הפקה של חלקיקים Pseudotyped ללמוד מעוררת פתוגני באווירה אבטחה ברמה 2
March 1st, 2019
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר חלקיקים pseudotyped באווירה BSL-2 שילוב החלבון ספייק של וירוסים פתוגני במזרח התיכון תסמונת נשימתית, מעוררת סארס. החלקיקים pseudotyped מכילים גנים כתב לוציפראז המאפשר כימות של וירוס הערך לתוך התאים מארח היעד.
פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים ליצור וירוסים פסאודוטיפים שניתן להשתמש בהם בבטחה כדי לחקור אירועי כניסה ויראליים של וירוסים פתוגניים מאוד, כגון נגיף הקורונה ורוב נגיף הקורונה. טכניקה רב-תכליתית זו מבוססת על ההתגנות הטרנזיינטית הקלה. מערכת זו יכולה להיות מיושמת גם כדי לייצר חלקיקים מדומה עם חלבוני היתוך של וירוסים אחרים, לא רק וירוס S.לקבלת התוצאות הטובות ביותר חשוב לפקח על בריאות התא וצפיפות עבור transfection, כמו גם עבור זיהום וירוס פסאודוטיפ.
הדגמת הליך זה יהיה טיפאני טאנג, ולאקשמי נתן. סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, לשטוף בזהירות תאי HEK293T עם 10 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס, DPBS מחומם מראש פעמיים.
לאחר מכן, שאפו את התאים העל-טבעיים והצמידו אותם עם מיליליטר אחד של 25% פתרון טריפסין שהתחמם מראש ב-37 מעלות צלזיוס. מ, דגירה הבקבוק של תאים ב 37 מעלות צלזיוס בסביבה 5%פחמן דו חמצני במשך שלוש עד חמש דקות עד התאים מתחילים להתנתק. הוסף ארבעה מיליליטר של DMEM מלא כדי לבטל את הפעלת פתרון טריפסין.
ואז לספור תאים באמצעות שקופית ספירת תאים ומיקרוסקופ אור. לדלל תאים ל 500, 000 תאים למיליליטר עם DMEM מלא. לאחר מכן, זרע שני מיליליטר ל הבאר של פתרון התא בצלחת תרבות רקמות 6-well.
ומזיזים בעדינות את הצלחת קדימה ואחורה מצד לצד כדי לפזר תאים באופן שווה. לאחר שוודא כי התאים מופצים באופן שווה דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני הסביבה לילה או 16 עד 18 שעות. כדי ליצור מראש שלושה cotransfection פלסמיד, הראשון לערבב כרכים מחושבים של פלסמידים ואת מדיום תרבות תא הסרום מופחת בצינור מיקרו צנטריפוגה.
להחגירה את התערובת בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן הוסיפו שלושה מיקרוליטרים ל הבאר של רגנט ההמרה מבוסס השומנים ל-47 מיקרוליטרים ל הבאר של מדיום תרבות תאי הסרום המופחת. להחגירה את התערובת בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.
לאחר מכן, בצינור מיקרו צנטריפוגה, מערבבים כמויות שוות של reagent transfection ואת הפתרונות פלסמיד על ידי צינור כותרת למעלה ולמטה מספר פעמים. הדגירה את התערובת בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. לאחר הדגירה הלי לילה של לוח התא, השתמש במיקרוסקופ אור הפוך כדי לבחון תאים עבור המורפולוגיה והצפיפות שלהם.
לאחר מכן, שאפו את המדיום המושקע של התאים והוסיפו בעדינות מיליליטר אחד ל הבאר של מדיום תרבות תאי הסרום המופחתת החם מראש לכל באר. לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של פתרון transfection לכל גם טיפה חכם. ו דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני במשך ארבע עד שש שעות.
בסוף הדגירה, מוסיפים מיליליטר אחד של DMEM ללא אנטיביוטיקה מחומם מראש, ב 37 מעלות צלזיוס לכל באר. ותגרור את התאים ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו-חמצני למשך 48 שעות. כדי להתחיל אוסף חלקיקי פסאודוטיפ להשתמש במיקרוסקופ אור הפוך כדי לראות את התאים עבור המורפולוגיה שלהם ומצב כללי.
צבע המדיום צריך להיות ורוד בהיר או כתום מעט. לאחר מכן, להעביר את supernatants של התאים מגולפים ל 50 צינורות צנטריפוגה חרוטית מיליליטר. צנטריפוגה הצינורות ב 290 פעמים כבידה במשך שבע דקות כדי להסיר פסולת תא.
