Name: בחינה כמותית של רגישות לאנטיביוטיקה Neisseria gonorrhoeae ATP-ניצול אגרגטים באמצעות מבחני מסחרי, חי/מת מכתים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: חקור שיטה לבחינת רגישות לאנטיביוטיקה ב-Neisseria gonorrhoeae באמצעות מדידת ATP וצביעת חי/מת. השיטה מאפשרת הערכת יעילות אנטיביוטית בתנאים קליניים רלוונטיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק של המכון הלאומי לבריאות D.C.S., W.S. AI123340. ל', סי-וו. וו, איי. סי., והסתייעות E.N. ב חלק/להשתתף בתוכנית "בשנה הראשונה חדשנות & מחקר ניסיון" ממומן על ידי אוניברסיטת מרילנד. התורמים שחיים היה אין תפקיד לימוד עיצוב, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם, או אופן ההכנה של כתב היד. אנו להכיר UMD CBMG הדמיה הליבה עבור כל הניסויים מיקרוסקופ.

תחזוקה כללית של זנים GC
<ol><li>פסים gonorrhoeae ש זנים על אגר חוזרת עם 1% קלוג תוספי תזונה18 (טבלה 1, בטבלה 2) ממניות מקפיא, דגירה 37 ° C עם 5% CO2 במשך 16-18 ח' שימוש MS11 לבטא משתנה-שלב Opa (MS11Opa +), לא אופה (MS11ΔOpa), או לוס קטום (MS11ΔLgtE).</li>
	<li>בזהירות לבחור pili שלילי (המושבה ללא קצה כהה) או חיובית (המושבה עם קצה כהה) מושבות מהמאמץ כל מבוסס על המושבה מורפולוגיה19 באמצעות מיקרוסקופ אור ויבתר פס על גבי צלחת חוזרת חדשה.</li>
	<li>דגירה ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 16-18 שעות לפני השימוש.</li>
</ol>2. הכדאיות כימות של הצטברויות של GC
<ol><li>לאסוף GC באמצעות של המוליך סטרילי. ספוגית GC מהצלחת ו- GC להשעות מחדש במרק ומחוממת מראש (GCP, טבלה 3) בתוספת NaHCO 4.2%3 ו- 1% קלוג פתרונות18. השתמש ספקטרופוטומטר באורך-גל של 650 nm (OD650 1 = ~ 1 x CFU 109/mL) כדי לקבוע ריכוז חיידקים על תנאי.</li>
	<li>התאם את הריכוז של GC ~ 1 x 108 CFU/mL.</li>
	<li>להוסיף µL 99 של השעיה GC מנוכי עונתיות לתוך בארות של צלחת 96-ובכן.</li>
	<li>דגירה את הצלחת. בשביל 6-אייץ ' ב 37 ° C עם 5% CO2 כדי לאפשר את החיידקים להפעיל עליה פונקציית צבירה.</li>
	<li>להוסיף 1 µL של טורי צפטריאקסון מדולל (1000, 100, 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 1.5, 0.8, 0.4, 0.2 µg/mL) כל טוב. להשאיר מספר בארות לא מטופל לשמש כפקדי.</li>
	<li>דגירה את הצלחת במשך 24 שעות ביממה ב 37 ° C עם 5% CO2.</li>
	<li>Sonicate התליה 3 פעמים ב מכל קידוח עבור 5 s ב 144 W ו-20 קילו-הרץ.</li>
	<li>להוסיף 100 µL של ניצול ATP זמינים מסחרית, זוהר ריאגנט לבאר כל, פיפטה למעלה-למטה עבור 3 פעמים, ואת תקופת דגירה של 15 דקות ב 37 ° C עם 5% CO2.</li>
	<li>בזהירות להעביר µL 150 של תערובת מכל קידוח לתוך באר חדשה ב microplate שחור 96-ובכן ולהימנע היכרות עם בועות.</li>
	<li>למדוד את ספיגת כל הבאר-560 nm באמצעות קורא צלחת.</li>
	<li>לחשב שיעור ההישרדות לפי היחס של הקריאה שהושג לאחר הטיפול צפטריאקסון טורי לקריאת מבארות ללא טיפול.</li>
</ol>3. קרינה פלואורסצנטית ניתוח מיקרוסקופי של חי/מת האגרגטים GC
<ol><li>לאסוף GC באמצעות של המוליך סטרילי. ספוגית GC מהצלחת ו- GC מחדש להשעות מראש ומחוממת GCP מדיה בתוספת 1% קלוג תוספי תזונה.</li>
	<li>לקבוע את מספר החיידקים על ידי ספקטרופוטומטר באורך-גל של 650 nm ולהתאים את הריכוז של GC ~ 1 x 107 CFU/mL.</li>
	<li>להוסיף µL 198 GC השעיה לתוך צ'יימברס 8-ובכן coverslip למטה.</li>
	<li>דגירה התא עבור 6-אייץ ' ב 37 ° C עם 5% CO2 כדי לאפשר היווצרות צבירה.</li>
	<li>להוסיף 2 µL של צפטריאקסון (µg 100/mL או דילולים שונים) כל טוב בתוך בכל מצב צבירה. תקופת דגירה של הזמן המבוקש ב 37 ° C עם 5% CO2.</li>
	<li>הוסף µL 0.6 תערובת פתרון מכתימים חי/מת לבאר כל ' תקופת דגירה של 20 דקות ב 37 ° C עם 5% CO2.</li>
	<li>רוכשים את Z-סדרת תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (מיקרוסקופ המקביל יכול לשמש).</li>
	<li>לנתח את התמונות באמצעות תוכנת ImageJ למדידת גודל אגרגטים GC היחס עוצמת קרינה פלואורסצנטית (FIR) של חיים-אל-מת מכתים במצטבר לכל.</li>
</ol>4. תמונות ניתוח
<ol><li>הערכה של גודל האגרגטים חיידקי.<ol>
<li>פתח ImageJ ופתח תמונה על-ידי גרירת קובץ תמונה מסוג raw לשורת התפריטים ImageJ.</li>
		<li>לחץ על קווים חופשיים בשורת התפריטים ImageJ ותזיזו את האזור של כל מצבור בתמונה.</li>
		<li>לחץ על ניתוח | מדד בשורת התפריטים ImageJ.</li>
		<li>להשיג את המספר בחלון חדש תחת העמודה באזור .</li>
	</ol>
</li>
	<li>כימות של חיים-אל-מת יחס של הסיכומים<ol>
<li>פתח ImageJ ופתח תמונה על-ידי גרירת קובץ תמונה מסוג raw לשורת התפריטים ImageJ.</li>
