מוטגנזה עבור במבחנה, בניסויים Vivo ביטוי עם אינטראקציות RNA ב- Escherichia Coli

mutagenesis מכוון האתר שימושי לחקר אינטראקציות מולקולריות, כגון RNA-RNA, אינטראקציות חלבון RNA. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע mutagenesis המכוון לאתר עם גישת PCR דו-שלבים או תלת-שלבים. היתרונות העיקריים של השיטה הם מגוון של מוטציות שונות שניתן לשלב, כמו גם קלות יחסית ועלות לעשות זאת.

כדי להתחיל, השתמש בתבנית ה- DNA של סוג הפרא ובזוגות פריימר שניים, אחד ושניים, שלושה, ספציפיים לזוגות דו-שלביים או פריימר שלושה, אחד ושלוש, ארבעה, ספציפיים עבור PCR תלת-שלבי כדי להשיג מוצר PCR אחד. כדי לאמת מוצרי PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל אגרוז, לעשות 2% agarose ג'ל על ידי המסת שני גרם של אגרוז ב 100 מיליליטר של חיץ TAE 1X, באמצעות תנור מיקרוגל. מוסיפים אתידיום ברומיד בריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם למיליליטר.

ואז להטיל את הג'ל אגרוז. כאשר הוא מועשר, מקם אותו ביחידת אלקטרופורזה. לטעון סולם DNA בגודל ידוע, ואת דגימות PCR מעורבב עם DNA טעינת צבע לתוך בארות.

הפעל דגימות ב 75 וולט במשך 45 דקות. ולדמיין רצועות על טרנסילומינטור UV או עם מערכת הדמיה ג'ל. לאחר מכן, לטהר את המוצר PCR עם ערכת מיצוי ג'ל על פי פרוטוקול היצרנים ולמדוד את הריכוז של DNA מטוהרים עם ספקטרופוטומטר.

לאחר מכן אחסן את הדנ"א המטוהר במינוס 20 צלזיוס במאגר TE. כדי להתחיל mutagenesis מכוונת האתר עם PCR 2-שלב, תחילה להשתמש בתבנית DNA מסוג פראי, לאחר מכן פריימר זוגות שתיים, אחת ושתיים, שתיים, עבור חמש מוטציות פריימר, או זוגות פריימר שתיים, שתיים, ושתיים, שלוש עבור שלוש מוטציות priment כדי להשיג מוצר PCR 2. לאמת את מוצר PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל, לטהר את המוצר PCR, ולמדוד את הריכוז שלה כמתואר קודם לכן.

לאחר מכן השתמש בתבנית ה- DNA מסוג פראי ובתוצר PCR 2 כ- primer, יחד עם פריימר 2, שלושה לחמישה מוטציות ראשוניות, או פריימר 2, אחד לשלוש מוטציות ראשוניות, כדי להשיג מוצר PCR 3. לאמת את מוצר PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל, לטהר את המוצר PCR, ולמדוד את הריכוז שלה כמתואר קודם לכן. לאחר מכן אחסן את הדנ"א המטוהר במינוס 20 מעלות צלזיוס במאגר TE.

כדי להתחיל mutagenesis האתר ישיר עם PCR 3 שלבים, תחילה להשתמש בתבנית ה-DNA מסוג פראי זוגות פריימר שלוש, אחד, ושלוש, שניים כדי להשיג מוצר PCR 2. השתמש בתבנית ה- DNA מסוג Wild ובזוגות פריימר שלוש, שלוש ושלוש, ארבע, כדי להשיג מוצר PCR שלוש. השתמש בתבנית ה- DNA של סוג הפרא ובזוגות פריימר שלוש, שלוש ושלוש, ארבע, כדי להשיג מוצר PCR שלוש.

לאמת את מוצר PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל, לטהר את המוצר PCR, ולמדוד את הריכוז שלה כמתואר קודם לכן. לבסוף להשתמש שניים עד חמישה ננוגרם של מוצרי PCR שתיים ושלושה כתבנית יחד עם זוגות פריימר שלוש, אחת ושלוש, ארבע, כדי להשיג מוצר PCR ארבע. לאמת את מוצר PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל, לטהר את המוצר PCR, ולמדוד את הריכוז שלה כמתואר קודם לכן.

אחסן את הדנ"א המטוהר במינוס 20 מעלות צלזיוס במאגר TE. במחקר זה, mutagenesis 2-שלב ו 3-שלבים מכוונת האתר שימשו כדי לחקור אינטראקציות RNA לגבי ויסות שלאחר שעתוק של CsgD. CsgD מסוג פראי היה PCR מוגברת כדי להניב PCR מוצר IA, ואת mcaS מסוג פראי היה PCR מוגברת להניב PCR המוצר IB. באמצעות אסטרטגיית PCR תלת-שלבי, מוצרי PCR IIA ו- IIIA היו מסונתזים בשני השלבים הראשונים, ו- IVA בשלב השלישי כדי להציג מוטציות ב- CsgD.

באופן דומה, מוטציות מכוונות אתר חינם הוכנסו mcaS להניב מוצרי PCR IIB, IIIB, בשני השלבים הראשונים, ו IVB בשלב השלישי. ניתוח כתם מערבי הראה כי בעוד ביטוי של mcaS מסוג פראי מונע תרגום של CsgD מסוג פראי, מוטציות ב- mcaS או CsgD מקלות על הדיכוי שנצפה. עם זאת, מוטציות הן CsgD והן mcaS למנוע תרגום של CsgD.

באמצעות אסטרטגיית PCR דו-שלבי, מוצרי PCR IIC, IID, IIE, IIF ו- IIG, היו מסונתזים בשלב הראשון, ומוצרי PCR IIIC, IIID, IIIE, IIIF ו- IIIG, בשלב השני כדי להציג מוטציות ל- DNA CsgD כולו. תוצאות EMSA של איגוד HFQ ל- CsgD מועתק במבחנה ו- RNAs מוטנטים, מסונתז באמצעות מוצרי PCR IIIC, IIID, IIIE, IIIF, ו- IIIG, הראו את ערכי KD מוגברת של אללים מוטנטים. זה הוכיח כי HFQ יכול להיקשר פחות ביעילות למוטנטים.

יתר על כן HFQ יש מספר אתרי איגוד על CsgD, אשר מוצג על ידי שלוש משמרות שנצפו עבור RNA מסוג פראי. עם זאת, רק שני אתרי איגוד נצפו עבור RNAs מוטנטים שונים. לפיכך, הגישה המוטציה המכוונת לאתר מזהה מבנים ראשוניים או משניים של ה- CsgD mRNA החשובים לכריכה מלאה של HFQ.

השיטה עבור mutagenesis האתר המתואר כאן מסתמך על PCR. נוהלי PCR טובים הם חיוניים עבור השיטה עשוי לדרוש אופטימיזציה כדי להצליח. מוטגנזה מכוונת אתר היא רק חזקה עם כל שלוש השיטות כגון EMSA ו- Blotting המערבי.

שיטות אחרות, למשל, כוללות מים מבניים שונים וכמה תדות פעילות, ומחקרי שינוי בתרגום פוסט.