Name: מוטגנזה עבור במבחנה, בניסויים Vivo ביטוי עם אינטראקציות RNA ב- Escherichia Coli (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: למד מוטגנזה מכוונת אתרים ב-Escherichia coli לחקירת אינטראקציות RNA-RNA ו-RNA-חלבון. שיטת ה-PCR בשני או שלושה שלבים מאפשרת הכנסת מוטציות ספציפיות ביעילות ובעלות נמוכה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצה להודות באוניברסיטת דרום דנמרק גישה פתוחה מדיניות מענקים.

1. וקטור בחירה
<ol><li>לבחור וקטור לבצע ניסויים במורד הזרם. כל וקטור הוא ישים עבור שיטה זו PCR 2 - ו 3-צעד.</li>
	<li>בהתבסס על הבחירה של וקטור, לבחור אנזימי הגבלה המתאים עבור שכפול.</li>
</ol>2. פריימר עיצוב עבור אתר ביים מוטגנזה מכוונת
<ol><li>להחליט בכל שלב 2 או 3-צעד PCR האסטרטגיה (2-שלב זה רק עבור מוטציות < 200 bp מקצה ה-dna של עניין). עבור PCR דו-שלבי, עבור לשלב 2.2 וללכת על ה-PCR 3-צעד צעד 2.3.</li>
	<li>עיצוב צבעי יסוד 2-שלב ה-PCR.<ol>
<li>עיצוב פריימר 1 ו- 3 כדי להגביר את ה-DNA של עניין ועם של 5' בולט זה מכיל נוקלאוטידים 4 (למשל, האישיות של או AGCT) ואחריו האתר זיהוי הגבלת הרלוונטי הדרוש לשבט לתוך הווקטור שבחרת.</li>
		<li>עיצוב פריימר 2 כדי להציג את mutation(s)-האתר הרצוי ולאגף את המוטציה עם 10-15 נוקלאוטידים משלימים משני הצדדים. הפוך את פריימר אם המוטציה הוא הציג בקצה 5' או להעביר אם המוטציה הוא הציג בקצה 3'.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עיצוב צבעי יסוד 3-צעד PCR.<ol>
<li>עיצוב פריימר 1 ו- 4 כדי להגביר את ה-DNA של עניין ועם של 5' בולט זה מכיל נוקלאוטידים 4 (למשל, האישיות של או AGCT) ואחריו האתר זיהוי הגבלת הרלוונטי הדרוש לשבט לתוך הווקטור שבחרת.</li>
		<li>עיצוב פריימר 2 ו- 3 כדי להציג את mutation(s) על האתר הרצוי ולאגף את המוטציה על ידי 10-15 נוקלאוטידים משלימים משני הצדדים. פריימר 2 ו- 3 הינם הפוך משלימים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. PCR הגברה של פראי סוג דנ א לקראת שיבוט
הערה: לקבלת פרטים אודות ה-PCR, ראה6.
<ol><li>לבצע PCR6 באמצעות תחל 1 + 2 (2-צעד PCR) או 1 + 4 (3-צעד PCR) ולהשתמש פראי סוג DNA כתבנית כדי להשיג PCR מוצר אני השתמש בתוכנית ה-PCR טבלה 1.</li>
	<li>אמת PCR על-ידי agarose בג'ל.<ol>
<li>להפוך את agarose ג'ל פתרון (2%) על-ידי הוספת 2 גר' agarose לכל 100 מ ל 1 x טריס-אצטט-ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) (טה) המאגר. להמיס את agarose על ידי הרתחה בתנור מיקרוגל. להוסיף מכתים DNA לצבוע אתידיום ברומיד (כדי ריכוז סופי של ~ 0.5 µg/mL) כדי agarose ג'ל פתרון עבור פריט חזותי.</li>
		<li>יציקה agarose ג'ל, מניחים אותה יחידת אלקטרופורזה, וטען PCR (מעורבב עם טעינת ה-DNA צבען) ודוגמאות סולם הדנ א של גודל ידוע. לפעול דגימות בהספק של 75 וואט במשך 45 דקות, או עד להקות מופרדים כראוי, ותנסו לדמיין את להקות בשולחן אולטרה סגול (UV) או עם ג'ל מערכת הדמיה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לטהר את המוצר PCR עם ערכת חילוץ ג'ל (טבלה של חומרים) ומדידת הריכוז של DNA מטוהרים עם ספקטרופוטומטרים (טבלה של חומרים).</li>
	<li>חנות ה-DNA מטוהרים ב-20 ° C (במאגר טריס-EDTA (TE) – אחסון לטווח ארוך) או 4 ° C (ב- dH2O – אחסון לטווח קצר) רק בשימוש בשלב 5.</li>
</ol>4. PCR להציג את האתר מכוון מוטציות ב- DNA
<ol><li>PCR עבור 2-שלב ה-PCR (ראה שלב 4.2 עבור 3-צעד PCR)<ol>
<li>לבצע PCR6 באמצעות תחל 1 + 2 אם מוטציות הם בקצה 5' או 2 + 3 אם מוטציות נמצאים 3' קץ ולהשתמש דנ א פראי סוג כתבנית כדי לקבל מוצר ה-PCR II (ראה טבלה 1 לתוכנית ה-PCR).</li>
		<li>אמת PCR על-ידי agarose בג'ל כמו שלב 3.2.1 3.2.2.</li>
		<li>לטהר את המוצר PCR עם ערכת חילוץ ג'ל (טבלה של חומרים) ומדידת הריכוז של DNA מטוהרים עם ספקטרופוטומטרים (טבלה של חומרים).</li>
		<li>חנות טהור DNA ב-20 ° C (במאגר טה) או 4 ° C (ב- dH2O) רק בשימוש בשלב 5.</li>
		<li>לבצע PCR6 באמצעות PCR המוצר השני כמו ומהצמיגים יחד עם פריימר 3 אם מוטציות נמצאים 5' קצה או פריימר 1 אם מוטציות בקצה 3' ושימוש פראי סוג DNA כתבנית כדי לקבל מוצר ה-PCR השלישי (ראה טבלה 1 לתוכנית ה-PCR).</li>
		<li>אמת PCR על-ידי agarose בג'ל כמו שלב 3.2.1 3.2.2.</li>
		<li>לטהר המוצר PCR עם ערכת חילוץ ג'ל (טבלה של חומרים) ומדידת הריכוז של ה-DNA מטוהרים עם ספקטרופוטומטרים (טבלה של חומרים).</li>
		<li>חנות טהור DNA ב-20 ° C (במאגר טה) או 4 ° C (ב- dH2O) עד שלב 5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR עבור 3-צעד PCR<ol>
<li>לבצע PCR6 באמצעות תחל 1 + 2 ו- 3 + 4 תגובות נפרדות ולהשתמש פראי סוג DNA כתבנית כדי לקבל מוצר ה-PCR II ו- III (ראה טבלה 1 לתוכנית ה-PCR).</li>
		<li>אמת מותני על-ידי agarose בג'ל כמו שלב 3.2.1 3.2.2.</li>
		<li>לטהר PCR מוצרים עם ערכת חילוץ ג'ל (טבלה של חומרים) ומדידת הריכוז של DNA מטוהרים עם ספקטרופוטומטרים (טבלה של חומרים).</li>
