FBS</td></tr><tr><td>Pancreatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3292</td><td>יש להכין תמיסה של 25 מ"ג/מ"ל לפי הוראות היצרן; צנטריפוגה ולסנן לפני הצעת המחיר ולאחסן בטמפרטורה של -20&C. ניתן לשמור בהקפאה עבור מספר שנים.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td><td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>QCPN נוגדנים</td><td>מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה</td><td>QCPN</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 בינוני, תוסף GlutaMAX&nbsp;</td><td>GIBCO, תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>Bluesil RTV141A/B סיליקון אלסטומר 1.1 ק"ג ערכת</td><td>ELKEM/Silmid</td><td>RH141001KG</td><td>להכנת הבסיס האחורי לצלחת</td></tr><tr><td>פטרי Dumont #5 מלקחיים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30&nbsp;</td><td>מלקחיים דקים</td></tr><tr><td>מספריים בון עדינים במיוחד, מעוקלים</td><td>Fine Science Tools</td><td>14085-08</td><td>מספריים מעוקלים</td></tr><tr><td>סיכות חרקים&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-30</td><td>0.3 מ"מ סיכת נירוסטה</td></tr><tr><td>מיקרו מרית&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10087-12</td><td>כף השתלה</td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>0.2 מ"מ נירוסטה microאזמל</td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>0.1 מ"מ נירוסטה מיקרואזמל</td></tr><tr><td>מוריה מחזיק סיכות מצופה ניקל</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td>מחזיק סיכות מצופה ניקל</td></tr><tr><td>מוריה כף מחוררת</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-17</td><td>רחפן</td></tr><tr><td>Wecker מספריים לעיניים</td><td>Fine Science Tools</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>מיקרוסקופ MC170 HD</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>DM2500</td><td></td></tr><tr><td>ננו-זומר&nbsp; S360 דיגיטל&nbsp; סורק שקופיות&nbsp;</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C13220-01</td><td></td></tr><tr><td>סטריאוסקופ</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>לייקה M80</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של רקמות עובריים ועל היווצרות האיברים chimeric שליו-עוף לפי הדוגמה בלוטת התימוס

Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example

היכולת לבודד את רקמות עובריים היה צעד חיוני להקמת המערכת כמירה שליו-עוף, אשר בתורו סיפקה תרומות ללא עוררין חשיפת תהליכים מרכזיים בביולוגיה התפתחותית.
בזאת הוא תיאר שיטה ממוטבת כדי לבודד עובריים רקמות שליו ותרנגולות למיקרו, עיכול אנזימטי תוך שמירה על המאפיינים הביולוגיים שלו. לאחר בידוד, רקמות בשני המינים קשורים בשום וזמינותו organotypic במבחנה עבור 48 ה שליו, עוף רקמות ניתן שיפלו על ידי נפרדים תכונות גרעיניות סמנים מולקולריים המאפשר חקר הסלולר צולבות לדבר בין האגודה heterospecific של רקמות. גישה זו היא, אפוא, כלי שימושי עבור לימוד אינטראקציות רקמות מורכבות בתהליכים התפתחותיים עם השינויים מרחבי דינמי מאוד, כגון אלה המתרחשים במהלך מורפוגנזה לועי ואת היווצרות במעי הקדמי נגזר האנדודרם איברים. בגישה ניסויית זו פותחה לראשונה כדי לחקור את האינטראקציות אפיתל mesenchymal במהלך השלבים המוקדמים של היווצרות בלוטת התימוס. בחודש זה, נגזר האנדודרם rudiment הרתי פוטנציאליים, נגזר והמזודרם מזנכימה, הם בודדו אותנו מהמתרחש עוברי שליו ועוף, בהתאמה.
הקיבולת של הרקמות הקשורים להפקת איברים יכול להיבדק עוד יותר על ידי הרכבה אותם על גבי קרום chorioallantoic (CAM) של העובר עוף. מצלמת מספק חומרים מזינים ומאפשרת חילופי גז הרקמות explanted. לאחר 10 ימים בפיתוח ovo, ניתן לנתח את האיברים chimeric ב explants שנקטפו על ידי שיטות קונבנציונליות מורפולוגי. הליך זה מאפשר גם לומד רקמות ספציפיות תרומות במהלך היווצרות האיברים, של התפתחותו הראשונית (פיתוח במבחנה) בשלבים האחרונים של organogenesis (בשלבי פיתוח ovo).
לבסוף, שיטת בידוד משופר מספק גם three-dimensionally (3D) לשימור רקמות עובריים, יכול לשמש גם לניתוח הטופוגרפי ברזולוציה גבוהה של דפוסי ביטוי גנים של רקמות ספציפיות.

