Name: הערכת תקינות ה-DNA בתאי גזע לטיפול תאי הלב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: למד פרוטוקולים להערכת נזק DNA בתאי גזע מושרים לפני השתלה. שיטות אלו מבטיחות איכות תאים לטיפול רегенרטיבי בקרדיומיופתיה ומחלות ניאונטליות אחרות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת באופן חלקי על ידי הלאומי ללב, ריאות, דם המכון מענקים RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 ו UO1-HL-134764 (כדי ג'יי ג'אנג) ועל -ידי האמריקאי הלב איגוד מדעי מענק פיתוח 17SDG33670677 (ל Kannappan ר).

1. שביט Assay
<ol><li>
ריאגנט הכנה
	<ol>
<li>עבור נקודת ההיתוך הנמוכה agarose, מקום 500 מ"ג agarose התכה נמוכה ב- 100 מ של ה-DNA- / RNA ללא מים. מחממים את הבקבוק בתנור מיקרוגל עד agarose מתמוסס. הניחו את הבקבוק בתוך אמבט מים 37 ° C עד שהוא נדרש. הערה: לקריאה נוספת ראה Azqueta et al., שלמד את ההשפעות של ריכוז agarose על הזמן רגיעה-DNA ו אלקטרופורזה מספר גורמים23.</li>
		<li>לדלל לצבוע דנ א SYBR ירוק במאגר טריס-EDTA (TE) ביחס 1:10,000 כדי לקבל 1 x עובד פתרון מלאי צבע. זה דיי רגישים לאור, אז לאחסן אותו במקום חשוך.</li>
		<li>עבור מאגר פירוק תא, התמוססות 100 מ של פירוק מאגר (2.5 M NaCl, 0.1 M EDTA, 10 מ מ טריס, 1% טריטון X-100) במים יונים (DI H2O). לאחר מכן, להוסיף 10 NaOH M כדי להתאים את ה-pH עד 10.0. מגניב המאגר כדי 4 ° C.</li>
		<li>עבור מאגר אלקליין פועל הדנ א-רגיעה/אלקטרופורזה, להמיס 1 ליטר של פתרון אלקליין (0.3 M NaOH, 1 מ"מ EDTA) DI H2O. מגניב המאגר כדי 4 ° C. ודא כי ה-pH > 13.</li>
		<li>עבור שקופיות precoated שביט, מניחים כמה טיפות agarose 0.5% על זכוכית. באופן מיידי, באמצעות משטח שטוח של שקופית אחרת, להפיץ את agarose כדי ליצור שכבה דקה של ציפוי agarose. הערה: יבש את השקופיות לפני השימוש.</li>
		<li>עבור כתובות ה-Ip תרבית תאים, בקצרה תאי iPS תרבות המרתף-ממברנה-מטריקס-מצופה (ראה טבלה של חומרים) תרבות צלחות mTESR1 תרבות בינוני עד confluency. הערה: תאי iPS האדם-הלב-פיברובלסט-נגזר שימשו פרוטוקול זה. התכנות iPS תא נגזרת ותנאי תרבות מתואר במאמרים אחרונים שלנו מחקר קבוצה12,13,21.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת הדוגמא
	<ol>
<li>ביטול המדיום תרבות ולשטוף את התאים. מביצועם התאים באמצעות ניתוק פתרון (ראה טבלה של חומרים). רוחצים בגדר תא בתמיסת באגירה פוספט (PBS) את resuspend את התאים ב- PBS בעונה 1 פרק 105 תאים/מ ל....</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת הדוגמא שקופיות הערה: בצע את השלבים הבאים בתנאים תאורה כדי למנוע נזק לתאים על-סגול-אור-induced.<ol>
<li>מיקס 10 μL של הבולם תא, μL 90 agarose פתרון (1:10 יחס) בצינור. מניחים את הצינורית בתוך אמבט מים 37 ° C כדי למנוע את agarose שהשרף מתהווה.</li>
		<li>לערבב את הפתרונות ללא היכרות עם בועות אוויר, פיפטה 70 μL במקום על גבי השקופית שביט precoated. באמצעות טיפ פיפטה, ומשטחים את התערובת agarose תא כדי ליצור שכבה דקה. מקם את השקופית 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.</li>
		<li>במיכל, לגמרי להטביע את השקופית במאגר פירוק קר. הכנס את המיכל בחושך ב 4 ° C עבור 1 h.</li>
		<li>החלף את המאגר פירוק פתרון אלקליין קר. ודא שהשקופיות לחלוטין טובע. הכנס את המיכל בחושך ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
אלקטרופורזה
	<ol>
<li>מקם את השקופית במיכל אלקטרופורזה אופקית. למלא את המיכל מאגר אלקטרופורזה אלקליין קר עד השקופיות לחלוטין טובע. החל מתח ב 1 V ס למשך 15 עד 30 דקות. הערה: סה כ מתח = המרחק בין האלקטרודות x 1 V</li>
		<li>במיכל, לגמרי להטביע את השקופית קר DI H2O. לאחר 2 דקות, להסיר את DI H2O ולהוסיף טריים DI H2O. חזור על שלב זה.</li>
		<li>החלף את DI H2O אתנול 70% קר. המתן 5 דק בעדינות להסיר את השקופית, לא להטות את זה, ולתת לזה מילה נהדרת...</li>
		<li>ברגע מיובש, להוסיף 100 μL של צבע מדולל DNA בכל מקום. לחכות 15 דקות בטמפרטורת החדר. באמצעות מסנן FITC במיקרוסקופ epifluorescence, לקחת תמונות של 50 עד 100 שביטים סה עבור דגימה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ניתוח תמונות וחישוב של תוצאות
	<ol>
<li>עבור ניקוד השביטים, השתמש מכוני הבריאות הלאומיים של (NIH) ImageJ עם תוסף assay שביט (להוריד ImageJ כאן: https://imagej.nih.gov/ij/download.html; להוריד את התוסף כאן: https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/). הערה: התוסף מגיע עם הוראה PDF אשר מכיל את כל הפרטים כדי לבצע את הניתוח. בנוסף, מוצגים צילומי מסך של ניתוח שביט איור 2A-C. שביט נציג תמונות של שליטה דוקסורוביצין (Doxo)-תאי iPS שטופלו כימות של השביטים מוצגים באיור 3 א -ג'.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. DNA נזק תגובה
<ol><li>לדוגמה, ריאגנט הכנה
	<ol>
<li>על תרבות תאי iPS-ס"מ, תרבות שב ס ס מ תאים בתוך מרתף-ממברנה-מטריקס-מצופה (ראה טבלה של חומרים) תרבות צלחות בינוני RPMI בתוספת B-27 (CMM) עד confluency. הערה: האדם-iPS-תא-נגזר cardiomyocytes שימשו פרוטוקול זה. הפרוטוקול עבור שב"ס תאית התמיינות לתוך cardiomyocytes ניתן למצוא במאמרים האחרונים שלנו מחקר קבוצה12,13,21.</li>
		<li>זרע iPS-CMs בשקופיות קאמרית.<ol>
<li>למחוק את המדיום תרבות מן הבארות iPS-ס"מ. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS.</li>
			<li>להוסיף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין לכל טוב, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דק סימון הלוח תחת מיקרוסקופ על ניתוק התא. להוסיף 1 מ"ל של CMM לעצור את טריפסין.</li>
			<li>למקם את תא השעיה שפופרת 15 מ"ל צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 4 ° C ו- x 200 גרם. למחוק את המדיום, להוסיף 1 מ"ל של CMM, resuspend את התאים. לספור את התאים ולהתאים את ספירת התאים כדי להשיג 20 x 105 תאים מ 1.6 ל CMM.</li>