		<li>לחץ על ניתוח | לקבוע מידות בשורת התפריטים ImageJ.</li>
		<li>בדוק את צפיפות משולבים בחלון המוקפץ ' ולחץ על ' אישור'.</li>
		<li>לחץ על התמונה | צבע | ערוצי כלי שורת התפריטים, בחר צבע.</li>
		<li>בדוק בערוץ 1 כמו זריחה על חיידקים חיים מכתים.</li>
		<li>לחץ על קווים חופשיים בשורת התפריטים ImageJ ותזיזו את האזור של כל מצבור.</li>
		<li>לחץ על ניתוח | מדד בשורת התפריטים ImageJ.</li>
		<li>להשיג את המספר תחת העמודה IntDen .</li>
		<li>בדוק בערוץ 2 כמו זריחה על צביעת חיידקים מתים. חזור על שלבים 4.2.6-4.2.8.</li>
		<li>להשיג את היחס לחיות-אל-מת על-ידי חלוקת מספר מהשלב 4.2.8 לפי מספר מהשלב 4.2.9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ניתוח סטטיסטי<ol>
<li>פתח GraphPad מנסרה, הזן את המספרים המתקבלים ImageJ אל העמודה הרצויה.</li>
		<li>לחץ על Analyze ובחר t בדיקות תחת העמודה ניתוחים.</li>
		<li>בדוק את העמודה הרצויה עבור השוואה ' ולחץ על ' אישור'.</li>
		<li>להשיג ערך P מתחת לחלון ניתוח .</li>
		<li>בחר את הרגרסיה הליניארית תחת ניתוחים XY מ שלב 4.3.3</li>
		<li>להשיג את R בריבוע ואת ערך-P מתחת לחלון ניתוח.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>CDC STD Facts. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm">http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm</a> (2017).</li>
<li>den Heijer, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+overview+of+urogenital%2C+anorectal+and+oropharyngeal+Neisseria+gonorrhoeae+testing+and+diagnoses+among+different+STI+care+providers%3A+a+cross-sectional+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study.</a> BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).</li>
<li>Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymptomatic+gonorrhea%3A+prevalence+in+a+population+of+urban+adolescents%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents.</a> The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).</li>
<li>Hananta, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonorrhea+in+Indonesia%3A+High+Prevalence+of+Asymptomatic+Urogenital+Gonorrhea+but+No+Circulating+Extended+Spectrum+Cephalosporins-Resistant+Neisseria+gonorrhoeae+Strains+in+Jakarta%2C+Yogyakarta%2C+and+Denpasar%2C+Indonesia%5BTitle%5D)+AND+%22Sexually+Transmitted+Diseases%22%5BJournal%5D)">Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia.</a> Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).</li>
<li>Chlamydia, W. H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis%2C+Neisseria+gonorrhoeae%2C+syphilis+and+Trichomonas+vaginalis.+Methods+and+results+used+by+WHO+to+generate+2005+estimates.+World+Health+Organisation%2C+2011.+Prevalence+and+incidence+of+selected+sexually+transmitted+infections%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organisation%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections.</a> World Health Organisation. , accessed Oct 5 (2011).</li>
<li>Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+gonococcal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22American+Family+Physician%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of gonococcal infections.</a> American Family Physician. 86 (10), 931-938 (2012).</li>
<li>Alirol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug-resistant+gonorrhea%3A+A+research+and+development+roadmap+to+discover+new+medicines%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines.</a> PLOS Medicine. 14 (7), (2017).</li>
<li>Workowski, K. A., Bolan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexually+transmitted+diseases+treatment+guidelines%2C+2015%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Recommendations+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015.</a> MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).</li>
<li>Lahra, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+Recognition+of+Internationally+Disseminated+Ceftriaxone-Resistant+Neisseria+gonorrhoeae+Strain%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), (2018).</li>