הפרוטוקול מפרט שיטה לבודד רקמות מתחלקים העופות כדי לשמש מספר גישות טכניות ביולוגיה תאית וההתפתחותי. שיטה זו הועסק בעבר ללמוד אינטראקציות אפיתל mesenchymal במהלך השלבים המוקדמים של היווצרות בלוטת התימוס5. במסמך זה, תוצאות חדשות מוצגות באיור 1 , איור 2, באמצעות גישות דומות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58965/58965fig1....

מאמר זה מספק שיטה לבודד טהור עובריים רקמות מעוברים שליו ועוף שניתן לשלבם לטופס ex-vivo האיברים chimeric.

בידוד של רקמות עובריים ועל היווצרות האיברים Chimeric שליו-עוף לפי הדוגמה בלוטת התימוס

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להציג גישה ניסיונית ממוטבת לבודד רקמות עובריות מהעוברים השלווים והעוף. בעזרת טכניקה זו, אנו משיגים רקמות עובריות טהורות שניתן להשתמש בהן במחקרים על ביטוי גנים ובראיות תפקודיות. רקמות מעוברים שליו ועוף מבודדות על ידי מיקרוכירורגיה וכפופות לעיכול אנזימטי במבחנה תוך שמירה על תכונותיו הביולוגיות.לאחר הבידוד, ניתן להשתמש ברקמות המשומרות התלת מימדיות לניתוח דפוסי ביטוי גנים טופוגרפיים ברזולוציה גבוהה. גישה זו שימושית במיוחד עבור פירוט ביטוי גנים situ בשטחים עובריים אחרת נגיש על ידי שיטות קונבנציונליות. בנוסף, גישות ניתוח transcriptome ניתן ליישם גם ברקמות מבודדות ללא צורך סמנים גנטיים, תוך מתן ניתוח omic תפוקה גבוהה ספציפית לרקמות.לחלופין, הרקמות המבודדות משני המינים יכולות להיות קשורות בהבטחה איברים במבחנה במשך 48 שעות. גישה זו מאפשרת לחקור אינטראקציות רקמות, שכן שליו ותאי עוף יכולים להיות מופלים על ידי תכונות גרעיניות נפרדות סמנים מולקולריים. היכולת של רקמות התרבות כדי ליצור איברים ניתן לבדוק עוד יותר על ידי ovo בדיקה.שיטה זו היא אפוא כלי שימושי לחקר אינטראקציות רקמות מורכבות בתהליכים התפתחותיים עם שינויים ספאתיים דינמיים מאוד והוא יכול גם לעזור לחשוף את הפוטנציאל של שטחים עובריים ספציפיים להיווצרות איברים. כדוגמה, להלן מתואר היווצרות של התימוס כימרי עוף שליו מרקמות עובריות מבודדות. ראשית, endoderm של שקיות הלוע השלישי והרביעי, היסודות התימית הפוטנציאליים מבודדים מאזור הלוע של עוברי שליו עם שלושה ימים של התפתחות.לאחר מכן, רקמה זו קשורה mesenchyme מסוגל לתמוך בהתפתחות שלה, mesoderm somatopleura. לבסוף, הקשר ההטרוסקופי של רקמות הוא מתורבת במבחנה וב ovo כדי ליצור תימוס כימרי. בצע את כל הליכי מניפולציית הביצים בתנאים סטריליים באמצעות מכסה המנוע של זרימה למינארית אופקית ומכשירים וחומרים מעוקרים.ביצי שליו מופרות הודגרו כאשר תא האוויר פונה כלפי מעלה. כדי להתחיל, להסיר את ביצי שליו מהחממה. הכינו קערת זכוכית בורוסיליקט גדולה מלאה ב-PBS קר.עם מספריים מעוגלים, הקש וגזור חור עגול בקליפת ביצת שליו עם שלושה ימים של דגירה. הפוך את החור בצד הנגדי של הביצה קהה, ולהעביר את החלמון לקערה עם PBS קר. הסר את העובר מהחלמון על ידי חיתוך קרום הויטללין חיצונית לכלי חוץ.בעזרת מלקחי דק, מעבירים את העובר לקערה קטנה מלאה ב- PBS קר, ואז מעבירים את העובר לצלחת פטרי עם בסיס שחור עם רחפן. הסר את אזור הלוע המכיל את שקיות הלוע השלישית והרביעית כמתואר ב קשירה קודמת של Jove SPA. לאחר מכן, מעבירים את אזור קשת הלוע השלישי והרביעי לזכוכית המלאה בלבלב קר ודגירה למשך שעה, על קרח, לעיכול אנזימטי.