לאחר מכן, המסנן הבהיר על-טבעי באמצעות מסנן סטרילי בגודל נקבוביות 0.45 מיקרון. הפוך aliquots נפח קטן של פתרון וירוס פסאודוטיפ בקבוקונים cryo. ולאחסן אותם ב 80 מעלות צלזיוס שליליות.
כדי לבצע זיהום חלקיקים מדומה, תאים הבדיקה הראשונה תחת מיקרוסקופ אור כדי לאשר כי יש שטיח confluent של תאים. לאחר מכן, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 0.5 מיליליטר של DPBS מחומם מראש ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שאפו את העל-טבעיים של התאים וחסן את התאים עם 200 מיקרוליטרים של תווי החלקיקים הפסאודוטיפיים המופשרים.
דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5%פחמן דו חמצני במשך שעה עד שעתיים. לאחר תקופת הדגירה, מוסיפים 300 מיקרוליטרים של DMEMc מחומם מראש ב 37 מעלות צלזיוס. ותדיגר את התאים הנגועים ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו-חמצני למשך 72 שעות.
לבסוף שאף את העל-טבעיים של התאים הנגועים. ולפני ההסתערות של כתבת לוציפראז. כדי לכמת את הזיהום של חלקיקים פסאודוטיפיים הראשון להפשיר מצע לוציפרין, מאוחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס, בזמן חמש זמן לוציפראז assay מאגר תזה מאוחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס לטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, לדלל את מאגר תזה לוציפראז לריכוז פעם אחת עם מים סטריליים. לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של המאגר המדולל לכל באר. ו דגירה בטמפרטורת החדר על נדנדה במשך 15 דקות.
כדי לבצע מדידת פעילות לוציפראז, באר אחת בכל פעם, תחילה להוסיף 20 microliters של מצע לוציפרין לצינור מיקרו צנטריפוגה. לאחר מכן, להוסיף 10 microliters של lysate לצינור. מערבבים את התוכן על ידי תנועה עדין של הצינורות.
והניח את הצינור במכשיר לומינומטר. סגור את המכסה ולמדוד את ערך luminescence של הצינור. רשום את מידת יחידות האור היחסיות ולפני ניתוח נתונים.
תווי ההידביקות של SARS-Spp ו- MERS-Spp בתאים מארחים רגישים, הראו דביקות ממוצעת חזקה, בהשוואה לחלקיקי הבקרה החיוביים הצפויים. בקרות לא נגועות וחלקיקי בקרה שליליים חסרים גליקופרוטאינים מעטפה ויראלית. כמו כן, בדיקת פעילות לוציפראז הראתה תלות בריכוז של דביקות SARS-SPP ו- MERS-Spp.
עלייה של SARS-Spp או MERS-Spp להדביק בתאי יעד מתירניים גרועים, מנוגד לבטא קולטן ACE2 של SARS-Spp, או קולטן DPP4 של MERS-Spp, מאשר כי השימוש הקולטן של pseudovirions דומה לזה של וירוסים נאט"ו לתיווך התקשרות וכניסה של pseudovirions. בדוק שוב חישובים לפני ביצוע שלב זה. וודא שכל הפתרונות מעורבבים היטב במהלך השלב.
בדיקת כתם מערבית יכולה להתבצע על חלקיקים פסאודוטיפיים מרוכזים כדי להעריך את שילוב הגליקופרוטאין בפסאודווירוסים. בעוד החלקיקים המדויפים המתוארים כאן הם תחליפים בטוחים יותר מאשר וירוסי נאט"ו, הם עדיין דורשים אבטחה ביולוגית ברמה 2 אמצעי זהירות.
סקירה
פרוטוקול זה מתאר את יצירת חלקיקים פסאודוטיפיים הכוללים חלבוני ספייק מווירוסי MERS ו-SARS בסביבת BSL-2. חלקיקים אלו מאפשרים את המחקר על כניסת הנגיף לתאי המארח באמצעות גן דוחה לוספראז לצורך כימות.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- וירולוגיה
- ביולוגיה תאית
- מחלות זיהומיות
רקע
- נגיפים פסאודוטיפיים הם מודלים בטוחים יותר לחקר נגיפים פתוגניים.
- הטכניקה מאפשרת בחינת מנגנוני הכניסה הנגיפית.