			<li>זרעי µL 200 של השעיה תא לכל טוב של תא 8-ובכן שקופית (ראה טבלה של חומרים). הקש על השקופית בעדינות כדי להפיץ את התאים סביב הבאר, דגירה ב 37 º C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לטיפול דוקסורוביצין iPS-ס"מ, למחוק את המדיום תרבות מן הבארות iPS-ס"מ. לשטוף את התאים עם PBS. לטיפול תאי עם דוקסורוביצין μM 1, CMM עבור 4 h תשאף המדיום ולשטוף את התאים עם PBS.</li>
		<li>עבור מאגר חסימה, להכין 10 מ"ל של אלבומין שור (BSA) לאודנום BSA 3% ל- 0.05% טריטון X-100. כדי להכין 10 מ"ל של מאגר חסימה, להוסיף 1 מ"ל של החמור נורמלית בסרום 9 מ של פתרון BSA מוכן.</li>
		<li>הפתרון נוגדן ראשוני, הוסיפו 1 μL של אנטי-הארנב פוספו-היסטון H2A. X (Ser139) נוגדן ל 200 μL מאגר חסימה.</li>
		<li>עבור מיקס נוגדנים משניים, להוסיף 1 μL כל אחד של ארנב אנטי fluorochrome מצומדת משני נוגדן, דאפי phalloidin מצומדת fluorochrome μL 200 מאגר חסימה.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunolabeling
	<ol>
<li>לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS ולהוסיף 200 μL של 4% טריות paraformaldehyde (PFA) כל טוב. לתקן את התאים עבור 20 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים עם PBS.</li>
		<li>להסיר את PBS ולהוסיף 200 μL מאגר חסימה לכל טוב, בלוק למשך 30 דקות בחדר humidified בטמפרטורת החדר. להסיר את המאגר חסימה ולהוסיף 200 μL של נוגדן ראשוני פתרון. תקופת דגירה של 45 דקות בחדר חשוך, humidified בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף הבארות שלוש פעמים עם PBS.</li>
		<li>להסיר את PBS ולהוסיף 200 μL של נוגדנים משניים מיקס. תקופת דגירה של 45 דקות בחדר חשוך, humidified בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף הבארות שלוש פעמים עם PBS. לשטוף עם DI H2O לפני הרכבה אותם עם antifade. מקום coverglass ולאחסן את השקופיות בחושך ב 4 º C.</li>
		<li>שימוש במיקרוסקופ epifluorescence, לקחת חמש תמונות של שדות אקראי לכל לדוגמה, כפי שמוצג באיור 4A, והמשך ניתוח תמונות.</li>
	</ol></li>
	<li>ספירת מוקדים DDR
	<ol>
<li>הורד והתקן CellProfiler24 (http://cellprofiler.org).</li>
		<li>
הערה: עיבוד במחקר זה תמונה בוצעה באמצעות CellProfiler גירסה 2.1.1. הדרכות CellProfiler ששימשו ניתן למצוא במקום אחר (https://www.youtube.com/watch?v=PvhRL9xpduk & רשימת = PL7CC87670239B4D10). אם גירסה חדשה יותר של CellProfiler נמצא בשימוש, הצינור עשוי לדרוש עיבודים קלים.</li>
		<li>הורד את צינור punctae_gH2AX.cpipe. בחר קובץ > ייבוא > צינור מקובץ ובחר punctae_gH2AX.cpipe.</li>
		<li>גרור-ושחרר התיקייה המכילה את תמונות נרכשות של מוקדים γH2A.X אל חלון רשימת קבצים במדור מודולי קלט/תמונות לניתוח (איור 5A). לאחר מכן, בצע את ההוראות כפי שמוצג באיור 5A-L.</li>
		<li>להגדיר את הפרמטרים הבאים לתמונות:<ol>
<li>גרור את התמונה הרצויה עבור ניתוח רשימת הקבצים. תחת מודולי קלט, בחר תמונות (ראה איור 5A עבור מודול הגדרות). מודולי קלט, בחר מטא-נתונים (ראה איור 5B עבור מודול הגדרות). מודולי קלט, בחר NamesAndTypes (ראה איור 5C עבור מודול הגדרות).</li>
			<li>עבור קבוצות, בחר לא. ניתוח מודולים, בחר ColorToGray (ראה איור 5D עבור מודול הגדרות).</li>
		</ol>
</li>
		<li>ניתוח מודולים, בחר חלקה (ראה איור 5E עבור מודול הגדרות). הערה: ערך זה ייתכן שתצטרך להיות ממוטבים, בהתאם רזולוציית התמונה.</li>
		<li>ניתוח מודולים, בחר IdentifyPrimaryObjects (ראה איור 5F עבור מודול הגדרות). הערה: מיטוב ערכים אלה כדי לוודא שהגרעין כולו נבחרה. לאחר שלב זה, המחשב עלול לפגר.</li>
		<li>ניתוח מודולים, בחר חלקה (ראה איור 5G עבור מודול הגדרות). הערה: ערך זה ייתכן שתצטרך להיות ממוטבים, בהתאם רזולוציית התמונה.</li>
		<li>ניתוח מודולים, בחר EnhanceOrSuppressFeatures (ראה איור 5 H עבור מודול הגדרות).</li>
		<li>ניתוח מודולים, בחר IdentifyPrimaryObjects (ראה איור 5I עבור מודול הגדרות). הערה: למטב את הערכים האלה כדי לוודא punctae נבחרו. לאחר שלב זה, המחשב עשוי בעומר שוב.<ol>
<li>ניתוח מודולים, בחר RelateObjects (ראה איור 5J עבור מודול הגדרות). ניתוח מודולים, בחר ClassifyObjects (ראה איור 5 K עבור מודול הגדרות). ניתוח מודולים, בחר ExportToSpreadsheet (ראה איור 5 L עבור מודול הגדרות).</li>
			<li>לחץ על תמונות לנתח בלוח השמאלי התחתון כדי לבצע ניתוח תמונות. לאחר סיום מוצלח של הניתוח, נוצרות מספר תמונות (איור 6A-F). הערה: המשתמשים צריכים לשמור תמונות אלה לשימוש עתידי.</li>
			<li>הערה את הקובץ. csv המכיל את הנתונים הכמותיים לצורך ניתוח נוסף שנוצר ושמרת במיקום המתאים במחשב. בגיליון האלקטרוני הנקרא MyExpt_Image, בעמודות B ו- D יהיו מספר גרעינים זה להכיל עד חמישה ויותר punctae, בהתאמה. להוסיף עמודות B ו- D כדי לקבל את המספר הכולל של גרעין האטום.</li>
		</ol>
</li>
		<li>חזור על שלב 2.3.3 - 2.3.8 לכל התמונות (לשנות את שם הקובץ MyExpt_ לפני כל ניתוח). חלקות יכולה להיעשות לשם הערכת שלמות הדנ א, כפי שמוצג באיור 4C.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+%28SCIPIO%29%3A+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li>
<li>Makkar, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+%28CADUCEUS%29%3A+a+prospective%2C+randomised+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li>
<li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+neural+crest+cells+contribute+to+the+dormant+multipotent+stem+cell+in+the+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiac neural crest cells contribute to the dormant multipotent stem cell in the mammalian heart.</a> Journal of Cell Biology. 170 (7), 1135-1146 (2005).</li>
<li>Oyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+side+population+cells+have+a+potential+to+migrate+and+differentiate+into+cardiomyocytes+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiac side population cells have a potential to migrate and differentiate into cardiomyocytes in vitro and in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 176 (3), 329-341 (2007).</li>
