בידוד כימי, כימות, הפרדת שומנים בעור של זוחלים

הפרוטוקול שלנו מאפשר לחוקרים לבודד מולקולות איתות ביו-אקטיביות המשמשות זוחלים בתקשורת כימית. כמו גם הפרדה וטיהור של תרכובות אלה לבדיקות נוספות, או אפילו זיהוי. באמצעות שיטה זו, החוקרים יכולים להשיג מקור של אותות כימיים ולאחר מכן לחלץ אותם עבור כימות שלהם או שימוש bioassay בבידוד.

הדגמת ההליך היום תהיה הולי רוקר, סטודנטית מצטיינת לתזה מהמעבדה שלי. התחל על ידי הצבת חתיכות בריבוע חמישה סנטימטרים לתוך מיכל זכוכית אטום עם מכסה תואם הקסאן והוספת מספיק הקסאן למיכל כדי להטביע באופן מלא את חתיכות העור לשפוך לפני איטום המיכל. למחרת, להשתמש מלכודות מתכת נקיות כדי להסיר את חתיכות לשפוך, לנער את החלקים כפי שהם שנתפסו כדי לשמור על כל הקסאן שנותר בתוך המיכל.

כדי לקבוע את מסת השומנים שחולצו להעביר את התמצית לבקבוקון תחתון משוקל מראש, עגול ולהדליק את מקור הוואקום לאידוי סיבובי לוודא כי לחץ ואקום מספיק כדי להחזיק את הבקבוק לצוואר של המעבה. פתח את פתח האוורור בקצה המרכז, החלק את הבקבוק על צווארו של מעבה, וסגור את פתח האוורור כדי לאטום את המערכת. לאחר שוודא שהבקבוק אינו יכול להתנתק מהתריס בעת השתחררות הבקבוק.

מנמיך את הבקבוק עד שרק 10% התחתונים של הבקבוק נוגעים במים באמבטיה, ומתחילים את הסיבוב במהירות בינונית. אם הוואקום, המהירות, זרימת התיעוב וטמפרטורת האמבטיה אופטימליים, אדי הממס היוצאים מהבקבוק יתרכזו בסליל ויטפטפו לתוך בקבוקון ההתאוששות. להתאדות את המדגם מתחת לוואקום עד חרוז של נוזל עם קוטר של פחות מס"מ אחד נראה בתחתית הבקבוק.

לאחר מכן לכבות את הסיבוב ואקום, ולהרים את הבקבוק מתוך האמבטיה. החזיקו את צוואר הבקבוק עם השתחררות חותם הוואקום, וסובבו את הצוואר לצד הבקבוק מהתריס. חרוז הנוזל בתמצית יתמצית ככל שההקסאן מתאדה.

לאחר שהחרוז התייבש בטמפרטורת החדר במשך כחמש דקות, השומנים יהיו שעווה לבנה עד צהובה שקופה בבקבוקון. לשקול את הבקבוקון כדי להשיג את המסה הסופית ולבודד את השומנים בנפח נרשם של הקסאן להניב מיליגרם אחד או יותר של שומנים לכל מיליליטר אחד של הקסאן. כדי להכין עמוד כרומטוגרפיה, השתמש במוט נדוניה מעץ, ארוך יותר מהעמודה כדי למקם ריבוע של ארבעה על ארבעה סנטימטרים של פיברגלס מקופל בתחתית עמוד כרומטוגרפיה מזכוכית.

אבטחו את העמוד במכסה המנוע של האדים לעמוד טבעת סטנדרטי פתחו את ה-stopcock. לאחר מכן, יוצקים חול שטוף ומיובש לתוך העמוד עד כשלושה סנטימטרים של חול נשען מעל פיברגלס. לאחר מכן, מניחים נייר כהה מתחת לעמודה והקש עליו בעדינות.