		<li>חנות טהור DNA ב-20 ° C (במאגר טה) או 4 ° C (ב- dH2O).</li>
		<li>לבצע PCR6 באמצעות תחל 1 + 4 ולהשתמש נג 2-5 של שני המוצרים PCR II ו- III כתבניות (ב אותה התגובה) כדי להשיג PCR המוצר הרביעי (ראה טבלה 1 לתוכנית ה-PCR).</li>
		<li>אמת PCR על-ידי agarose בג'ל כמו שלב 3.2.1 3.2.2. הערה: זה לא יוצא דופן לקבל מספר להקות שגוי (לפעמים ניתן להפחית באמצעות תבנית פחות). עם זאת, ניתן להתעלם המוצרים PCR שגוי אם הלהקה בגודל הנכון הוא טוחנות, ג'ל, חילוץ.</li>
		<li>אם זה נכון, לטהר את מוצר ה-PCR עם ערכת חילוץ ג'ל (טבלה של חומרים) ומדידת הריכוז של ה-DNA מטוהרים עם ספקטרופוטומטרים (טבלה של חומרים).</li>
		<li>חנות טהור DNA ב-20 ° C (במאגר טה) או 4 ° C (ב- dH2O) עד שלב 5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. רקומבינציה וסוג הפרוע הגירסאות מוטציה של ה-DNA לתוך הווקטור שבחרת.
הערה: לקבלת פרטים אודות ביצוע השלבים, ראה7.
<ol><li>תקציר מטוהרים PCR מוצרים I ו- III (מ- 2-צעד PCR) ו/או הרביעי (מתוך 3-צעד PCR) באמצעות אנזימי הגבלה הרלוונטיים את.<ol>
<li>ב 20 µL 1 x עיכול מאגר עם µL 1 של כל אנזים הגבלה, תקציר 200 ng של מוצר ה-PCR ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30-60 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לטהר המוצר PCR מתעכל על ידי ג'ל-חילוץ באמצעות ערכת חילוץ ג'ל (טבלה של חומרים), מודדים את ריכוז הדנ א של DNA מטוהרים עם ספקטרופוטומטרים (טבלה של חומרים) ו לאחסן ב-20 ° C (במאגר טה) או 4 ° C (ב- dH2 O) עד המשמש שלב 5.6.</li>
	<li>לעכל את וקטור מטוהרים עם אנזימי הגבלה הרלוונטיים ולנהוג עם אלקליין פוספטאז כדי להקטין את וקטור מצדו מחדש אירועים. אל תתייחס PCR מוצרים עם phosphatase אלקליין.<ol>
<li>ב- µL 30 1 x עיכול מאגר עם µL 1 של כל אנזים הגבלה, µL 1 של phosphatase אלקליין, תקציר 1,000 ng של וקטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30-60 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>וקטור מתעכל נפרד מ- DNA פסולת (למשל, וקטור נימולים, לגזור את הדנ א) שימוש בג'ל agarose כמו שלב 3.2.1 3.2.2.</li>
	<li>לטהר וקטור מתעכל על ידי ג'ל-חילוץ באמצעות ערכת חילוץ ג'ל (טבלה של חומרים), למדוד את ריכוז הדנ א של ה-DNA מטוהרים עם ספקטרופוטומטרים (טבלה של חומרים) ו לאחסן ב-20 ° C (במאגר טה) או 4 ° C (ב- dH2O) עד לשימוש שלב 5.6.</li>
	<li>מאתרים ומפסיקים את מוצרי ה-PCR מתעכל לתוך וקטור מתעכל עם תגובות המצוין בטבלה מס ' 2.</li>
	<li>דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים או לילה ב-16 ° c</li>
	<li>להפוך הנמען זן (למשל, e. coli K12) עם תגובות מצדו.<ol>
<li>לגדול עומס יתר600= 0.3-0.5 והעברה 1 מ"ל תרבות כדי צינורות 1.5 mL רבים כמו תגובות ליגאז.</li>
		<li>ספין-x 3,500 g עבור 5 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>Resuspend תאים μL 200 מאגר טרנספורמציה (10 מ"ל של מרק lysogeny (ליברות) עם 0.1 g/mL פוליאתילן גליקול 3350, 5% דימתיל סולפט ו 20 מ מ MgCl2).</li>
		<li>הוסף תגובה מצדו, במקום הצינורות על קרח למשך 30 דקות.</li>
		<li>מכת חום למשך 2 דקות ב 42 º C.</li>
		<li>להוסיף 1 מ"ל של LB הצינורות 1.5 מ ל, וכן לאפשר ביטוי פנוטיפי של עמידות לאנטיביוטיקה לפחות 45 דקות ב 37 º C.</li>
		<li>לסובב את התאים ב 3,500 x g למשך 5 דקות, למחוק 1 מ"ל של תגובת שיקוע ולאחר resuspend התאים תגובת שיקוע הנותרים.</li>
		<li>צלחת את התאים על צלחות עם אנטיביוטיקה מתאימה, דגירה בין לילה ב 37 º C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>זהה transformants מחסה וקטורים עם האינטגרציה המוצלחת של ה-DNA הוספה (לדוגמה, על ידי ה-PCR באמצעות תחל ספציפיים וקטוריים או הוספה).</li>
	<li>לאמת את רצף ה-DNA על ידי סנגר רצף. התראה: לא להשתמש תחל את אותו רצף משמש עבור שלב 5.9.</li>
</ol>6. שימוש את הווקטורים נבנה עבור ניסויים במבחנה ו/או ויוו
<ol><li>ניסוי in vivo הערה: זה דוגמה לשימוש וקטור לבטא פראי סוג מוטציה RNA לאפיין תקנה post-transcriptional. ראו פרטים נוספים על סופג המערבי,8.<ol>
<li>גדלים זנים K12 e. coli עם וקטורים נבנה בינוני המתאים, זירוז ביטוי במידת הצורך. דוגמאות הקציר על ידי צנטריפוגה.</li>
		<li>הכין דוגמיות נתרן dodecyl סולפט – לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד) על ידי המסת תא כדורי 1 x מרחביות דוגמת המאגר (62.5 מ"מ טריס-HCl pH 6.8, 2.5% מרחביות, 0.002% bromophenol כחול, β-mercaptoethanol 5%, 10% גליצרול) והרתיחו ב 95 ° C 5 min. הערה: זה אפשרי להטיל ג'ל או להשתמש ג'ל precast זמינים מסחרית. האחרון היה בשימוש התוצאות המוצג באיור 3 (טבלה של חומרים).</li>
		<li>לטעון 107 תאים של כל מדגם בבארות נפרדים, (כולל סולם חלבון), ולהפעיל ג'ל ב- 200 וולט עד החלבונים מופרדים (כ- 45 דקות).</li>