שים לב כי תקופת הדגירה של עיכול אנזימטי תלוי בשלב ההתפתחות. מניחים את צלחת הזכוכית מתחת למיקרוסקופ הסטריאו ומבודדים את האנדרודרמה מאזור קשת הלוע השלישי והרביעי, באמצעות שני מיקרו-אזמל במחזיק. ראשית את אזור הלוע עם הצד הגבי למעלה, מראה באופן פנימי את endoderm ואת ectoderm על פני השטח החיצוניים.שימו לב לאקטודרמה, אנדודרמה, סנצ'ים, צינור לב וחלק גחון של הצינור העצבי. הסר את הצינור העצבי ואת mesoderm מחובר לפני השטח הגביים של endoderm הלוע. שימו לב לאנודרמה של הלוע, לשישי הלוע הרביעי והשלישי, וצינור הלב.כשהצד הגבי למעלה, ניתוק בזהירות והסרה של המזנצ'ים בין קשתות הלוע וחושפים את שקיות הלוע. בצע הליך זה בצד השני של אזור הלוע. הסר את mesenchyme המצורפת לחלק האחורי ביותר של endoderm ולצפות כיס הלוע הרביעי.עם צד אחורי למעלה, להתבונן גם שמאלה וגם ימינה שקיות הלוע הרביעי. המשך על ידי הסרת mesenchyme המצורפת לחלק האחורי ביותר של endoderm ואת הכיס השני. הסר את צינור הלב ואת mesenchyme המקיף את השקיות הפנימיות.עם הצד הגחוני למעלה, להתבונן אנדודורם הלוע, ואת הצד הימני של קשת הלוע השנייה. בשלב זה, endoderm של היסוד של בלוטת התריס צריך להיות גלוי. נתק את האקטודרמה של קשתות הלוע השני והשלישי והסר בזהירות את המיזנצ'ים של הקשתות.שימו לב להסרת המיזנצ'ים של קשת הלוע השנייה בצד ימין. שימו לב למיקום השקיות הרביעית והשלישית ובסיס בלוטת התריס. הסר את השרידים לתאי mesenchymal המחוברים לשקיות הלוע.שימו לב לשקית השלישית והרביעית של הצד הימני ולשקית הרביעית מצד שמאל. חזור על ניתוק mesenchyme של הצד השמאלי. שימו לב עכשיו לשקית השלישית של הצד השמאלי.שימו לב לניתוק המנשים של הקשת השנייה בצד שמאל. שים לב כי כל המשטחים והפתרונות צריכים להישמר קרים במהלך הליך זה. עבור לתתס לבלב קר חדש צלחת במקרה של לוקח הרבה זמן לנתח את הרקמות.לבסוף, לעשות חתך רוחבי בין השקיות הלוע השני והשלישי כדי להסיר את השקיות השני ואת היסודות בלוטת התריס. בנקודה זו, endoderm מבודד מורכב שקיות הלוע השלישי והרביעי ואת הקצה האחורי של הלוע. הסר את השרידים mesenchyme מנותק בעזרת שני מיקרו אזמלים.מעבירים את האנדודרמה המבודדת לצלחת זכוכית מלאה בסרום בקר עוברי קר ולשמור אותה על קרח במהלך הכנת ההקדמה במבחנה. ביצים הונחו במצב אופקי ובפלגן העליון סומנו לשימוש בפחם. כדי להתחיל, להסיר את הביצים מן החממה.עם מספריים מעוגלים, לפתוח חור קטן במעטפת, להכניס מחט, ולזעור שני מיליליטר של אלבומין עם מזרק 10 מיליליטר. פתח חור עגול באזור המסומן של הקליפה וחתוך את קרום הויטליין חיצונית לכלי העובר הנוספים תוך החזקת העובר במטלות דקות. תחת מיקרוסקופ סטריאו, מניחים את העובר בצלחת פטרי עם בסיס שחור המכיל PBS קר.השתמש בארבעה סיכות חרקים כדי להחזיק את העובר לתחתית הצלחת. מניחים את הפינים באזור ההיסטריוני ויוצרים צורה מרובעת. בצע שני חתכים בין somites 19 ו 24 רוחבי לציר העובר לחצות את העובר.שחרר סעיף זה על ידי חיתוך הקצוות העובריים השוליים. שימו לב לצלחת ההיבראלית, הצינור העצבי והשמיץ. שאף והעבר את הרקמות לצלחת זכוכית מלאה בלבלב קר.