<li>Wi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+resistance+in+Neisseria+gonorrhoeae%3A+Global+surveillance+and+a+call+for+international+collaborative+action%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action.</a> PLOS Medicine. 14 (7), 1002344(2017).</li>
<li>Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Mechanism+of+Bacterial+Biofilms+Resistance+to+Antimicrobial+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Microbiology+Journal%22%5BJournal%5D)">Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents.</a> Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).</li>
<li>Greiner, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+Formation+by+Neisseria+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae.</a> Infection and Immunity. 73 (4), 1964-1970 (2005).</li>
<li>Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+and+antigenic+variation+govern+competition+dynamics+through+positioning+in+bacterial+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li>
<li>Stein, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Opacity+Proteins+Interferes+with+the+Transmigration+of+Neisseria+gonorrhoeae.+across+Polarized+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells.</a> PLoS One. 10 (8), 0134342(2015).</li>
<li>LeVan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+a+derivative+of+Neisseria+gonorrhoeae+strain+MS11+devoid+of+all+opa+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes.</a> Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).</li>
<li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+and+analyzing+static+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growing and analyzing static biofilms.</a> Curr Protoc Microbiol. , Chapter 1., Unit 1B.1 (2005).</li>
<li>Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+multiple+methods+for+quantification+of+microbial+biofilms+grown+in+microtiter+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates.</a> Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).</li>
<li>White, L. A., Kellogg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+Gonorrhoeae+Identification+in+Direct+Smears+by+a+Fluorescent+Antibody-Counterstain+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method.</a> Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).</li>
<li>Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+gonococcus+infection.+I.+Pili+and+zones+of+adhesion%3A+their+relation+to+gonococcal+growth+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns.</a> Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).</li>
<li>Herten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+Vitro+Quantification+of+S.+aureus+Biofilms+on+Vascular+Graft+Surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2333(2017).</li>
<li>Gracia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+development+of+Staphylococcus+aureus+biofilms+using+slime-producing+variants+and+ATP-bioluminescence+for+automated+bacterial+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Luminescence%22%5BJournal%5D)">In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification.</a> Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).</li>
<li>Webb, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).</li>
<li>Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+biofilm+formation+in+an+8-well+chamber+slide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide.</a> Journal of visualized experiments. (47), (2011).</li>
<li>Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+gonorrhoeae+Aggregation+Reduces+Its+Ceftriaxone+Susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility.</a> Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).</li>
<li>Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-related+infections%3A+bridging+the+gap+between+clinical+management+and+fundamental+aspects+of+recalcitrance+toward+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+diagnostic+guidelines+for+biofilm-associated+infections%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