עכשיו, מניחים מקור 500 מיליליטר מתחת לעמוד ולאט לאט להרטיב את החול עם כ 25 מיליליטר של הקסאן, סגירת stopcock כאשר יש כ 0.5 ס"מ של הקסאן מעל החול. כדי להפעיל את האיום הניטרלי, פיפטה דיונון מים של נפח שווה 6% של המסה illumina בטיפות ברחבי illumina. ולכסות את הבקבוקון של illumina מופעל, במרץ מערבולת הפתרון כדי לפזר באופן שווה את המטען.

כאשר לא נותרו גושים גלויים של אילומינה, מוסיפים הקסאן עד שהאיומינה מכוסה לחלוטין בכ-0.5 ס"מ של הקסאן. מערבלים את הבקבוק כדי ליצור תרחיף, וממקמים זכוכית חדשה של 500 מיליליטר מתחת לעמוד. פתח את stopcock, ואז מערבולת את illumina שוב, לפני בהתמדה לשפוך את illumina לתוך משפך מאוורר שנערך במאגר של הטור, דואג כי illumina מתיישב באופן שווה בתוך העמוד וכי אין בועות גדולות או סדקים טופס.

העמוד נוצר כאשר החלק העליון של האילומינה יציב וכ-4 ס"מ מתחת לצוואר העמוד בבסיס המאגר. לאחר מכן, השתמשו בפיפלטה כדי לשטוף את פנים המאגר בהקסאן לשאריות אילומה, ומוסיפים בעדינות שכבת חול שנייה על גבי האילומינה לסנטימטר אחד מתחת למאגר. עבור שבר של תמצית השומנים, להשתמש פיפטה זכוכית ארוכה להעביר את דגימת השומנים לטור לאט פיפטה התמצית, כדי למנוע הפרעה שכבת החול.

שוטפים את התמצית הנתעבת בחמישה מיליליטר של הקסאן ומעבירים את הכביסה לעמוד. כאשר כל התמצית נוספה, לפתוח את stopcock ולאפשר את המדגם לטעון לתוך העמודה. לאחר הוספת הדגימה, העמודה חייבת להישאר רוויה בממס.

אם העמודה תתייבש, הדגימה תאבד. מניחים בקבוק תחתון משוקל מראש ומתויגים כעיגול מתחת לעמודה כדי לאסוף את השבר הראשון. ולהשתמש משפך זכוכית מאוורר לשפוך 100% הקסאן בצד המאגר, כדי למנוע הפרעה לשכבת החול.

לאחר מכן, פתח את stopcock כדי להתחיל את elution, סגירת stopcock כאשר כשלושה מיליליטר של הקסאן להישאר מעל החול בחלק העליון של העמוד. ככל שבעלי חיים גדולים יותר מייצרים באופן טבעי יותר שומנים בעור בגלל שטח העור הכולל שלהם, חשוב לתקנן את מסת השומנים המופקת לאורך פתח האוורור של החיה. לאחר מתוקן מסת העור לשפוך הכולל, היחסים ליניארי של מסת השומנים בעור שחולצו עם המסה של העור לשפוך מופק מוסר לחלוטין.

לאחר השבר, ניתן להשתמש באותה גישת סטנדרטיזציה עם ההמונים של השברים הבודדים. לדוגמה, כאן כל שבר אינו תורם באותה מידה למסת השומנים המופקת הכוללת, מכיוון שהשומנים הניטרליים הם הקבוצה הדומיננטית של תרכובות לפי שיעור מסה, בהשוואה לכל קבוצה של שומנים קוטביים יותר. אם זיהוי של תרכובות היא המטרה הסופית, להשתמש בכלי זכוכית נקיים ואתה חייב להימנע פלסטיק כדי למנוע זיהום של הדגימות.

לזיהוי מורכב, כרומטוגרפיה נוזלית או גז, יחד עם ספקטרומטריית מסה ניתן לרדוף לאחר איסוף הדגימות. לחלופין, bioassays יכול להתבצע כדי להבהר את הפעילות הביולוגית של המדגם.