הנדסה גנטית של Dictyostelium discoideum תאים בהתבסס על הבחירה וצמיחה על חיידקים
25 בינואר 2019
Dictyostelium discoideum הוא אורגניזם מודל פופולרי ללמוד תהליכים תאיים מורכבים כגון נדידת תאים, אנדוציטוזה ופיתוח. השירות של האורגניזם תלויה הכדאיות של הנדסה גנטית. כאן, אנו מציגים שיטות transfect תאים Dictyostelium discoideum להתגבר על המגבלות הקיימות של תאים culturing בתקשורת נוזלי.
הערך של פרוטוקול זה הוא שהוא מאפשר כמעט כל זן של דיסקואידום dictyostelium להיות מניפולציה על ידי גנטיקה מולקולרית, ללא קשר אם זן זה יגדל axenically במדיום נוזלי או לא. היתרון השני של טכניקה זו הוא שהיא מהירה ופשוטה. יש לבצע חילוף של תאים עם פלסמיד אקסוכרומוזומלי לפני שמתחילים לערבב דיקטיוסטליום.
התוצאות כבר ניתן לאמת יומיים לאחר transfection באמצעות מיקרוסקופיה. זה יוצא דופן לעבוד עם תאי דיסטיוסטליום והשעיית חיידקים. הדמיה תעזור לתת לנסיינים מושג כיצד מבוצעים השלבים השונים של הפרוטוקולים.
הדגמת ההליך איתי תהיה סודבה אימניקיה, פוסט-דוק מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, להכין 1000 מיליליטר של חיץ סורנסן עובד פתרון עבודה עם מגנזיום כלורי סידן כלורי על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, השתמש במושבה אחת של K aerogenes כדי לחסן ליטר אחד של מדיום LB.
אפשר לחיידקים לגדול בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות. לסובב את התאים למטה בשני צינורות צנטריפוגה 500 מיליליטר כדי לקצור את התאים. לאחר מכן, לשטוף את החיידקים פעם אחת עם 500 מיליליטר של חיץ.
תן שימוש חוזר לכדור ב-20 מיליליטר של חיץ. השתמש photometer כדי לבדוק את הצפיפות האופטית של המדגם לדלל את המדגם עם חיץ עד הצפיפות האופטית היא כ 100. לאחר מכן, הכן את מאגר האלקטרופולציה H40 בהתאם לפרוטוקול הטקסט.
לגדל K aerogenes כדי לאנסף אמצעי SM לילה בטמפרטורת החדר. מוסיפים 400 מיקרוליטרים של מתלים חיידקיים לצלחת אגר SM ומפיצים אותה באופן שווה. לאחר מכן, לקחת לולאה סטרילית לחסן אותו עם תאים דיקטיוסטליום ולהפיץ את התאים בקצה אחד של הצלחת.
הדגירה את הצלחת ב 22 מעלות צלזיוס במשך יומיים, כדי להבטיח את אזורי הצמיחה גדולים מספיק עבור transfection. הוסיפו 10 מיליליטר של השעיית K aerogene לצלחת פטרי שטופלה בתרבות רקמה של 10 ס"מ. לאחר מכן, השתמש בלולאת חיסון חד פעמית 10 microliter כדי לגרד תאים אזורי הצמיחה של צלחת התרבות.
העבר את התאים לצינור 1.5 מיליליטר, המכיל חיץ H40 קר כקרח. סובב את התאים לשתי שניות בכבידה של פי 10000. לאחר מכן, השלך את העל-טבעי והתן מחדש את התאים במאגר H40.
לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של התאים לצינור המכיל אחד עד שני מיקרוגרם של DNA. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב ולהעביר את תערובת הדנ"א של התאים לקעת אלקטרופורציה מצוננת מראש. אין להוסיף יותר משני מיקרוגרם דנ"א.
ריכוז דנ"א גבוה יותר רעיל לתאים ומפחית את היעילות. לאחר אלקטרופורציה, מיד להעביר את התאים לצלחת פטרי מוכן 10 ס"מ ולאפשר לתאים להתאושש במשך חמש שעות. כדי לבחור transfectant עבור נוקאאוט, נוק-אין, או מעשה חמש לדפוק ב, לנתק את התאים מן צלחת פטרי על ידי צינור נוזל על פני השטח.