		<li>למחוק את החלבונים על תאית-קרום בהעברה חצי יבש 80 mA לשעה.</li>
		<li>לחסום את הקרום עם תערובת של חלבונים (למשל, 5%-אבקת חלב מומס 1 x Tween 20 טריס-באגירה מלוחים (TTBS) מאגר).</li>
		<li>מוסיפים נוגדן הראשי (מומס 1 מאגר x TTBS) המטרה החלבון עניין (למשל, ה-GFP-, דגל או חלבון מתויג שלו), תקופת דגירה של h 1 עם עצבנות עדין.</li>
		<li>רחץ ממברנה ב 1 x TTBS 10 דקות להסיר את הנוגדנים לא מאוגד. חזור פעמיים יותר.</li>
		<li>הוספת נוגדן המשני (מומס 1 מאגר x TTBS) שמכוונת את הנוגדנים הראשי ולאפשר איתור (למשל, חזרת peroxidase (HRP)-מצומדת נוגדנים משניים. תקופת דגירה של h 1 עם עצבנות עדין.</li>
		<li>לשטוף את הקרום ב 1 x TTBS 10 דקות להסיר את הנוגדנים לא מאוגד. חזור פעמיים יותר.</li>
		<li>המחש את הקרום בעזרת טכניקה תואם הנוגדנים משני (למשל, על-ידי הדמיה לאחר דגירה עם chemiluminescence נגזר הלומינול, אם נוגדנים משניים מצומדת HRP היה בשימוש).</li>
	</ol>
</li>
	<li>ניסויים במבחנה הערה: זוהי דוגמה של שימוש וקטור כתבנית עבור הפריה שעתוק RNA לאפיון אינטראקציות חלבון ה-RNA. ראו פרטים נוספים על EMSA,9.<ol>
<li>להפוך תעתיקים במבחנה באמצעות T7 חוץ גופית שעתוק קיט (טבלה של חומרים), וקטורים משלב 5 כתבניות.</li>
		<li>נפרדים תעתיקים RNA מאת דף על אוריאה שבעה מ' 4.5% denaturing ג'ל ולאחר לחלץ RNA ישירות מן הג'ל על-ידי אלקטרו • תנאי עם דיאליזה צינורות (טבלה של חומרים).</li>
		<li>תווית ה-RNA (למשל, radiolabeling עם γ -32P-ATP באמצעות T4-polynucleotide קינאז (טבלה של חומרים) ולטהר שוב עם עמודות (טבלה של חומרים). התראה: לפני עבודה עם חומר רדיואקטיבי, התייעץ עם הקצין בטיחות קרינה מקומית.</li>
		<li>מערבבים מתויג-RNA עם ריכוז חלבון נפרד בתגובות 1 x מחייבת מאגר (20 מ מ טריס, pH 8, 100 מ מ אשלגן כלורי, 1 מ MgCl2, dithiothreitol 1 מ מ (DTT)). הערה: בתוצאות הציג (איור 4), 2 nM של csgD radiolabeled mRNA היה מעורב עם שיפוע של 0 עד 2 מיקרומטר Hfq חלבון (ריכוז מונומר).</li>
		<li>לאפשר חלבון ו- RNA hybridize לפני טעינת הכלאה תערובת על ג'ל לזיהוי ללא denaturing ולהפעיל את הג'ל על 1.5 h ב- 200 וולט.</li>
		<li>דמיינו את הג'ל עם טכניקה תואם עם תיוג מהשלב 6.1.3. (למשל, על-ידי phosphoimaging אם radiolabeling היה מוחל).</li>
		<li>לכמת שהבוטות היחסית של הלהקות שהוסטו לדימות עיבוד תוכנית ובכושר עקומה (sigmoidal) על הנתונים באמצעות גרף ותוכנה ניתוח נתונים (טבלה של חומרים). בהתבסס על העקומה מצויד, ערכים (דK) קבוע דיסוציאציה יכול להיקבע באופן אוטומטי עם התוכנה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Bouvier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA+binding+to+5%27+mRNA+coding+region+inhibits+translational+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation.</a> Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).</li>
<li>Jorgensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+regulatory+RNAs+control+the+multi-cellular+adhesive+lifestyle+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbioly%22%5BJournal%5D)">Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li>
<li>Antal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+bacterial+RNA+regulates+a+putative+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).</li>
<li>Andreassen, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sRNA-dependent+control+of+curli+biosynthesis+in+Escherichia+coli%3A+McaS+directs+endonucleolytic+cleavage+of+csgD+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA.</a> Nucleic Acids Research. , (2018).</li>
<li>Thomason, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+RNA+that+regulates+motility+and+biofilm+formation+in+response+to+changes+in+nutrient+availability+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbioly%22%5BJournal%5D)">A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+%28EMSA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA).</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li>Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+site-specific+mutagenesis+without+phenotypic+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).</li>
<li>Laible, M., Boonrod, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homemade+site+directed+mutagenesis+of+whole+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li>
<li>Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cassette+mutagenesis%3A+an+efficient+method+for+generation+of+multiple+mutations+at+defined+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites.</a> Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
</ol>