<li>Fischer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+myocardial+regeneration+through+genetic+engineering+of+cardiac+progenitor+cells+expressing+Pim-1+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of cardiac progenitor cells expressing Pim-1 kinase.</a> Circulation. 120 (21), 2077-2087 (2009).</li>
<li>Cottage, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+progenitor+cell+cycling+stimulated+by+pim-1+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1 kinase.</a> Circulation Research. 106 (5), 891-901 (2010).</li>
<li>Angert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+the+injured+adult+heart+involves+new+myocytes+potentially+derived+from+resident+cardiac+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells.</a> Circulation Research. 108 (10), 1226-1237 (2011).</li>
<li>Kannappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Modulates+the+Fate+of+Cardiac+Progenitor+Cells+Ex+vivo+and+in+the+Diabetic+Heart+In+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">p53 Modulates the Fate of Cardiac Progenitor Cells Ex vivo and in the Diabetic Heart In vivo.</a> EBioMedicine. 16, 224-237 (2017).</li>
<li>Hatzistergos, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+stimulate+cardiac+stem+cell+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Bone marrow mesenchymal stem cells stimulate cardiac stem cell proliferation and differentiation.</a> Circulation Research. 107 (7), 913-922 (2010).</li>
<li>Okita, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1575), 2198-2207 (2011).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+high+engraftment+of+patient-specific+cardiomyocyte+sheet+using+induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+adult+cardiac+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Heart+Failure%22%5BJournal%5D)">Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast.</a> Circulation: Heart Failure. 8 (1), 156-166 (2015).</li>
<li>Hirakawa, K., Midorikawa, K., Oikawa, S., Kawanishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinogenic+semicarbazide+induces+sequence-specific+DNA+damage+through+the+generation+of+reactive+oxygen+species+and+the+derived+organic+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Carcinogenic semicarbazide induces sequence-specific DNA damage through the generation of reactive oxygen species and the derived organic radicals.</a> Mutation Research. 536 (1-2), 91-101 (2003).</li>
<li>Martinez, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+and+alkylating+damage+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Oxidative and alkylating damage in DNA.</a> Mutation Research. 544 (2-3), 115-127 (2003).</li>
<li>Valko, M., Rhodes, C. J., Moncol, J., Izakovic, M., Mazur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals%2C+metals+and+antioxidants+in+oxidative+stress-induced+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-Biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer.</a> Chemico-Biological Interactions. 160 (1), 1-40 (2006).</li>
<li>Wiseman, H., Halliwell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+to+DNA+by+reactive+oxygen+and+nitrogen+species%3A+role+in+inflammatory+disease+and+progression+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer.</a> Biochemical Journal. 313 (Pt 1), 17-29 (1996).</li>
<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
<li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Goichberg, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+defects+in+EphA2+signaling+impair+the+migration+of+human+cardiac+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Age-associated defects in EphA2 signaling impair the migration of human cardiac progenitor cells.</a> Circulation. 128 (20), 2211-2223 (2013).</li>
<li>Kannappan, R., Mattapally, S., Wagle, P. A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transactivation+domain+of+p53+regulates+DNA+repair+and+integrity+in+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transactivation domain of p53 regulates DNA repair and integrity in human iPS cells.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. , (2018).</li>
<li>Al-Baker, E. A., Oshin, M., Hutchison, C. J., Kill, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+UV-induced+damage+and+repair+in+young+and+senescent+human+dermal+fibroblasts+using+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of UV-induced damage and repair in young and senescent human dermal fibroblasts using the comet assay.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (6-7), 664-672 (2005).</li>
<li>Azqueta, A., Gutzkow, K. B., Brunborg, G., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+more+reliable+comet+assay%3A+optimising+agarose+concentration%2C+unwinding+time+and+electrophoresis+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions.</a> Mutation Research. 724 (1-2), 41-45 (2011).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), R100(2006).</li>
<li>Paradis, A. N., Gay, M. S., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binucleation+of+cardiomyocytes%3A+the+transition+from+a+proliferative+to+a+terminally+differentiated+state%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Binucleation of cardiomyocytes: the transition from a proliferative to a terminally differentiated state.</a> Drug Discovery Today. 19 (5), 602-609 (2014).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