חיידקים יכולים ליצור biofilms במהלך זיהום של הגוף האנושי. בדיקת מיקרופון מסורתיות אינן משקפות בהכרח את הריכוז הדרוש כדי למגר חיידקים ממבנה biofilm. כדי לבדוק את ההשפעות antimicrobials על ממבנה biofilm, שיטות בהתבסס על biofilm ביומסה, כמו גם plating CFUs יכול להיות מוטעים עקב ההשפעה של מבנה biofilm. לדוגמה, שיטת ציפוי פועלת רק אם biofilm עלולות להפגע. לפיכך, CFU שהושג עשוי להיות נמוך יותר מאשר מספר חיידקים מעשית בפועל. להמחיש חיידקים מתים וחיים בתוך biofilm הוקמו למדידת ההישרדות של החיידקים בתוך biofilm, עם זאת, בהתאם מבנ...

זיבה היא שנפוצה במגע מיני זיהום (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), diplococcal חיידק גראם שליליים, הוא סוכן סיבתי של המחלה. סימפטומים של זיהום הגניטלי עלולה לגרום לכאב במהלך מתן שתן מוכללת מכאבים באברי המין, הפרשות השופכה. זיהום לעיתים קרובות ללא תסמינים2,3,4,5, זה מאפשר קולוניזציה המורחבת. זיהומים אלה ללא טיפול הם דאגה בריאות קשות, הן בעלות פוטנציאל כדי להקל על שידור של האורגניזם, זה יכול לגרום לסיבוכים כגון מחלה דלקתית של האגן (PID), והופץ על ידי זיבה הזיהום (DGI)6. זיבה עמידים לאנטיביוטיקה היא משבר בריאות הציבור העיקריים של הגדלת נטל חברתי-כלכלי7. הרגישות מופחתת צפלוספורינים הביא שינוי משטר טיפול אנטיביוטיקה יחיד לטיפול כפול, המשלב azithromycin או דוקסיציקלין עם צפטריאקסון8. הכשל מוגברת של צפטריאקסון, azithromycin9,10, בשילוב עם זיהומים אסימפטומטיים, מדגיש את הצורך להבנת כשלים טיפול בזיבה.
המבחן הריכוז המעכב המינימלי (MIC), כולל אגר דילול ולדיסק דיפוזיה בדיקות, שימשה הבדיקה הרפואית סטנדרטי לזיהוי עמידות בפני אנטיביוטיקה. עם זאת, לא ברור אם הבדיקה מיקרופון משקף חיידקים עמידות לאנטיביוטיקה ויוו. היווצרות biofilms חיידקי תורמת ההישרדות של החיידקים בנוכחות ריכוזים אחרים של אנטיביוטיקה: הבדיקה מיקרופון אין אפשרות לזהות את אפקט11. כי GC יכול ליצור biofilms על משטחים הרירית12, אנחנו משערים אנטיביוטיקה זה הרגישות בתוך אגרגטים יהיה שונה כי ראיתי ב- GC בודדים. בנוסף, מחקרים הראו כי שלב שלוש מולקולות על פני משתנה, פילי, חלבונים הקשורים אטימות (אופה), lipooligosaccharides (לוס), המסדירים את האינטראקציות הבין-חיידק, להוביל אגרגטים בגדלים שונים13, 14 , 15. התרומה של רכיבים אלה כדי עמידות לאנטיביוטיקה לא נבדקה עקב המחסור של שיטות נאותה.
כיום, ישנן מספר שיטות למדידת biofilm מיגור. כמותיים השיטה הנפוצה ביותר היא על ידי מדידת שינויים ביומסה באמצעות קריסטל ויולט מכתים16. עם זאת, השיטה דורשת משמעותי מניפולציה ניסויית, אשר יכולים ליצור פוטנציאל שגיאות ניסוי חזרה17. שיטת צביעת חי/מת המשמשת כאן מאפשר הדמיה של חיידקים מתים וחיים והפצה שלהם בתוך biofilm. עם זאת, המבנה biofilm יכול להוות מכשול פיסי אשר מפחית את צבען חדירה. לכן, לכמת חיידקים חיים/מתים בתוך קבוצה, ההכתמה היא מוגבלת biofilms קטן או קודמן-microcolonies או הסיכומים שלה. שיטות אחרות, לרבות אגר דילול ולדיסק דיפוזיה הבדיקות, אינם יכולים למדוד את ההשפעות של צבירה. לבחון GC הרגישות תוך צבירת לאחר חשיפה לאנטיביוטיקה, שיטה אידיאלית צריך לקיים את שניהם assay כמותיים שיכול למדוד לחיות חיידקים והמחש ההפצה שלהם.
ההליך המתואר כאן משלב המדידה של ATP-ניצול, חי/מת מכתים הנועד באופן כמותי, בחנו ויזואלית GC הרגישות בתוך אגרגטים בנוכחות אנטיביוטיקה.