המחברים מצהירים אין אינטרסים מתחרים.

מוטגנזה יש מגוון רחב של יישומים שונים, כאן, התוצאות נציג של ויוו, ניסוי המבחנה נכללו בתור דוגמאות כיצד להפוך את מסקנות ביולוגי בטכניקה. מוטגנזה כבר זמן רב תקן הזהב ללימודי אינטראקציה RNA. כוחה של השיטה טמון השילוב של היכרות עם מוטציות הרלוונטיים עם מבחני במורד הזרם, ניסויים (למשל, תספיג או EMSA) כדי להסיק מסקנות לגבי אתרים DNA ספציפיים וחשיבותן בפונקציות ג'ין-מוצרים שאלה. כאשר אתה מחליט לעשות מוטגנזה, העיצוב של צבעי בסיס צריך להיות תכננה בקפדנות כדי להשיג את המרב של הטכניקה (למשל אילו אתרים להפוך למוטציות); הקפד נמנים המ...

הדנ א הוא המכונה לעתים קרובות ה-blueprint של תא חי מאז מבני התא מקודדים את רצף ה-DNA שלו. שכפול מדויק מנגנוני תיקון DNA על מנת להבטיח כי רק מאוד נמוכים של מוטציות מתרחשות, שהוא חיוני לקיום פונקציות הנכון של גנים מקודד. שינויים של רצף הדנ א יכול להשפיע על פונקציות רציפות ברמות שונות החל עם ה-DNA (זיהוי על-ידי גורמי שעתוק, אנזימי הגבלה), ואז RNA (זוג בסיסים משלימים את החסר והשינויים מבנה שניוני) ו/או חלבון (אמינו החלפות חומצה, מחיקות, תוספות או מסגרת-משמרות). בעוד מוטציות רבות אינן משפיעות על תפקוד הגן באופן משמעותי, יש מוטציות ב- DNA יכולים להיות השלכות ענקיות. לפיכך, מוטגנזה הוא כלי רב ערך עבור לומד את החשיבות של אתרים DNA ספציפיים בכל הרמות.
פרוטוקול זה מתאר גישה מוטגנזה מכוונת יישוב נוהג להציג מוטציות ספציפיות. הפרוטוקול מסתמכת על שתי אסטרטגיות שונות של ה-PCR: צעד 2 או של PCR 3-צעד. 2-שלב ה-PCR ישימה אם המוטציה הרצוי קרוב בקצה 5' או 3' הסוף של ה-DNA של הריבית (< 200 בסיסי זוגות (bp) מסוף) ואת ה-PCR 3-צעד ישימה בכל המקרים.
בגישה PCR דו-שלבי, תחל 3 מיועדים שבו ערכה אחת של תחל נועד להגביר את ה-DNA של הריבית (primers 1 ו- 3, קדימה, הפוך, בהתאמה), יחיד פריימר נועדה לשלב את המוטציה. המוטציה היכרות עם פריימר (פריימר 2) צריך להיות כיוון הפוך, אם המוטציה קרוב לסוף 5', כיוון קדימה אם המוטציה קרוב בקצה 3'. בשלב הראשון PCR, פריימר 1 + 2 או 3 2 + מגביר קטע קטן קרוב 5' קצה או 3' בסוף, בהתאמה. PCR ובמוצר משמשת פריימר בשלב שתיים עם פריימר 1 או 3, ובעקבותיה במוצר ה-PCR עם מוטציה ב- DNA של עניין (איור 1 א').
ב- PCR 3-צעד, תחל 4 מיועד, שבו ערכה אחת של תחל נועד להגביר את ה-DNA של הריבית (primers 1 ו- 4, קדימה, הפוך, בהתאמה), סט צבעי יסוד אחד נועדה לשלב מוטציות ספציפיות עם חופפים משלימים את החסר (תחל 2 ו- 3, הפוך, קדימה, בהתאמה). בשלב הראשון והשני, תחל 1 + 2 ו- 3 + 4 להגביר בקצה 5' ו 3'. בשלב 3, מוצרי ה-PCR וכתוצאה מכך צעד ראשון, שני משמשים כתבניות ומצויים מוגבר עם תחל 1 + 4. לכן, ובמוצר PCR הוא ה-DNA של עניין עם המוטציה הרצוי (איור 1B).
בעוד ה-DNA מוטציה יכול לשמש עבור כל יישום במורד הזרם, פרוטוקול זה מתאר כיצד לשלב את הדנ א מחדש לתוך השיבוט וקטור. השימוש של שיבוט וקטורים יש מספר יתרונות כגון הקלות של שכפול ויישומים ספציפיים ניסיוני תלוי בתכונות של וקטור. תכונה זו משמשת לעתים קרובות ללימודי אינטראקציה עם ה-RNA. טכניקה נוספת ללימודי אינטראקציה עם ה-RNA היא חיטוט מבנית של הרנ א במתחם עם עוד RNA1,2 או חלבון3,4. עם זאת, חיטוט מבניים מבוצעת רק במבחנה ואילו מוטגנזה ו שיבוט עוקבות לאפשר ללימודי אינטראקציה ויוו.
מוטגנזה בהרחבה שימש לחקר אינטראקציה RNA כפי שהוצג כאן. עם זאת, שיטת המפתח לגבי 2 או 3-צעד PCR החלים על כל פיסת דנ א, ובכך לא רק מוגבל ללימודים RNA-אינטראקציה.