שלמות הדנ א מציגה שלמות התא. תאים עם דנ"א פגום הם לעתים קרובות בלחץ, בסופו של דבר מאבד את היושר שלהם. השלמות של גזע, תאי גזע-תא-נגזר להיות מופצים לצורך השתלת הוא עיקרי עבור התאים לביצוע תפקידם הרצוי. משתילים תאים עם דנ"א פגום יגרום קצב engraftment המסכן ובביצועים של8,תא20. לפיכך, בחינת שלמות הדנ א לפני השתלת תא הוא פרוטוקול בקרת איכות הכרחי. כאן אנו מתארים שתי גישות חסכונית, כלומר כוכב השביט assay, γH2A.X immunofluorescence תיוג, כדי להעריך את נזק לדנ א ואיכות גז...

הוכחה ניסויית וקלינית מדגים כי השתלת תא בינוני עשוי לשפר את ביצועי כויץ של החדר השמאלי של כשל לבבות1,2,3,4,5 ,6,7,8,9. ההתקדמות האחרונה נפתחו עוד יותר מושך הזדמנויות עבור התחדשות לב וכלי דם; אלה כוללים את הביטוי כפויה של גורמים התיכנות בתאים סומטיים כדי לגרום pluripotency, להבדיל אלה בתאי גזע pluripotent מושרה (iPSC) לתוך הלב שושלות שונות, חשוב cardiomyocyte (ס מ)10, 11 , 12 , 13. החומר התורשתי בכל תא, כולל iPSCs שנוצר באופן מלאכותי, נגזר iPSC ס"מ (iPS-ס"מ), הוא ה-DNA. ההוראות הגנטי האצור ב- DNA מכתיב את הצמיחה, ופיתוח פונקציה של תאים, רקמות, איברים אורגניזמים. הדנ א אינה אינרטי; תא מטבוליטים, כגון חמצן תגובתי, קרבוניל חנקן מינים, ונזק קטלניים יכול לגרום DNA במבחנה, ויוו14,15,16,17. חשוב לציין, נזק לדנ א מתרחשת באופן אינטואיטיבי בכל תא, עם תדירות משמעותית. אם נזקים אלה לא מתוקנות, זה יוביל מוטציית דנ א, הזדקנות ביולוגית הסלולר, האובדן של ה-DNA של תאים שלמות, ואולי, מחלות, כולל סרטן סכנת חיים. לכן, שמירה על שלמות הדנ א הוא חיוני תא כלשהו, במיוחד iPSCs, בעל פוטנציאל עצום במרפאה.
להערכת את הכמות ואת היושרה של דנ א גנומי מבודד, ציוד יקר זמין על השוק. עם זאת, קיימות שיטות לא פשוטים וחסכוניים כדי להעריך את תקינות ה-DNA בתאים ללא בידוד התאים. יתר על כן, המשתמש-induced השפלה DNA במהלך בידוד ה-DNA הוא אחד החסרונות הגדולים בעוד בשיטות אלה. תא בודד ג'ל אלקטרופורזה (המכונה שביט assay)18,19 , γH2A.X immunolabeling8 הטכניקות הן גישות יסוד במעבדות מחקר להערכת נזק לדנ א. שתי שיטות אלו אינם דורשים ציוד יקר או מבודד הדנ א כדי לנתח DNA שלמות8,20,21. . מאז, טכניקות אלה בוצעו עם תאים שלמים; משתמש-induced השפלה DNA/RNA/חלבון במהלך הכנת המדגם לא ישפיעו על פרוטוקולים אלה. . כאן, כדי להעריך נזק לדנ א של DNA נזק תגובת גזע ותאי גזע-תא-נגזר, אנו מספקים פרוטוקולים שלב אחר שלב כדי לבצע שני את כוכב השביט assay, γH2A.X immunolabeling. יתר על כן, שילוב שתי הגישות האלה, אנו מציעים הערכה תמים יכול לשמש כדי להעריך את התאמתם של התא השתלת.
כוכב השביט assay, או תא בודד ג'ל אלקטרופורזה, מודד את מעברי DNA בתאים. תאים בתוך התכה נמוכה agarose הם lysed כדי nucleoids טופס המכיל supercoiled DNA. על אלקטרופורזה, חתיכות קטנות של DNA מפוצלים ו גדילי DNA שבור נודדים דרך הנקבוביות agarose, ואילו ה-DNA ללא פגע, בשל גודלם העצום שלהם ההטיה עם החלבון מטריקס, תהיה העברה מוגבלת. תבנית ה-DNA מוכתם תחת מיקרוסקופ פלורסצנטיות מחקה כוכב שביט. בראש שביט מכיל דנ א ללא פגע, הזנב הוא מורכב שברים ושבר גדילי ה-DNA. השבר של נזק לדנ א נמדד על ידי קרינה פלואורסצנטית האינטנסיביות של הדנ א פגום (זנב השביט) יחסית העוצמה (ראש שביט) ה-DNA ללא פגע. לרגע הפרמטר הזנב ניתן לחשב כמוצג באיור1.
נזק לדנ א גורם זירחון של היסטון H2A. X (γH2A.X) בשעה Ser139 על-ידי kinases כספומט, ATR ו- DNA-PK. זרחון והגיוס של H2A. X-מעברי גדיל DNA נקרא DNA נזק התגובה (DDR) והוא קורה במהירות לאחר הדנ א פגום. בעקבות תהליך זה, בתיווך מחסום מחזור התא מעצר DNA מבוצעים תהליכים לתיקון. לאחר סיום מוצלח של תיקון ה-DNA, γH2A.X dephosphorylated, מומת על ידי phosphatases. ממושך, מספר מעברי גדיל DNA לגרום להצטברות של γH2A.X מוקדים ב- DNA. הדבר מעיד על חוסר היכולת של התא כדי לתקן את הנזק DNA ואובדן של שלמות הדנ א. מוקדים אלה γH2A.X בדנ א יכול להיות מזוהה על ידי, מספר מוקדים DDR ניתן לספור באמצעות הפרוטוקול בסעיף 2.