<table><tbody><tr>תוסף <td></td><td></td><td></td><td>100x קלוגס</td></tr><tr><td>אגר</td><td>ארצות הברית ביולוגי</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>BacTiter Assay&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G8232</td><td></td></tr><tr><td>Ceftriaxone</td><td>TCI</td><td>C2226</td><td></td></tr><tr><td>Difco GC בסיס בינוני&nbsp;</td><td>BD</td><td>228950</td><td></td></tr><tr><td>ברזל חנקתי, נולאהידרט&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>254223-10G</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין אבקה גבישית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP379-100</td><td></td></tr><tr><td>BacLight צביעה חיה/מתה</td><td>Invitrogen</td><td>L7012</td><td></td></tr><tr><td>MS11 Neisseria gonorrhoeae זן</td><td></td><td></td><td>מסופק באדיבות על ידי ד"ר הרמן שניידר, המכון הצבאי וולטר ריד עבור מחקר</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט דו-בסיסי (K2HPO4)Fisher</td> <td>Scientific</td><td>P290-500</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP329-1</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאוז פפטון&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>211693</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>S671-10</td><td></td></tr><tr><td>עמילן מסיס</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S9765</td><td></td></tr><tr><td>תיאמין פירופוספט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C8754-5G</td><td></td></tr><tr><td>ציוד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>8 בארות כיסויתא תחתון&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>צלחות תרבית רקמה 96 בארות&nbsp;</td><td>קורנינג, ארון</td> בטיחות ביולוגית פלקון <td>3370</td><td></td></tr><tr><td>(NU-425-600 Class II, קולט אדים למינארי זרימה ביולוגית)</td> <td>Nuaire</td><td>32776</td><td></td></tr><tr><td>CO2 חממת</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>&nbsp; דגם 3530</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד בתא הדמיה חי</td><td>Leica</td><td>SP5X</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; 96 באר מיקרופלטת פוליסטירן שחורה&nbsp;</td><td>תאורת קורנינג</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>גלומקס&nbsp;</td><td>קצות פיפטה Promega</td><td>E6521</td><td></td></tr><tr><td>(0.1-10 ומיקרו; L)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-717-133</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה (1000 ומיקרו; L)</td> <td>VWR</td><td>83007-382</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה (200 ומיקרו; L)</td> <td>VWR</td><td>53509-007</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר Ultrospec 2000 UV</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>80-2106-00</td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים סטריליים 15 מ"ל</td><td>VWR</td><td>21008-216</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים (1.7 מ"ל)</td> <td>Sorenson BioScience</td><td>16070</td><td></td></tr><tr><td>אפליקטורים סטריליים עם קצה פוליאסטר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>23-400-122</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Kontes</td><td>שווה ערך ל-9110001</td><td></td></tr></tbody></table>

בחינה כמותית של רגישות לאנטיביוטיקה neisseria gonorrhoeae atp-ניצול אגרגטים באמצעות מבחני מסחרי, חי/מת מכתים

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

הופעתה של עמידים לאנטיביוטיקה Neisseria gonorrhoeae (GC) איום בריאותי ברחבי העולם, מדגיש את הצורך לזהות אנשים נכשלים טיפול. חיידק גראם שליליים זה גורם זיבה באופן בלעדי אצל בני אדם. במהלך זיהום, הוא מסוגל טופס אגרגטים ו/או biofilms. הבדיקה הריכוז המעכב המינימלי (MIC) משמש כדי לקבוע את הרגישות לאנטיביוטיקה וכדי להגדיר את הטיפול המתאים. עם זאת, המנגנון של בהשמדה ויוו ויחסה תוצאות מעבדה לא ידועים. פותחה שיטה זה בוחן כיצד GC צבירת משפיע על רגישות לאנטיביוטיקה ואת מציגה את הקשר בין גודל צבירה של רגישות לאנטיביוטיקה. כאשר הצבירה GC, הם עמידים יותר בפני אנטיביוטיקה להרוג, עם חיידקים במרכז ששרדו צפטריאקסון טיפול טובים יותר מאלו בפריפריה. הנתונים מצביעים כי צבירת gonorrhoeae ש יכול להפחית את הרגישות צפטריאקסון, אשר אינה משתקפת באמצעות השיטות מיקרופון המבוסס על צלחת אגר רגיל. השיטה שבה נעשה שימוש במחקר זה יאפשר לחוקרים לבדוק את הרגישות בקטריאלי בתנאים הרלוונטית קלינית.

שתי שיטות הועסקו: assay ניצול של ATP ואת וזמינותו מוכתמים חי/מת. התוצאות ניתן להיות משולב או בנפרד המשמש לבחינת הישרדות חיידקי בתוך אגרגטים לאחר טיפול אנטיביוטי. ATP הניצול וזמינותו הוכח כדי למדוד במדויק קיימא חיידקים S. aureus biofilms20,21. כאן, פיל + MS11Opa + זן שימש לבחון את התפקיד של צבירת GC רגישות לאנטיביוטיקה. Non-המצטברים MS11Opa + פיל +, MS11Opa צבור + פיל +, או המצטברים, ואז ע י sonication MS11Opa + לפיל + שטו...

Assay ATP-מדידה פשוטה של חיים/מתים מכתים שיטת שימשו כדי לכמת והמחש Neisseria gonorrhoeae הישרדות לאחר הטיפול עם צפטריאקסון. פרוטוקול זה ניתן להרחיב לבחון את ההשפעות מיקרוביאלית של כל אנטיביוטיקה, ניתן להשתמש כדי להגדיר את הריכוז המעכב מינימלי של אנטיביוטיקה biofilms חיידקי.