כדי להדגים את הטכניקה ואת השימושים האפשריים שלו, משמש אפיון אזורי חשוב post-transcriptional ויסות mRNA, csgD, של Escherichia coli (e. coli). ב e. coli, csgD מכוון על ידי קטן ללא קידוד RNA, McaS, בשיתוף עם חלבון, Hfq, להדחיק חלבון-ביטוי של4,2,CsgD5. הטכניקה משמשת כדי להציג מוטציות באזור בסיס תיאום בין csgD לבין McaS, לאתר איגוד Hfq של csgD. ה-DNA שהושג לאחר מכן שוכפל לתוך וקטור מתאים לניסויים הבאים יישומים במורד הזרם של הטכניקה כוללים ניסויים במבחנה וגם ויוו. להמחשה, דוגמה 1 מאופיין ויוו שימוש assay תספיג והוא דוגמה 2 מאופיין במבחנה באמצעות assay משמרת של ניידות electrophoretic (EMSA). בשני המקרים, זה מאויר איך מוטגנזה יכול לשמש בשילוב עם טכניקות אחרות כדי להפוך ביולוגי מסקנות לגבי הגן עניין.

<table><tbody><tr><td>נוגדן Anti-GroEL המיוצר בארנב</td><td>Merck</td><td>G6532</td><td>נוגדן ראשוני</td></tr><tr><td>Azure c200</td><td>Azure</td><td>NA</td><td>Gel הדמיית תחנת עבודה</td></tr><tr><td>מותאמת אישית DNA</td><td>oligo Merck</td><td>VC00021</td><td></td></tr><tr><td>DeNovix DS-11</td><td>DeNovix</td><td>NA</td><td>ספקטרופוטומטר למדידות חומצות גרעין</td></tr><tr><td>DNA ג'ל טעינת צבע (6X)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת אתידיום ברומיד 1</td>% <td>קארל רוט</td><td>2218.1</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל GeneJET</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0691</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler DNA סולם תערובת</td><td>תסיסה</td><td>SM0333</td><td></td></tr><tr><td>Gerard GeBAflex-tube Midi Gerard</td><td>Biotech</td><td>TO12</td><td>צינורות דיאליזה לפליטה אלקטרו</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 ערכת תמלול</td><td>Invitrogen</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1704406</td><td>מערכת אלקטרופורזה אופקית</td></tr><tr><td>נוגדן חד-שבטי ANTI-FLAG M2 המיוצר בעכבר</td><td>Merck</td><td>F3165</td><td>נוגדן ראשוני</td></tr><tr><td>אימונוגלובולינים של עכבר</td><td>Dako Cytomation</td><td>P0447</td><td>HRP נוגדן משני מצומד</td></tr><tr><td>NucleoSpin miRNA</td><td>Macherey Nagel</td><td>740971</td><td>טיהור RNA</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris ג'לי חלבון</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0323BOX</td><td>Bis-Tris ג'לים להפרדת חלבונים</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix עם HF Buffer</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0531S</td><td>DNA פולימראז</td></tr><tr><td>PowerPac HC ספק כוח זרם גבוה</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td></td></tr><tr><td>ארנב אימונוגלובולינים</td><td>Dako Cytomation</td><td>P0448</td><td>HRP מצומד נוגדן משני</td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>SigmaPlot</td><td>Systat Software Inc</td><td>NA</td><td>כלי תוכנה לניתוח גרפים ונתונים</td></tr><tr><td>T100 Thermal</td><td>Cycler Bio-Rad</td><td></td><td>1861096 PCR מכונת T4</td></tr><tr><td>DNA ligase</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0202</td><td>Ligase</td></tr><tr><td>T4 פולינוקלאוטיד Kinase</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>חוצץ TAE (Tris-אצטט-EDTA) (50X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>B49</td><td></td></tr></tbody></table>