דגירה במשך 30 דקות על קרח לעיכול אנזימטי. תחת מיקרוסקופ הסטריאו, לבודד את mesoderm מהרקמות שמסביב באמצעות שני מיקרו אזמלים במחזיקים. שימו לב לסומאטופלורה מזודורם, הפלנצ'נופלורה, הצינור העצבי והקטודרמה.ראשית, להסיר את ectoderm על פני השטח. שימו לב לסומטופלורה מסודרם המנותק מהקטודרם. לאחר מכן, נתק בזהירות את הפלנצ'נופלורה הממוקמת באופן ונטרי מהסומטופלורה.שימו לב למוסודרמה בצד ימין של הסמטופלורה. שחרר אותו על ידי חיתוך אותו בתנועה מקבילה לצינור העצבי. שים לב כי כל המשטחים והפתרונות צריכים להישמר קרים במהלך הליך זה.עבור לתתס לבלב קר חדש צלחת במקרה של לוקח הרבה זמן לנתח את הרקמות. שימו לב למסודרמה השמאלית של הסמטופלורה, הסמיטות, הצינור העצבי והקטודרמה. חזור על שחרור mesoderm של הצד הזה.בצע תנועות איטיות עם המיקרו-אזמל. חלבוני המטריצה החוץ-תאית החשופים יושבים דרך רקמות ומכשירים, ומונעים תנועות נוזלים. בזהירות לחתוך את somatopleura בתנועה מקבילה לצינור העצבי.מעבירים את המוסודורם המבודד לצלחת זכוכית מלאה בסרום בקר עוברי קר ולשמור אותו על קרח במהלך הכנת ההתנסויות במבחנה. מניחים סריג מתכת רשת עדין בצלחת פטרי וממלאים במדיום תרבות. הסר את הנוזלים המוגזמים כדי ליישר את המשטח הבינוני עם החלק העליון של המחרט.בעזרת מדפים דקים, טובלים מסנן קרום במדיום התרבות ומציבים אותו בזהירות על גבי המשגר כדי שיהיה משטח במגע איתה. מתחת למיקרוסקופ הסטריאו, מעבירים את האנדרודרמה המבודדת מצלחת הזכוכית למסנן הממברנה על ידי החלקה עדינה בעזרת מרית ומדפים דקים. חזור על הליך זה עבור mesoderm מבודד.בעזרת מיקרו-אזמל, מערבבים את הרקמות כדי למקסם את הקשר שלהן. שים בזהירות את הרקמות הקשורות באינקובטור לח ב 37 מעלות עם 5%CO2 במשך 48 שעות. לאחר תקופת הדגירה, השתל את רקמות התרבות על קרום סוג קוריולאן ולאפשר לו להתפתח אליפסה במשך 10 ימים נוספים כדי להשלים היווצרות איברים כפי שתואר קודם לכן.הנה השיטה הרשתית המאפשרת בידוד של רקמות עובריות עופות לשמש בגישות ניסיוניות נפרדות. כדוגמה, הביטוי של גנים הידועים כמעורבים בהיווצרות שקיות הלוע הוערך גם אנדודרמה מבודדת המכילה את שקיות הלוע השני, השלישי והרביעי מהעוברים של העוף ביום העוברי שלוש וחצי על ידי הר שלם בהכלאה במקום. הביטוי של קיפוד סוניק זוהה ב endoderm של הלוע המרכזי ולא נכלל השקיות, בעוד BMP7 בא לידי ביטוי אנדודרם של שקיות הלוע השני והשלישי ולא נכלל הלוע המרכזי ואת כיס הלוע הרביעי.רקמות מבודדות יכול גם להיות vitro הקשורים במיוחד במבחנה במשך 48 שעות, השתל על קרום סוג קוריולאן, מותר לפתח עוד 10 ימים. Explants ניתן לנתח על ידי היסטולוגיה קונבנציונלית אימונוהיסטוכימיה. כמה תוצאות מייצגות של הקשר של אנדודרמה שליו מן השקיות הלוע השלישי והרביעי עם עוף somatopleura mesoderm הם הבאים-שתלים הראו תימוס כימרית מעוצבת במלואה עם שליו נגזר תאי אפיתל תימי חיובי עבור QCPN ותאי לימפה עוף.בנוסף, אפיתל תיסמי חיובי cytokeratin הראה תכונות מורפולוגיות נורמליות, המציג ארכיטקטורה רשתית טיפוסית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה כיצד לבודד שליו ורקמות עובריות עוף שניתן להשתמש בהם במחקרים ביטוי גנים ועל ידי יצירת איברים כימריים יכול גם לעזור לפענח את המורכבות של גנטיקה איברים.