בחינה כמותית של רגישות לאנטיביוטיקה Neisseria gonorrhoeae ATP-ניצול אגרגטים באמצעות מבחני מסחרי, חי/מת מכתים

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...

טכניקה זו מאפשרת לנו למדוד רגישות לאנטיביוטיקה בתנאים רלוונטיים יותר מבחינה קלינית. הטכניקה גם מאפשרת לנו לקבוע את הריכוז האנטיביוטי האמיתי שיכול להרוג חיידקים באגרגטים. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על קביעת הריכוז הדרוש לחיסול אגרגטים GC.השיטה יכולה להיות מיושמת גם על מדידת הרגישות מיקרוביאלית של כל חיידקים כי הוא מסוגל ליצור אגרגטים. שים לב לצעדי התזה כדי להבטיח שהתוזה הושלמה. אחרת ATP מדידת הראיה תמעיט במספר החיידקים קיימא.הדמיה של שיטה זו תאפשר לחוקרים אחרים לעקוב ולשכפל את הניסוי הזה בעקביות. התחל על ידי פסים זיבה Neisseria, או זנים GC, על אגר GCK בתוספת 1% קלוג עבור דגירה 16-18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. למחרת בבוקר, השתמש במיקרוסקופ אור כדי לבחור בקפידה מושבות פילי שליליות ללא קצוות כהים או מושבות פילי חיוביות עם קצוות כהים מכל צלחת, ולפס את המושבות הרים על צלחות GCK חדשות לתרבות של 16 עד 18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.למחרת בבוקר, השתמש במוליך סטרילי כדי לאסוף מושבות GC מכל צלחת ולתלות מחדש כל ספוגית במרק חם בתוספת 4.2% סודיום ביקרבונט ו 1%פתרון קלוג. למדוד את הצפיפות האופטית ב 650 ננומטר, או OD650, כדי לקבוע את הריכוז של חיידקים מושעים ולהתאים את ריכוז GC על אחד פעמים 10 לשמונה המושבה להרכיב יחידות למיליליטר. לאחר מכן, להוסיף 99 microliters של ההשעיה GC לתוך בארות בודדות של צלחת 96 באר ולאפשר את החיידקים לצבור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך שש שעות.בסוף הדגירה, מוסיפים מיקרוליטר אחד של ceftriaxone מדולל סדרתי לכל באר משאיר כמה בארות מטופלות לשמש פקדים ולהחזיר את הצלחת לאנקובטור במשך 24 שעות נוספות. למחרת, sonicate ההשעיה בכל באר שלוש פעמים ב 144 וואט ו 20 קילוהרץ במשך חמש שניות לכל sonication ולהוסיף 100 microliters של מסחרי זמין ATP ניצול זוהר reagent לכל באר. בזהירות להעביר 150 microliters של תערובת מכל באר לתוך בארות בודדות של microplate שחור חדש 96 היטב ולמדוד את הספיגה של כל באר ב 560 ננומטר על קורא צלחת.לאחר מכן, לחשב את שיעור ההישרדות על ידי היחס של הקריאה המתקבלת לאחר טיפול אנטיביוטי סדרתי לקריאה מן בארות מטופלים. להדמיה של אגרגטים GC חי / מת, להשתמש במוליך סטרילי כדי לאסוף GC מן הלוחות התרבותיים לילה לשימוש חוזר GC במדיום GCP טרום המלחמה בתוספת 1%Kellogg. למדוד את OD650 על ידי ספקטרופוטומיה ולהתאים את הריכוז כ 10 פעמים לשבע יחידות יוצרות מושבה למיליליטר.