מוטגנזה עבור במבחנה, בניסויים vivo ביטוי עם אינטראקציות rna ב- escherichia coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

מוטגנזה היא טכניקה המשמשת להציג ספציפי מוטציות ב- DNA כדי לחקור את האינטראקציה בין מולקולות חומצה ריבונוקלאית (sRNA) קטנות ללא קידוד RNAs שליח היעד (mRNAs). בנוסף, מוטגנזה משמש כדי למפות אתרי קישור ספציפי חלבון ה-RNA. הקדמה PCR המבוסס על שלבים 2 ו- 3-צעד של מוטציות מתואר. הגישה היא רלוונטי כל חלבון-RNA ולימודי אינטראקציה RNA-RNA. בקיצור, השיטה מסתמכת על עיצוב תחל עם mutation(s) הרצויה, 2 או 3. הצעדים של ה-PCR סינתזה של מוצר ה-PCR עם המוטציה. המוצר PCR משמש לאחר מכן לקראת שיבוט. כאן, אנו נתאר כיצד לבצע מוטגנזה עם הגישה 2 - ו 3-צעד שני להציג מוטציות של sRNA, McaS של ה-mRNA, csgD, לחקור RNA-RNA ו- RNA חלבונים. אנו מיישמים את הטכניקה הזו לחקור אינטראקציות RNA; עם זאת, השיטה היא החלים על כל לימודי מוטגנזה מכוונת (למשל, אינטראקציות חלבון-דנ א, חומצה אמינית החלפת/מחיקה/הוספה). ניתן להציג כל סוג של מוטציה חוץ בסיסים הלא טבעי אבל הטכניקה ישימה רק אם מוצר ה-PCR יכול לשמש עבור יישום במורד הזרם (למשל, שיבוט, תבנית נוספת PCR).

לחקור RNA אינטראקציות מנשר post-transcriptional של csgD, מלכודת וקטור זוגי נבחר: אחד לבטא את csgD mRNA ועוד לבטא את קטן ללא קידוד RNA, McaS. csgD היה משובטים לתוך pBAD33, אשר הוא אראבינוז, inducible פלסמיד בינוני-העתק בהתנגדות כלורמפניקול, McaS היה משובטים לתוך מיני pNDM220 R1, אשר הוא פלסמיד inducible עותק נמוך איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) עם אמפיצילין ההתנגדות. פראי סוג csgD היה PCR מוגבר באמצעות תחל 1A ו- 4A (4A כולל דגל-רצף) להניב P...

מוטגנזה היא טכניקה המשמשת להציג מוטציות ספציפיות חומצה deoxyribonucleic (DNA). פרוטוקול זה מתאר איך לעשות מוטגנזה בצעד 2, 3-צעד תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) המבוסס על הגישה, אשר חלים על כל מקטע DNA עניין.

מוטגנזה עבור במבחנה, בניסויים Vivo ביטוי עם אינטראקציות RNA ב- Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