<table><tbody><tr><td>0.25% טריפסין</td><td>קורנינג</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>שקופית תא 8 בארות</td><td>Millicell</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7920</td><td>תמיסת ניתוק תאים</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure חמור נגד ארנב IgG</td><td>Jackson Immuno מעבדות מחקר</td><td>711-545-152 (RRID: AB_2313584)</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson Immuno מעבדות מחקר</td><td>711-165-152 (RRID:AB_2307443)</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>תוסף Gibco B-27, ללא סרום,</td> <td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה מטריג'ל מופחת</td><td>קורנינג</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>PhalloidinA488</td><td>Life Technology</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>פוספו-היסטון H2A. X (Ser139)</td><td>טכנולוגיית איתות תאי</td> נוגדנים <td>2577 (RRID: AB_2118010)</td><td></td></tr> <tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&nbsp; צבע ג'ל חומצת גרעין ירוק I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9430</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure נקודת התכה נמוכה Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Antifade</td></tr></tbody></table>

הערכת תקינות ה-dna בתאי גזע לטיפול תאי הלב

Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

גזע ותאי גזע-תא-derived יש פוטנציאל עצום כטיפול משובי למחלות ניווניות שונות. DNA למחסן של נתונים גנטיים בתאים כל, לרבות תאי גזע, והיא ושלמותה הוא היסוד הרגנרציה שלו. תאי גזע עוברים התפשטות מהירה במעבדות כדי להשיג את המספרים הדרושים עבור השתלת. גדילת התאים מואצת מוביל אובדן שלמות הדנ א על ידי מטבוליטים שהצטברו, כגון חמצן תגובתי, קרבוניל קטלניים. משתילים תאים אלה היו מסתיימים engraftment המסכן והתחדשות של האיבר המידרדר. יתר על כן, משתילים הפניות תאים פגומים-DNA מוטציות, יציבות של ה-DNA, הזדקנות ביולוגית הסלולר, כנראה, סכנת מחלות כמו סרטן. לכן, יש צורך מיידי שיטה בקרת איכות להעריך את התאמתם של התא השתלת. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים צעד אחר צעד ההערכה של שלמות הדנ א של תאי גזע לפני השתלת תא.