לאחר מכן, הוסיפו 198 מיקרוליטרים של השעיית GC לשמונה תאים תחתונים ומכסים את התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך שש שעות. בסוף האינקובציה, לטפל בחיידקים עם שני microliters של ceftriaxone לכל מצב צבירה ולהחזיר את התאים לאנקובטור לתקופת הדגירה הניסיונית המתאימה. בסוף האינקובציה, מוסיפים 0.6 מיקרוליטרים של תותכת חיה/מתה לכל באר ומחזירים את התאים לאנקובטור למשך 20 דקות נוספות.לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ קונפוקל כדי להשיג תמונות מסדרת z. למדידת גודל צבירות ה- GC, פתחו את התמונה הראשונה ב- ImageJ ובחרו קווים ביד חופשית כדי להקיף את האזור של כל צבירה בתמונה. לחץ על נתח ולמדוד.גודל הצבירה יצוין תחת עמודת האזור. לכימות יחס עוצמת הפלואורסצנטיות של כתמים חיים עד מתים בכל צבירה, לחץ על נתח והגדר מדידות ובדוק את הצפיפות המשולבת בחלון המוקפץ. לחצו על הלחצן 'אשר' ולחצו על הכלי תמונה, צבע וערוצים.בחר צבע לתעל אחד כמו פלואורסצנטיות עבור כתמים חיידקים מתים. בחר קווים חופשיים כדי להקיף את האזור של כל צבירה ולחץ לנתח ולמדוד כדי לקבל את יחס עוצמת הפלואורסצנטיות עבור כל צבירה בעמודת הצפיפות המשולבת. בחר ערוץ 2 עבור פלואורסצנטיות עבור כתמים חיידקיים חיים ולמדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות בכל צבירה כפי שהודגם רק.לאחר מכן חלקו את נתוני עוצמת הפלואורסצנטיות החיה על ידי נתוני עוצמת הפלואורסצנטיות המתה כדי להשיג את יחס עוצמת הפלואורסצנטיות החיה עד המתה. בניסוי מייצג זה, פילי חיובית ללא הפרעה, פילי צבור חיובי או צבור ושיבש חיידקים חיוביים pili טופלו עם דילול סדרתי של ceftriaxone לפני מדידת רמות ATP שלהם. GC preaggregateed הפגין הישרדות גבוהה משמעותית מאשר לא מצטבר או צבירה שיבשה GC כאשר מטופלים עם ריכוזים שווים של ceftriaxone ומעלה.זנים חיוביים פילי כי טופס אגרגטים גדולים יותר הציגו את רמות ATP הגבוהות ביותר לאחר טיפול ceftriaxone בהשוואה זנים מוטציה. ללא קשר למתח שנבדק, כתמים חיים / מתים לפני טיפול אנטיביוטי גילה חיידקים מתים הממוקמים בעיקר בשכבות החיצוניות של התרבות, בעוד GC חי זוהו בעיקר בתוך הליבה של אגרגטים שטופלו ceftriaxone. כצפוי, חיידקים פילי חיוביים יצרו את הצבירה הגדולה ביותר, בעוד תרבויות פילי שליליות יצרו את הקטן ביותר.יש לציין כי אגרגטים חיוביים פילי היו עדיין בחיים בשכבות הליבה שלהם לאחר טיפול אנטיביוטי, ואילו GC באגרגטים מוטנטים קטנים, רופף היו מתים. בהתבסס על גודלו והישרדותו של ה- GC, ניתן לתכנן גרף מתאם כדי לבחון את הקשר בין גודל הצבירה להישרדות האנטיביוטית של החיידקים. Sonication חשוב לוודא כי ATP מכל חיידק בודד הוא שוחרר בתוך אגרגטים כבול היטב.אחרת, המדידות לא יהיו עקביות. חשוב צלחת החיידקים לאחר שהם מצטברים ומטופלים עם אנטיביוטיקה כדי למדוד הן את החיידקים קיימא ואת החיידקים מסוגלים שכפול. הטכניקה מודדת את השפעת צבירת החיידקים על רגישות לאנטיביוטיקה ומאפשרת לחוקרים לפתח תרופות טובות יותר לטיפול במחלות.