- תאי HEK293T משמשים בדרך כלל לטרנספקציה והפקת וירוסים.
- מעקב אחר בריאות התאים חיוני להצלחת הטרנספקציה והזיהום.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה בטוחה לחקר הכניסה הנגיפית של MERS ו-SARS.
- לכמת את כושר ההדבקה של החלקיקים הפסאודוטיפיים.
- להעריך את השימוש בקולטנים בפסאודו-וירונים.
שיטות ששימשו
- טרנספקציה של תאי HEK293T עם פלסמידים המקודדים לחלבוני וירוס.
- איסוף וטיהור של חלקיקים פסאודוטיפיים.
- זיהום תאי המטרה עם חלקיקים פסאודוטיפיים.
- מדידת פעילות הלוספראז לכימות כושר ההדבקה.
תוצאות עיקריות
- החלקיקים הפסאודוטיפיים הראו כושר הדבקה חזק בתאי המטרה.
- מבחני הלוספראז הוכיחו תגובה תלויה בריכוז.
- אושר כי השימוש בקולטנים דומה לזה של הווירוסים הטבעיים.
- מבחני ווסטרן בלוט הצביעו על שילוב מוצלח של חלבוני הספייק.
מסקנות
- הפרוטוקול שפותח מספק שיטה אמינה לחקר הכניסה הנגיפית.
- חלקיקים פסאודוטיפיים משמשים כתחליפים יעילים לווירוסים פתוגניים.
- גישה זו יכולה להתאים לווירוסים אחרים מעבר לקורונאווירוסים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D teams to study viral entry mechanisms of highly pathogenic coronaviruses under BSL-2 conditions, reducing containment barriers while maintaining biological relevance. By using pseudotyped particles with luciferase readouts, organizations can efficiently evaluate host susceptibility, tropism, and inhibitor effects in early discovery workflows. The approach supports mechanistic de-risking of entry-targeted therapeutics before committing resources to higher-risk models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of coronavirus spike protein-mediated entry pathways using surrogate particles that mimic native virion behavior.
- Operational Value: Allows screening of receptor usage and entry inhibitors in standard BSL-2 facilities without requiring BSL-3 access.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a quantitative luciferase-based readout to measure infectivity and assess concentration-dependent inhibition of viral entry.
- Operational Value: Supports high-throughput compatible workflows for pseudotype production, purification, and infection using HEK-293T cells.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates assessment of host cell susceptibility and tropism by pseudotyped particles bearing MERS-CoV or SARS-CoV spike proteins.
- Operational Value: Enables cross-functional collaboration between virology, assay development, and pharmacology teams using standardized pseudotype panels.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through mechanistic interrogation of viral entry prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of spike protein function and receptor engagement using pseudotyped surrogates.
- Screening: Enables production of standardized, quantifiable pseudotyped particles for consistent compound screening against viral entry.
- Analytics: Generates luciferase-based luminescence readouts that allow quantitative comparison of infectivity across conditions and inhibitor treatments.
- Translational Research: Connects to preclinical relevance by confirming receptor usage parallels that of native viruses, informing model selection.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform applicable to multiple viral fusion proteins (e.g., influenza HA, Ebola GP) beyond coronaviruses.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in viral entry mechanisms through receptor-specific infection patterns and inhibitor sensitivity profiling.
- Operational Value: Standardized pseudotype production and titration via luciferase assay improves reproducibility across teams and sites.
- Strategic Value: Reduces late-stage attrition by enabling early de-risking of entry-targeted candidates using physiologically relevant surrogates.
- Portfolio Impact: Informs go/no-go decisions on entry inhibitors by providing quantitative data on mechanism of action and potency.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture, transfection, and viral pseudotype production.
- Dependent on access to luminometers and luciferase assay reagents for infectivity quantification.
- Necessitates standardized SOPs for supernatant collection, filtration, and aliquoting to ensure batch consistency.
- Adaptation to non-coronaviral envelope proteins requires validation of pseudotype incorporation and functionality.
- Limited to studying entry steps only; downstream viral life cycle events require complementary methods.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:41
Cell Seeding for Pseudotyped Particle Production
2:05
Three-plasmid Co-transfection
3:53
Pseudotyped Particles Collection
4:46
Pseudotyped Particle Infection
5:54
Infectivity Quantification by Luciferase Assay Readout
7:04
Results: Infectivity Assays of SARS-CoV S and MERS-CoV S Pseudotyped Particles
8:02
Conclusion