תאי גזע pluripotent המושרה האנושי היו תרבותי, לנזק לדנ א ו ברגע הזנב, אשר שימשו כאמצעי של שלמות הדנ א, נותחו על ידי שביט וזמינותו. תאי iPS היו בתוך נקודת ההיתוך הנמוכה agarose והניח על משטח זכוכית. התאים, לאחר מכן, טופלו באמצעות מאגר פירוק, ואחריו פתרון אלקליין, להשיג supercoiled DNA. Nucleoids היו electrophoresed, שביטים היו דמיינו ידי לצבוע דנ א (איור 1 א'-D). השביטים, ואז, נותחו עם ImageJ, באמצעות התוסף assay שביט (איו...

כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של התקנה ניסיונית עבור ניתוח של ההערכה של שלמות ה-DNA בתאי גזע לפני השתלת תא.

הערכת תקינות ה-DNA בתאי גזע לטיפול תאי הלב

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

עבור מחלות יילודים כגון קרדיומיופתיה, טיפול רגנרטיבי באמצעות תאים המושרים תאי גזע pluripotent נגזר יש פוטנציאל עצום. עם זאת, צמיחת תאים מואצת במבחנה מובילה לנזק DNA על ידי מטבוליטים מצטברים כגון מיני חמצן תגובתי. השתלת תאים אלה פגועי DNA יגרום תחריט לקוי והתחדשות של האיבר.לפני ההשתלה, יש להעריך את איכות התאים. כאן אנו מספקים שני פרוטוקולים שלב אחר שלב כדי להעריך את נזקי הדנ"א בתאי גזע. הפגנת ההליכים תהיה ג'סיקה מילר, חוקרת, ניקיל מרדהקאר, חוקרת, ווסנטי רג'יסקאראן, טכנאי מעבדה.כדי להתחיל, למקם 500 מיליגרם של אגוארו נמס נמוך ב 100 מיליליטר של מים נטולי DNA-RNA. מחממים את הבקבוק במיקרוגל עד שהתעוררות מתמוססת. לאחר מכן, מניחים את הבקבוק באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עד הצורך.להכנת מגלשות שביט מצופות מראש, מניחים כמה טיפות של 0.5% על מגלשת זכוכית. מיד להפיץ את ההתעוררות כדי ליצור שכבה דקה של ציפוי אגרוז באמצעות כיסוי. עובדים בתנאי תאורה נמוכה כדי למנוע נזק לתאים אולטרה סגולים הנגרמים על ידי אור, מערבבים 10 מיקרוליטרים של מתלי תאים ו-90 מיקרוליטרים של תווי אגרוז בצינור.מניחים את הצינור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס כדי למנוע מהאגוז להתגבש. מערבבים את הפתרון מבלי להכניס בועות אוויר, ו pipette 70 microliters לכל נקודה על מגלשת שביט מצופה מראש. בעזרת קצה פיפטה, מורחים את תערובת התאים ויוצרים שכבה דקה.מניחים את השקופית בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. בגורם מכיל, שקוע לחלוטין את השקופית במאגר ת ליסיס קר. מניחים את המיכל בחושך בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה.החלף את מאגר התיזה בתתבר אלקליין קר. ודא שהשקופיות שקועות לחלוטין. לאחר השארת המיכל בחושך בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות נוספות, מניחים את השקופית במיכל אלקטרופורזה אופקי.מלאו את המיכל במאגר אלקטרופורזה אלקליין קר עד שהשקופיות יהיה שקוע לחלוטין. יש למרוח מתח בסנטימטר אחד במשך 15 עד 30 דקות. במיכל, שקוע לחלוטין את המגלשה במים קרים deionized.לאחר שתי דקות, להסיר את המים deionized ולהוסיף מים deionized טריים, ולאחר מכן לחזור על צעד זה בפעם השנייה. לאחר מכן, החלף את המים deionized עם קר 70%אתנול. לאחר חמש דקות, להסיר בעדינות את השקופית מבלי להטות אותו ולתת לו אוויר יבש.לאחר התייבשות, להוסיף 100 microliters של צבע DNA מדולל לכל נקודה, ולחכות 15 דקות בטמפרטורת החדר. באמצעות מסנן FITC במיקרוסקופ epifluorescence, לצלם תמונות של 50 עד 100 שביט בסך הכל לכל מדגם. תרבות iPS נגזר קרדיומיוציטים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.כדי לראות את הקרדיומיוציטים שמקורם ב- iPS בשקופיות קאמריות, השלך תחילה את מדיום התרבות מה בארות, ושטף את התאים שלוש פעמים עם PBS. מוסיפים מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין ל באר, ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. בדוק את הצלחת תחת מיקרוסקופ לניתוק תאים.לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של CMM כדי לעצור את טריפסין. מניחים את ההשעיה התא בצינור 15 מיליליטר וצנטריפוגה במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ו 200 פעמים g. השלך את המדיום, הוסף מיליליטר אחד של CMM ולחץ מחדש על התאים.ספור את התאים והתאם את ספירת התאים כדי להשיג שני מיליון תאים ב- 1.6 מיליליטר של CMM. עכשיו זרע 200 microliters של השעיית תא ל הבאר של שקופית תא שמונה בארות. הקש על השקופית בעדינות כדי להפיץ את התאים מסביב לרחבה.דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס. לטיפול ב- cardiomyocyte doxorubicin שמקורו ב- iPS, השלך את מדיום התרבות מ בארות קרדיומיוציט שמקורן ב- iPS, ושטוף את התאים עם PBS. לטפל בתאים עם טוקסורוביצין מיקרומולרי אחד במשך ארבע שעות ב 37 מעלות צלזיוס.שאפו את המדיום, ושטפו את התאים עם PBS. כדי לבצע immunolabeling, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS ולהוסיף 200 microliters של טרי מוכן 4% paraformaldehyde לכל באר. לתקן את התאים במשך 20 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.לאחר שטיפת התאים עם PBS, להוסיף 200 microliters של חיץ חסימה ל הבאר, ולחסום במשך 30 דקות בתא לח בטמפרטורת החדר. הסר את מאגר החסימה והוסף 200 מיקרוליטרים של פתרון נוגדנים ראשוני. לאחר הדגירה במשך 45 דקות בתא לח כהה בטמפרטורת החדר, לשטוף את בארות שלוש פעמים עם PBS.הסר את PBS ולהוסיף 200 microliters של תערובת נוגדנים משנית. דגירה במשך 45 דקות בתא לח כהה בטמפרטורת החדר. ואז לשטוף את בארות שלוש פעמים עם PBS.לשטוף עם מים deionized לפני הרכבה את המגלשות עם antifade. מניחים כיסוי, ולאחסן את המגלשות בחושך בארבע מעלות צלזיוס. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל, לקחת שלוש עד חמש תמונות של שדות אקראיים לכל מדגם ולהמשיך ניתוח תמונה.כדי לספור את מוקד התגובה נזק DNA, להוריד ולהתקין CellProfiler. בחר קובץ, ייבוא, צינור מהקובץ ובחר את קובץ הצבר בשם puncti gamma-H2AX. גרור ושחרר את התיקיה המכילה את התמונות שנרכשו של מוקדי גאמא-H2AX לחלון רשימת הקבצים בסעיף תמונות מודולי קלט לניתוח.לאחר מכן בצע את ההוראות כפי שמוצג בפרוטוקול הטקסט. כדי להגדיר את הפרמטרים לתמונות, גרור את התמונה הרצויה לניתוח לרשימת הקבצים. תחת מודולי קלט, בחר תמונות.גם במודולים של קלט, בחר מטה-נתונים ולאחר מכן בחר שמות וסוגים. עבור קבוצות, בחר לא. עבודה במודולים ניתוח, לבחור צבע לאפור.לאחר מכן בחרו 'החלק', בחרו 'זהה אובייקטים ראשיים' ובחרו שוב 'חלק'. לאחר מכן בחר שפר או העלם תכונות ולאחר מכן בחר זהה אובייקטים ראשיים. עדיין עובד במודולים ניתוח, לבחור קשר אובייקטים, לאחר מכן לסווג אובייקטים, ולבסוף לבחור ייצוא לגיליון אלקטרוני.לחצו על 'נתח תמונות' בחלונית הימנית התחתונה כדי לבצע ניתוח תמונה. עם השלמתו המוצלחת של הניתוח, נוצרות מספר תמונות. שים לב לקובץ ה- CSV שנוצר ו נשמר במיקום המתאים במחשב.קובץ זה מכיל את הנתונים הכמותיים לניתוח נוסף. בגיליון האלקטרוני שנקרא תמונת הניסוי שלי, בעמודה B יהיה מספר הגרעינים שיש להם עד חמישה פנצ'טי, ולעמודה D יהיה מספר הגרעינים שיש להם יותר מחמישה פנצ'טי. הוסף עמודות B ו- D כדי לקבל את המספר הכולל של גרעינים.חזור על שלבים אלה עבור כל התמונות, שינוי שם קובץ הניסוי שלי לפני כל ניתוח. מיקרוגרפים מייצגים של שביטים מתאים iPS שטופלו בטוקסו ולא טופלו מוצגים כאן. כמות בסיס של נזק לדנ"א נמצאה בתאי IPS, שבאה לידי ביטוי כשבר של נזק לדנ"א ולרגע הזנב.עם זאת, טיפול טוקסו הגדיל את נזק ה-DNA בתאי iPS כצפוי, המציין כי ניתן להשתמש בבדיקת שביט כדי להעריך את שלמות ה- DNA בתאי גזע פלוריפוטנטיים. מיקרוגרפים מייצגים של אימונאבלינג גאמא-H2AX מוצגים כאן, בהגדלה נמוכה יותר ובהגדלה גבוהה יותר. בשליטה iPS נגזר cardiomyocytes, יותר מ 90% של התאים היו פחות מחמישה FOCI DDR לכל גרעיני.ובסך הכל פחות מ-10% מהתאים היו יותר משישה מוקדי DDR לכל גרעינים. עבור קרדיומיוציטים שמקורם ב-iPS במשך שישה חודשים, פחות מ-90% מהתאים היו עד חמישה מוקדי DDR לכל גרעינים, ובסך הכל יותר מ-13% מהתאים היו יותר משישה מוקדי DDR לכל גרעינים. בעוד שבקרדיומיוציטים שטופלו ב-iPS, פחות מ-80% מהתאים היו עד חמישה מוקדי DDR לכל גרעינים.ובסך הכל כ -24% מהתאים היו יותר משישה מוקדי DDR לכל גרעינים. נתונים אלה מצביעים על כך שתרבות תאי קרדיומיוציט ממושכת שמקורה ב- iPS וטיפול בדוקסו גרמו לנזק משמעותי בדנ"א, מה שהופך אותם ללא מתאימים להשתלת תאים. חשוב מאוד להימנע משתנים תוך ערבוב ההשעיה התא, כמו זה עשוי להשפיע על אלקטרופורזה.בעקבות הליך זה, אתה יכול לבצע את בדיקות שביט ואת ההליכים immunolabeling עם תאים מסוגים שונים. טכניקות אלה יאפשרו תאים מסוגים שונים להיות מוערך עבור נזק DNA לפני שימוש במחקרים השתלת תאים.

assessing-stem-cell-dna-integrity-for-cardiac-cell-therapy

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

גרעינים לב מבודדים באמצעות שקיעה צפיפות immunolabeled עם נוגדנים נגד החומר pericentriolar 1 (PCM-1) כדי לזהות ולמיין גרעינים cardiomyocyte ידי cytometry הזרימה.