quantitative-examination-antibiotic-susceptibility-neisseria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: Cayron, J., and Lesterlin, C. ניתוח רב-ממדי של גידול חיידקים תחת טיפולי לחץ. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את ההליך להערכת נימה של E. coli ושכפול DNA תחת טיפול אנטיביוטי מעכב חלוקת תאים באמצעות ציפוי למדידת כדאיות וזרימה ציטומטרית לניתוח גודל התא ותכולת ה-DNA.

הערכת נימה הנגרמת על ידי אנטיביוטיקה ב-E. coli באמצעות בדיקת ציפוי וזרימה ציטומטרית

מקור: Maurakis, S., and Cornelissen, C. N. גידול מוגבל במתכת של Neisseria gonorrhoeae לאפיון גנים המגיבים למתכת ורכישת מתכת מליגנדים מארחים. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים את ההליך לזיהוי מובילי מתכות על פני השטח ב-Neisseria gonorrhoeae הגדלים בתנאים מוגבלים במתכת באמצעות בדיקת כתמי נקודות, הכוללת קשירת ליגנד, זיהוי נוגדנים והדמיה קולורימטרית.

איתור מובילי המתכות על פני השטח ב-Neisseria gonorrhoeae באמצעות כתם נקודות

סרטון זה מדגים טכניקה במבחנה לחקר ההשפעה של טיפול מיקרוביאלי על אגרגטים של Pseudomonas aeruginosa (Pa). תאי Pa בעלי תווית פלואורסצנטית גדלים כאגרגטים, המחקים את דפוס הצמיחה במהלך זיהום. לאחר קריאת תיגר על האגרגטים עם ריכוז תת-קטלני של האנטיביוטיקה קוליסטין, מתבצעת הערכה בזמן אמת של האינטראקציה בין חיידקים לאנטיביוטיקה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

טכניקת מבחנה לחקר טיפולים אנטי-מיקרוביאליים על אגרגטים חיידקיים

סרטון זה מתאר את בדיקת מדידת ה-ATP הפשוטה באמצעות מגיב זוהר לוציפראז. בדיקה זו משמשת לכימות הישרדות Neisseria gonorrhoeae לאחר טיפול עם ceftriaxone.

בדיקת ניצול ATP לקביעת הישרדות חיידקים תחת טיפול אנטיביוטי

מרכזי בתחום הפתוגנזה חיידקים הוא היכולת להגדיר אם וכיצד חיידקים לשרוד לאחר חשיפה לתאי אוקריוטים. מאמר זה מתאר פרוטוקולים לשימוש בצבעי ניאון החושפים את יכולת הקיום של חיידקים בודדים בפנים וקשור עם תאי מארח.

שיטות מיקרוסקופית הקרינה לקביעת הכדאיות של חיידקים באיגוד עם תאי יונקים

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לסינון ואפיון מהיר של אנזימים לפעילות אנטי-מיקרוביאלית. בדיקת דיפוזיה של מיקרו-שקופיות ובדיקת שחרור הצבע משתמשות במצעי חיידקי מטרה להערכת פעילות אנזימטית איכותית וכמותית.

מבחנים איכותיים וכמוני עבור זיהוי ואפיון של antimicrobials החלבון

הפרוטוקול מציג את Escherichia coli-המבוסס על הלחץ הסלקטיבי השתלבות של חומצות אמינו קאנונית (ncAAs) nisin פפטיד מיקרוביאלית lactococcal. ניתן לשנות את מאפייניו במהלך רקומביננטי ביטוי באמצעות החלפת עם ncAAs הרצוי בתקשורת צמיחה מוגדרים. השינויים הנובעים מכך באתריים ממופים על ידי הצמיחה עיכוב מבחני פלורסצנטיות מיקרוסקופ.

פפטידים מיקרוביאלית המיוצר על ידי ההתאגדות הלחץ הסלקטיבי של חומצות אמינו קאנונית

פלואור שתייגת אנטיביוטיקה הם כלים רבי-עוצמה שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד היבטים מרובים של עמידות מיקרוביאלית. מאמר זה מתאר את הכנת אנטיביוטיקה מתויג fluorescently היישום שלהם כדי ללמוד עמידות לאנטיביוטיקה בחיידקים. רגשים יכולים לשמש כדי לחקור מנגנונים של עמידות חיידקים (למשל, אפלוקס) על ידי ספקטרופוטומטר, זרימה cy try, ו מיקרוסקופ.

ויזואליזציה של עמידות בקטריאלי באמצעות הפלורסנט אנטיביוטי רגשים

ניתן להשתמש במדיום כיח סיסטיק פיברוזיס סינתטי (SCFM2) בשילוב עם מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלית ומיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות כדי לצפות באגרגטים חיידקיים ברזולוציה גבוהה. מאמר זה מפרט שיטות להערכת אוכלוסיות מצטברות במהלך טיפול מיקרוביאלי כפלטפורמה למחקרים עתידיים.

כלים להערכה בזמן אמת של מודל זיהום פסאודומונס ארוגינוזה

עמידות לאנטיביוטיקה בקרב זני Escherichia coli פולשניים דבקים מהווה אתגרים בהערכת פלישה חיידקית באמצעות בדיקת הגנה מסורתית של ג'נטמיצין. מתוארת שיטה משופרת להערכת פלישת חיידקים באופן כמותי על ידי מניית יחידות יוצרות מושבות ובאופן איכותי באמצעות הדמיה של תאים נגועים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי אימונופלואורסצנציה.

בדיקת הגנה על אמיקצין לכימות והדמיה של פלישת תאי אשריכיה קולי

חקור שיטה לבחינת רגישות לאנטיביוטיקה ב-Neisseria gonorrhoeae באמצעות מדידת ATP וצביעת חי/מת. השיטה מאפשרת הערכת יעילות אנטיביוטית בתנאים קליניים רלוונטיים.

בחינה כמותית של רגישות לאנטיביוטיקה Neisseria gonorrhoeae ATP-ניצול אגרגטים באמצעות מבחני מסחרי, חי/מת מכתים

גלה סרטונים נוספים