mutagenesis מכוון האתר שימושי לחקר אינטראקציות מולקולריות, כגון RNA-RNA, אינטראקציות חלבון RNA. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע mutagenesis המכוון לאתר עם גישת PCR דו-שלבים או תלת-שלבים. היתרונות העיקריים של השיטה הם מגוון של מוטציות שונות שניתן לשלב, כמו גם קלות יחסית ועלות לעשות זאת.כדי להתחיל, השתמש בתבנית ה- DNA של סוג הפרא ובזוגות פריימר שניים, אחד ושניים, שלושה, ספציפיים לזוגות דו-שלביים או פריימר שלושה, אחד ושלוש, ארבעה, ספציפיים עבור PCR תלת-שלבי כדי להשיג מוצר PCR אחד. כדי לאמת מוצרי PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל אגרוז, לעשות 2% agarose ג'ל על ידי המסת שני גרם של אגרוז ב 100 מיליליטר של חיץ TAE 1X, באמצעות תנור מיקרוגל. מוסיפים אתידיום ברומיד בריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם למיליליטר.ואז להטיל את הג'ל אגרוז. כאשר הוא מועשר, מקם אותו ביחידת אלקטרופורזה. לטעון סולם DNA בגודל ידוע, ואת דגימות PCR מעורבב עם DNA טעינת צבע לתוך בארות.הפעל דגימות ב 75 וולט במשך 45 דקות. ולדמיין רצועות על טרנסילומינטור UV או עם מערכת הדמיה ג'ל. לאחר מכן, לטהר את המוצר PCR עם ערכת מיצוי ג'ל על פי פרוטוקול היצרנים ולמדוד את הריכוז של DNA מטוהרים עם ספקטרופוטומטר.לאחר מכן אחסן את הדנ"א המטוהר במינוס 20 צלזיוס במאגר TE. כדי להתחיל mutagenesis מכוונת האתר עם PCR 2-שלב, תחילה להשתמש בתבנית DNA מסוג פראי, לאחר מכן פריימר זוגות שתיים, אחת ושתיים, שתיים, עבור חמש מוטציות פריימר, או זוגות פריימר שתיים, שתיים, ושתיים, שלוש עבור שלוש מוטציות priment כדי להשיג מוצר PCR 2. לאמת את מוצר PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל, לטהר את המוצר PCR, ולמדוד את הריכוז שלה כמתואר קודם לכן.לאחר מכן השתמש בתבנית ה- DNA מסוג פראי ובתוצר PCR 2 כ- primer, יחד עם פריימר 2, שלושה לחמישה מוטציות ראשוניות, או פריימר 2, אחד לשלוש מוטציות ראשוניות, כדי להשיג מוצר PCR 3. לאמת את מוצר PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל, לטהר את המוצר PCR, ולמדוד את הריכוז שלה כמתואר קודם לכן. לאחר מכן אחסן את הדנ"א המטוהר במינוס 20 מעלות צלזיוס במאגר TE.כדי להתחיל mutagenesis האתר ישיר עם PCR 3 שלבים, תחילה להשתמש בתבנית ה-DNA מסוג פראי זוגות פריימר שלוש, אחד, ושלוש, שניים כדי להשיג מוצר PCR 2. השתמש בתבנית ה- DNA מסוג Wild ובזוגות פריימר שלוש, שלוש ושלוש, ארבע, כדי להשיג מוצר PCR שלוש. השתמש בתבנית ה- DNA של סוג הפרא ובזוגות פריימר שלוש, שלוש ושלוש, ארבע, כדי להשיג מוצר PCR שלוש.לאמת את מוצר PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל, לטהר את המוצר PCR, ולמדוד את הריכוז שלה כמתואר קודם לכן. לבסוף להשתמש שניים עד חמישה ננוגרם של מוצרי PCR שתיים ושלושה כתבנית יחד עם זוגות פריימר שלוש, אחת ושלוש, ארבע, כדי להשיג מוצר PCR ארבע. לאמת את מוצר PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל, לטהר את המוצר PCR, ולמדוד את הריכוז שלה כמתואר קודם לכן.אחסן את הדנ"א המטוהר במינוס 20 מעלות צלזיוס במאגר TE. במחקר זה, mutagenesis 2-שלב ו 3-שלבים מכוונת האתר שימשו כדי לחקור אינטראקציות RNA לגבי ויסות שלאחר שעתוק של CsgD. CsgD מסוג פראי היה PCR מוגברת כדי להניב PCR מוצר IA, ואת mcaS מסוג פראי היה PCR מוגברת להניב PCR המוצר IB. באמצעות אסטרטגיית PCR תלת-שלבי, מוצרי PCR IIA ו- IIIA היו מסונתזים בשני השלבים הראשונים, ו- IVA בשלב השלישי כדי להציג מוטציות ב- CsgD.באופן דומה, מוטציות מכוונות אתר חינם הוכנסו mcaS להניב מוצרי PCR IIB, IIIB, בשני השלבים הראשונים, ו IVB בשלב השלישי. ניתוח כתם מערבי הראה כי בעוד ביטוי של mcaS מסוג פראי מונע תרגום של CsgD מסוג פראי, מוטציות ב- mcaS או CsgD מקלות על הדיכוי שנצפה. עם זאת, מוטציות הן CsgD והן mcaS למנוע תרגום של CsgD.באמצעות אסטרטגיית PCR דו-שלבי, מוצרי PCR IIC, IID, IIE, IIF ו- IIG, היו מסונתזים בשלב הראשון, ומוצרי PCR IIIC, IIID, IIIE, IIIF ו- IIIG, בשלב השני כדי להציג מוטציות ל- DNA CsgD כולו. תוצאות EMSA של איגוד HFQ ל- CsgD מועתק במבחנה ו- RNAs מוטנטים, מסונתז באמצעות מוצרי PCR IIIC, IIID, IIIE, IIIF, ו- IIIG, הראו את ערכי KD מוגברת של אללים מוטנטים. זה הוכיח כי HFQ יכול להיקשר פחות ביעילות למוטנטים.יתר על כן HFQ יש מספר אתרי איגוד על CsgD, אשר מוצג על ידי שלוש משמרות שנצפו עבור RNA מסוג פראי. עם זאת, רק שני אתרי איגוד נצפו עבור RNAs מוטנטים שונים. לפיכך, הגישה המוטציה המכוונת לאתר מזהה מבנים ראשוניים או משניים של ה- CsgD mRNA החשובים לכריכה מלאה של HFQ.השיטה עבור mutagenesis האתר המתואר כאן מסתמך על PCR. נוהלי PCR טובים הם חיוניים עבור השיטה עשוי לדרוש אופטימיזציה כדי להצליח. מוטגנזה מכוונת אתר היא רק חזקה עם כל שלוש השיטות כגון EMSA ו- Blotting המערבי.שיטות אחרות, למשל, כוללות מים מבניים שונים וכמה תדות פעילות, ומחקרי שינוי בתרגום פוסט.

site-directed-mutagenesis-for-vitro-vivo-experiments-exemplified-with

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

Mutagenesis האתר בבימויו של פלסמידים כולה היא דרך פשוטה ליצור וריאציות שונות במקצת של הפלסמיד המקורי. כאן אנו מדגימים דרך יעילה קל עלות להציג החלפות בסיס לתוך ריאגנטים באמצעות פלסמיד רגיל.