הבידוד של גרעיני Cardiomyocyte מרקמות שלאחר המוות

כאן אנו מתארים in vivo assay mutagenesis למספר קטן של תאי hematopoietic מטוהרים באמצעות מודל עכבר המהונדס לאצי. גן האצים יכול להיות מבודד כדי לקבוע את התדירות, מיקום והסוג של מוטציות DNA באופן ספונטני קם או לאחר החשיפה לgenotoxins.

זיהוי מוטציות DNA בתאי גזע / אב המטוהר Hematopoietic

המאמר מתאר את המתודולוגיה מפורטת להבחין ביעילות תאי גזע pluripotent אנושיים לשריר לב על ידי באופן סלקטיבי ויסות מסלול Wnt, ואחרי ניתוח cytometry זרימה של סמני התייחסות להעריך הומוגניות וזהותה של האוכלוסייה.

בידול יעילות גבוה של תאי גזע pluripotent האדם לשריר לב ואפיון על ידי cytometry הזרימה

כימות תחלופת הקרדיומיוציטים הוא מאתגר. הפרוטוקול המתואר כאן תורם תרומה חשובה לאתגר זה בכך שהוא מאפשר כימות מדויק ורגיש של יצירת גרעיני ניאו-קרדיומיוציטים וגרעיני פלואידיה.

הערכה סימולטני של DNA Cardiomyocyte סינתזה ploidy: שיטה Assist כימות Cardiomyocyte רגנרציה מחזור

אנו מציגים שלושה פרוטוקולי רומן ויעילים יותר להבחנה תא גזע מושר אנושי לתוך cardiomyocytes, תאי אנדותל, ותאי שריר חלק ו שיטת הצגה המשפר את engraftment של תאים מושתלים על ידי שילוב הזרקת תא עם משלוח ציטוקינים בתיווך תיקון.

תאי גזע פלוריפוטנטיים נגזרים תאי לב לתיקון שריר לב

כתב יד זה מתאר פרוטוקול שלב אחר שלב ליצירה וכימות של תת-סוגים לבביים מגוונים שתוכנתו מחדש באמצעות אספקה מתווכת רטרו-וירוס של Gata4, Hand2, Mef2c ו-Tbx5.

הערכה תת סוגי Cardiomyocyte בעקבות תמלול פקטור בתיווך תכנות מחדש של פיברובלסטים עכבר עובריים

כאן, אנו מציגים שיטה יעילה לרתום את הפוטנציאל בידול הלב של מקורות צעיר של גזע mesenchymal האנושי על מנת ליצור תאים פונקציונלית, קבלנות, כמו cardiomyocyte אין ויטרו.

במבחנה הבידול של גזע Mesenchymal אנושי לתוך תאים דמויי Cardiomyocyte תפקודית

המטרה הכוללת של מאמר זה היא כדי לתקנן את הפרוטוקול עבור בידוד, אפיון, התמיינות של תאי גזע הלב (CSCs) מהלב העכבר למבוגרים. כאן, אנו מתארים שיטה צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות לבודד CSCs מאתר ושיטות הארוטיות תרבות CSC, התפשטות של בידול לתוך cardiomyocytes.

בידוד, אפיון, התמיינות של תאי גזע הלב מהלב העכבר למבוגרים

בפרוטוקול זה, אנו להפגין ולפרט כיצד להשתמש בתאי גזע המושרה האדם pluripotent לבידול וטיהור, ועוד, על איך לשפר את היעילות השתלת שלה עם Rho-הקשורים החלבון קינאז מעכבי טיפול מקדים במודל אוטם שריר הלב של העכבר.

שיפור העפילו של תא גזע הנגרם לידי אדם-קרדיוציטים באמצעות עיכוב חולף של פעילות Rho קינאז

כאן, אנו מדגימים שיטה לא פולשנית להערכת התכווצות מכשור רפואי לבבי באמצעות חד-שכבות דו-ממדיות של קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC-CM), מצופות על מצע גמיש, יחד עם מיקרוסקופ מבוסס וידאו. כלי זה יהיה שימושי להערכה חוץ גופית של תכונות התכווצות של מכשירי אלקטרופיזיולוגיה לבבית.

הערכה של טיפול אפנון התכווצות הלב בקרדיומיוציטים דו-ממדיים שמקורם בתאי גזע אנושיים

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר הכנת גרעיני תאים. לאחר מיקרודיסקציה ודיסוציאציה אנזימטית של רקמת הלב לתאים בודדים, תאי האב הוקפאו, ולאחר מכן בידוד של תאים טהורים בני קיימא, ששימשו לריצוף RNA של גרעין יחיד ובדיקת גרעין יחיד לכרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ניתוחי ריצוף בתפוקה גבוהה.

בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכברים עבור אפיגנום ופרופיל ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד

למד פרוטוקולים להערכת נזק DNA בתאי גזע מושרים לפני השתלה. שיטות אלו מבטיחות איכות תאים לטיפול רегенרטיבי בקרדיומיופתיה ומחלות ניאונטליות אחרות.

הערכת תקינות ה-DNA בתאי גזע לטיפול תאי הלב

גלה סרטונים נוספים