isolation-embryonic-tissues-formation-quail-chicken-chimeric-organs

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

במאמר זה אנו מציגים שיטה השתלת בתאי גזע האדם לאזורים שונים של מערכת העצבים המרכזית של העובר עוף. זה...

Xenotransplantation בתאי גזע אנושיים לתוך העובר עוף

מאמר זה מתאר השתלת רקמות טכניקה שנועדה לבדוק את איתות ותכונות של דפוסים האאקטודרם משטח cephalic במהלך הפיתוח craniofacial.

הערכת נכסים איתות של Ectodermal epithelia במהלך פיתוח Craniofacial

הגישה לניתוח הגירה גורלו הסופי של העופות לפסגה תאים עצביים שליו, חומוס עוברים chimeric מתואר. שיטה זו היא טכניקה פשוטה וישירה לאיתור תאים עצביים לפסגה במהלך הגירה והבחנה שקשה אחרת להבחין בתוך העובר גוזל unmanipulated.

ניתוח של הגירה קרסט בידול עצבית ועל ידי חוצה מינים להשתלות

מאמר זה מתאר שיטה ליצירת עוברי chimeric שנועדו לבחון את תרומתם מינים ספציפיים של רכס עצבי ו / או רקמות אחרות לפיתוח craniofacial.

הערכת תרומות מינים ספציפיות כדי Craniofacial פיתוח באמצעות מפלצות שליו-ברווז

מאמר זה מספק גישה מעודכן למערכת כמירה שליו-עוף קלאסית ללמוד היווצרות האיברים, על ידי שילוב של הרומן במבחנה , ב ovo בצרות.

גישה דו-שלבית לחקור ו מאוחר-בשלבים המוקדמים של היווצרות האיברים במודל העופות: בלוטת התימוס, בלוטות יותרת התריס Organogenesis הפרדיגמה

כאן, אנו מציגים organotypic culturing פרוטוקול לגדול עוף עובריים באיברים במבחנה. באמצעות שיטה זו, התפתחות עובריים עוף רקמות ניתן יהיה ללמוד, תוך שמירה על רמה גבוהה של שליטה על הסביבה תרבות.

שיטת Organotypic תרבות ללמוד על התפתחות עובריים עוף רקמות

מאמר זה מתאר טכניקת השתלת רקמות שנועדה לבחון את תכונות האיתות והדפוס של המוח הקדמי הבסיסי במהלך התפתחות הגולגולת.

יצירת כימרות במוח הקדמי של העופות להערכת התפתחות הפנים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה פשוטה לבידוד פראדיפוציטים מרקמת שומן בעוברי ברוילר. שיטה זו מאפשרת בידוד עם תפוקה גבוהה, תרבית ראשונית והתמיינות אדיפוגנית של פראדיפוציטים. צביעת O אדום שמן וכתם שומנים/דנ"א מדדו את היכולת האדיפוגנית של תאים מבודדים המושרים עם אמצעי התמיינות.

בידוד של פרדיפוציטים מעוברי אפרוחי ברוילר

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקולים לשלושה סוגים של תרביות צמחי עור עובריים של עופות שניתן להשתמש בהם כדי לבחון אינטראקציות בין רקמות, סרט צילום בהילוך מהיר של הדמיה 4D (3D plus time), הפרעה גלובלית או מקומית של תפקוד מולקולרי ואפיון ביולוגיה של מערכות.

שימוש בעציצים מעור העופות לחקר תבניות רקמות ואורגנוגנזה

טכנולוגיית Microarray מאפשרת מדידה כמותית ופרופיל ביטוי גנים של תעתיקים על בסיס גנומי. לכן, פרוטוקול זה מספק הליך טכני אופטימלי במערך בקר בהתאמה אישית בשני צבעים תוך שימוש בעוברי בקר ביום 7 כדי להדגים את ההיתכנות של שימוש בכמות נמוכה של RNA כולל.

Transcriptome Profiling של In-Vivo עוברי אדם שור הופק באמצעות פלטפורמת microarray שני צבעים

למדו שיטה לבידוד רקמות עובריות מעופות לביצוע ניסויים בביטוי גנים ומחקרים פונקציונליים. הטכניקה משמרת את התכונות הביולוגיות ומאפשרת ניתוח תבניות ביטוי גבוה ברזולוציה.

בידוד של רקמות עובריים ועל היווצרות האיברים Chimeric שליו-עוף לפי הדוגמה בלוטת התימוס

גלה סרטונים נוספים