לאחר מכן, הגדר שלושה דילולים של הסוכן הסלקטיבי על פי פרוטוקול הטקסט. לבסוף, להפיץ 150 microliters של דילול מוכן לתוך כל באר של 96 גם שטוח למטה רקמות צלחות תרבות. בפרוטוקול זה, הוכחה מערכת פלסמיד חוץ-כרומוזומלית של כתב כפול.
32 שעות לאחר ההיתוך, רוב התאים הביעו שני חלבוני היתוך פלואורסצנטיים. כמו כן נוסו נוקאאוט דובדבנים של מערכה 5 M ו-NC4. שתי להקות הושגו לאחר הפעלת העיכול על ג'ל אגרוז.
רצועת זוג הבסיס 4127 מכילה את המבנה הרצוי. הדנ"א המטוהר שימש להתרה של תאי NC4. שני שיבוטים של ההמרה NC4 נותחו באמצעות PCR ושניהם הראו את דפוסי הלהקה החזויים.
כתם דרומי שימש אז כדי לאמת את התוצאות של PCR. NC4 גדל מהר יותר על מדשאות חיידקים מאשר תאים Ax2. לאחר ארבע שעות, יותר של תאים NC4 הצליחו לזחול מתחת agarose מאשר תאים Ax2.
תאי ה-NC4 היו מהירים יותר והראו תגובה כימוטקטית חזקה יותר לאפולאט מאשר לתאי ה-Ax2. השתמש תמיד בתאים מצלחות SM שהגדירו זה את זה. לעולם אל תשתמש בתאים מעל ארבעה ימים, אחרת היעילות תרד.
זני HAP לבנים ומבודדים טריים משמשים בדרך כלל לטיפול בשאלות הנוגעות להתנהגות רועמת או חברתית של דיקסטיוסטליום. שלנו מאפשר ליישם גנטיקה מולקולרית דרך מבודדים אלה.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לטרנספקציה של תאי Dictyostelium discoideum, המאפשר מניפולציה גנטית ללא קשר לתנאי הצמיחה של הזן. השיטה יעילה ופשוטה, ומאפשרת תיקוף מהיר של התוצאות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- מניפולציה גנטית
- אורגניזמי מודל
רקע
- Dictyostelium discoideum הוא אורגניזם מודל נפוץ לחקר תהליכים תאיים.
- מניפולציה גנטית היא קריטית לבחינת שאלות ביולוגיות שונות.
- לשיטות קיימות יש מגבלות המבוססות על תנאי הגדילה של זנים שונים.
- פרוטוקול זה נועד להתגבר על מגבלות אלו.
מטרת המחקר
- לספק שיטה מהימנה לטרנספקציה של זנים שונים של Dictyostelium discoideum.
- להקל על יישומים של גנטיקה מולקולרית בזנים שאינם גדלים באופן אקסני.
- להדגים את יעילות תהליך הטרנספקציה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תמיסות חיידקים ובאפרים עבור טרנספקציה.
- אלקטרופורציה של תאי Dictyostelium discoideum עם DNA פלסמידי.
- תיקוף תוצאות הטרנספקציה באמצעות מיקרוסקופיה ו-PCR.
- הערכת התנהגות התאים וצמיחתם בתגובה לטרנספקציה.
תוצאות עיקריות
- טרנספקציה מוצלחת של מספר זנים של Dictyostelium discoideum.
- ביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים שנצפה 32 שעות לאחר הטרנספקציה.
- תאי NC4 הראו צמיחה מהירה יותר ותגובה כימוטקטית בהשוואה לתאי Ax2.
- תיקוף של שינויים גנטיים באמצעות PCR ואנליזת Southern blot.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר מניפולציה גנטית יעילה של זני Dictyostelium discoideum.
- הוא מספק מסגרת למחקרים עתידיים על התנהגות תאית וגנטיקה.
- זנים שבודדו לאחרונה מניבים את התוצאות הטובות ביותר ביחס לנצילות התעתוק.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר מניפולציה גנטית של זני Dictyostelium מסוג wild-type הגדלים על חיידקים, ובכך הוא מתגבר על המגבלות של זנים שהותאמו לגידול אקסני (axenic) שבהם שילוח ה-Ras מופרע. הוא מספק שיטה מהירה וניתנת להרחבה (scalable) לתיקוף יעדים במערכת מודל הרלוונטית למחלה, ובכך תומך בהסרת סיכונים מכניסטיים בשלבי גילוי מוקדמים. הגישה מרחיבה את הגנטיקה המולקולרית לזנים המבודדים סביבתית, ובכך משפרת את הרציפות התרגומית ואת הביטחון החזוי בתהליכי סריקה פנוטיפית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות במסלולי איתות ותנועתיות שאינם פגומים, באמצעות שימוש בזנים שאינם אקסניים (non-axenic) עם איתות Ras תקין.