Mutagenesis האתר ביתי בימוי של פלסמידים שלמים

עבודה זו מראה כיצד ליצור כלאיים RNA / DNA ברמה כרומוזומליות ולחשוף העברת מידע גנטי מ-RNA ל-DNA הגנומי בתאי שמרים.

הדור של RNA / DNA כלאיים ב-DNA הגנום על ידי טרנספורמציה באמצעות RNA המכיל oligonucleotides

כאן אנו להדגים פרוטוקול פשוט ליצור ספריה מוטציה אקראית על רצף יעד נתון. אנו מראים כיצד שיטה זו, אשר מבוצעת in vivo של Escherichia coli, יכול להיות יחד עם בחירות פונקציונלי להתפתח פעילות אנזימטית חדשה.

בחירת הפרוטוקולים mutagenesis ו פונקציונאלי אבולוציה מכוונת של חלבונים א coli</em

כאן אנו מתארים in vivo assay mutagenesis למספר קטן של תאי hematopoietic מטוהרים באמצעות מודל עכבר המהונדס לאצי. גן האצים יכול להיות מבודד כדי לקבוע את התדירות, מיקום והסוג של מוטציות DNA באופן ספונטני קם או לאחר החשיפה לgenotoxins.

זיהוי מוטציות DNA בתאי גזע / אב המטוהר Hematopoietic

פרוטוקול זה מתווה את זרימת העבודה של הגן מבוססת על CRISPR/Cas9 עריכת המערכת עבור התיקון של מוטציות נקודה בתרבית של תאים. כאן, אנו משתמשים בגישה קומבינטורית לעריכת ג'ין עם נתונים היסטוריים אסטרטגיה ניסיוני המשכית למדידת ויאסין היווצרות באתר היעד — בעיקרו של דבר, ניתוח מוטגנזה מכוונת באתר.

מתודולוגיה סטנדרטי כדי לבדוק באתר המוטגניות כפונקציה של תיקון נקודת מוטציה על ידי CRISPR/Cas9 ו- SsODN בתאי אדם

מאמר זה מתאר מתודולוגיה מפורט אקראי מוטגנזה מכוונת של גנים היעד בביקוע שמרים. כדוגמה, אנחנו יעד rpt4 +, שמקודד של יחידת משנה של פרוטאוזום 19, וכן מסך מוטציות ביציבותה הטרוכרומטין.

גן במיקוד אקראי מוטגנזה מכוונת לבחירת יציב הטרוכרומטין פרוטאוזום מוטציות שמרים ביקוע

כאן, אנו מציגים שיטה להנדס את הגנום של C. elegans שימוש CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ותבניות תיקון התלויים הומולוגיה.

מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

חלבונים שקושרים רצפי RNA ספציפיים ממלאים תפקידים חיוניים בביטוי הגנים. אפיון מפורט של אתרים אלה מחייב חיוני להבנת הכונה. . הנה, מתואר בגישה צעד אחר צעד עבור מוטגנזה מכוונת רוויה מהאתרים מחייב חלבון ב RNA. גישה זו היא רלוונטית עבור כל האתרים מחייב חלבון ה-RNA.

בגישה מוטגנזה מכוונת רוויה הרומן: אפיון צעד בודד של חלבון תקינה מחייב אתרים ב- RNA באמצעות Phosphorothioates

מטרת כתב היד היא להציג מיתאר למחקרים הביוכימיים והפונקציונליים המקיפים את הליסים של הטבעת. צינור מרובה-צעדים זה, עם פרוטוקולים מפורטים, מאמת פעילות אנזימטית של החלבון שנבדק ומדגים כיצד לקשר את הפעילות לפעולה.

אפיון פונקציונלי של מסוג הטבעת E3 ליגטיות בתוך מבחנה ובפלאנטה

ניתן לפתח את הגבלת הגבלות עם ספציפיות רצף חדש מאנזימים המספרים על רצף מנוון באופן חלקי. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט כי השתמשנו בהצלחה כדי לשנות את הספציפיות הרצף של האנזים NlaIV. מרכיבי המפתח של הפרוטוקול הם ממדר החוץ של התגובה שעתוק/תרגום ומבחר של משתנים עם משתני רצף חדש.

האבולוציה בבימויו של הגבלת מגבלות על הגבלה עם ספציפיות יותר מחמירות

למד מוטגנזה מכוונת אתרים ב-Escherichia coli לחקירת אינטראקציות RNA-RNA ו-RNA-חלבון. שיטת ה-PCR בשני או שלושה שלבים מאפשרת הכנסת מוטציות ספציפיות ביעילות ובעלות נמוכה.

מוטגנזה עבור במבחנה, בניסויים Vivo ביטוי עם אינטראקציות RNA ב- Escherichia Coli

גלה סרטונים נוספים