- ערך תפעולי: מפחית גורמים מתערבים בניסוי הנובעים מפגמים במקרופינוציטוזיס ושיבושים בנדידה הנצפים בזנים אקסניים.
- ערך חיזוי: תומך בתיקוף תפקודי של מטרות ובצמצום סיכונים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות למוטגנזה בתנאי גידול רלוונטיים פיזיולוגית.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר תאים רקומביננטיים המבטאים רפורטרים פלואורסצנטיים כפולים תוך 32 שעות, מה שמאפשר קריאות מהירות של בדיקות לסריקת תרכובות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תהליך הטרנספקציה באמצעות שטיחי חיידקים ואלקטרופורציה, לשיפור השחזוריות בין מעבדות שונות.
- قابליות להרחבה: מאיץ את לוח הזמנים מהטרנספקציה ועד לקבלת שיבוטים מאומתים תוך ימים במקום שבועות, ובכך תומך בהנדסת זנים בספיקת עיבוד גבוהה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקל על חקר כימותקסיס והתנהגות חברתית בזנים של טיפוס פרא שבודדו לאחרונה, ובכך משפר את הרלוונטיות של מודלים למחלות.
- ערך תפעולי: מאפשר יישום ישיר של גנטיקה מולקולרית על בידודים סביבתיים ללא צורך בהסתגלות אקסנית מוקדמת.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין תיקוף מטרות בשלב הגילוי לבין פנוטיפים פרה-קליניים באמצעות תפליטים מדידים, כגון כימותקסיס המושרה על ידי פולאט ובדיקות חדירה לאגרוז.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה מתאימה לשלבים שבין הגילוי המוקדם לזיהוי המוליכים, על ידי אספקת מודלים ניתנים להנדסה גנטית לבחינת מסלולים וסריקה פנוטיפית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות בנושאי כימוטקסיס, מקרופינוציטוזיס ואיתות התפתחותי באמצעות זנים שלמים מסוג wild-type.
- סריקה: מספק קריאות כמותיות של פלואורסצנציה וצמיחה על מדשאות חיידקים להערכה מהימנה של תרכובות.
- אנליזה: מאפשר אישור של שינויים גנטיים באמצעות PCR, Southern blot ומיקרוסקופיה בתוך 32–48 שעות לאחר התעתוק.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מניפולציה גנטית לבדיקות תפקודיות כגון כימוטקסיס וצמיחה תחת אגרוז, ובכך מסייע בקידום מותאם סיכונים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר להנדסה של כל זן של Dictyostelium, ללא קשר למקור הבידוד או לתנאי הצמיחה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי ביטול ארטיפקטים הנובעים מהסתגלות אקסנית (axenic) והשבת מסלולי שבידור טבעיים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות הכנות סטנדרטיות של באפרים, פרמטרי אלקטרופורציה ופרוטוקולי סלקציה.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי קיצור לוחות הזמנים להנדסת זנים ומאפשר קבלת החלטות מהירה של go/no-go באישור יעדים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון על ידי יצירת מודלים עם סיכון מכניסטי מופחת ושינויים גנטיים מאושרים.
שיקולי יישום
- דרושה מומחיות במיקרוביולוגיה להכנת תרביות חיידקים ולטיפול ב-Dictyostelium על מדשאות חיידקים.
- תלוי בגישה לציוד אלקטרופורציה ולתשתית סטרילית לתרביות רקמה עבור שלבי הטרנספקציה וההחלמה.
- מחייב סטנדרטיזציה של צפיפות האינוקולום החיידקי (OD ~100) והכנת באפר H40 בין המשתמשים השונים.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום הפרוטוקול על בידודים שונים של זנים פראים או זנים סביבתיים.
- מוגבל לזנים המסוגלים לגדול על מדשאות חיידקים; היעילות פוחתת בתאים שגילם מעל ארבעה ימים לאחר הבידוד.
