האורך פיזיולוגיים מורפולוגיים ניטור של Spheroids תלת מימדי הגידול באמצעות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית

כדורי גידול תלת מימדיים יכולים לחקות תכונות ספציפיות לרקמות של גידולים ב- vivo, ומספקים נתונים רלוונטיים יותר מבחינה קלינית לגילוי תרופות נגד סרטן מאשר תרבות תאים דו-ממדית פשוטה. טכניקת ההדמיה שלנו, טומוגרפיה קוהרנטית אופטית, יכולה בקלות לדמיין את המבנה תלת-ממדי של עצב גידולי יחיד, בגודל של כמה מאות מיקרון, ולספק אפיון מדויק יותר של המורפולוגיה והתפשטות העבודה שלה, לעתים קרובות תוך שניות ספורות. באמצעות מודל כדורי תלת מימדי אנו יכולים לקצר את ציר הזמן של גילוי התרופה, להפחית את העלות ולהביא תרופות חדשות לחולים בצורה יעילה יותר.

יצירת הצורה הכדורית של אשכול הגידולים היא צעד קריטי בניסוי שלנו. חשוב לבחור את צלחת ההחזקה האולטרה-נמוכה הנכונה עם החלק התחתון העגול, ואת מהירות הצנטריפוגה הנכונה לאחר זריעת התא. התחל ניסוי זה על ידי גידול תאים מעניינים בבקבוק תרבות כמתואר בכתב היד.

לשמור על התאים באינקובטור בתנאים סטנדרטיים, ולפקח על מצבם הבריאותי כל יום. רענן את המדיה לפי הצורך. כדי לבצע את תרבות התאים תלת-מימדיים בצלחות מרובות בארות, הסר תחילה את המדיום מבקבוק תרבות התאים, ושטף את התאים עם PBS מעוקר בחום של 33 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של טריפסין-EDTA כדי להשתמש שוב בתאים ולהידגר במשך שלוש דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הוסף שלושה מיליליטר של מדיום תרבות כדי לדלל את טריפסין. העבר את ההשעיה התא לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר, וצנטריפוגה ב 500G וטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.

לאחר מכן להסיר את supernatant ולתלות מחדש את גלולת התא עם ארבעה מיליליטר של מדיום תרבות מחומם מראש. כדי לקבוע את ריכוז התא, hypat טיפה אחת של מדגם על hemocytometer, ולספירת התאים. מדללים לריכוז הזריעה הרצוי.

זרעים 200 microliters של השעיית תא לתוך כל באר של חיבור אולטרה נמוך, עגול למטה רב באר צלחת, בריכוז של 3, 000 תאים למיליליטר, כדי להשיג כ 600 תאים ל הבאר. מיד לאחר הזריעה, צנטריפוגה את הצלחת כולה במהירות הנמוכה ביותר הזמינה, בטמפרטורת החדר, במשך שבע דקות. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% Co2, הקפד לרענן את המדיום כל שלושה ימים.

ראשית, לבנות את זרוע הייחוס ואת זרוע המדגם של מערכת OCT, בעקבות השרטוטים בכתב יד זה. לאחר מכן, לבנות את הספקטרומטר, כולל קילומטר, דירוג, עדשת F-תטא ומצלמת סריקת קו. השתמש במתאם לוח כדי להחזיק את הלוח מרובה בארות במיקום קבוע.

לפני ההדמיה, תקן את ההטיה והסיבוב של הלוח מרובה הבאר באמצעות שלב הטיה דו-ממדי, ושלב סיבוב המותקן על שלב המעבר כדי למזער את השונות של מישור המוקד מ בארות שונות. לאחר מכן התאימו את הסיבוב כדי להבטיח שקצוות הלוח מקבילים לכיוון תנועת הבמה, כך שה בארות יישארו באותן תנוחות אופקיות בתמונות OCT. לאחר מכן התאימו את שלב ההטיה כדי להבטיח שהצלחת מקבילה לשולחן האופטי, כך שה בארות יישארו באותם מיקומים אנכיים להדמיה.

ביום של דימות כדורי הגידול, להסיר את הצלחת רב באר מן החממה. העבר אותו תחת מערכת ההדמיה OCT, והצב אותו על מתאם הלוח. כדי להתאים את גובה הלוח, הזיזו אותו לאורך כיוון Z של שלב התרגום.

בתוכנת ההדמיה המותאמת אישית, הגדר את טווח הסריקה הרצוי של OCT כדי לכסות את כל הגידול, בהתאם לשלבי ההתפתחות שלו, ולחץ על שמור פרמטרים כדי לשמור את ההגדרה. לאחר מכן הצג את התצוגות המקדימות הממוטבות של XZ ו- YZ OCT של כדורי הגידול. לרכוש 3D OCT תמונות של spheroids הגידול אחד אחד עבור כל בארות של הצלחת המכילה כדוריות.

כדי להציג את תמונת התצוגה המקדימה, לחץ על לחצן התצוגה המקדימה. כדי להשיג את תמונת OCT, לחץ על לחצן הרכישה. רשום את תהליך העברת השלב הכולל של רכישת נתוני OCT.

כדי להבטיח את איכות התמונה האופטימלית עבור כל כדורי הגידול, מתאם הלוח צריך להיות מכוון במדויק ואת הנפח החציוני צריך להיות זהה. השתמש בקוד עיבוד C+מותאם אישית כדי לעבד ערכות נתונים 3D OCT של כדוריות גידול כדי ליצור תמונות מבניות OCT. השתמש בתמונות 2D OCT בשלושה מישורי חתך רוחב, XY, XZ ו- YZ לאורך המרכז של הכדור כדי ליצור קולאז' של תמונות כדוריות.

כדי להשיג עיבוד תלת-ממדי של הכדור באמצעות תוכנה רצויה, טען תחילה את נתוני SD OCT לתוכנה. לחצו על החלונית 'התעלה' ולאחר מכן הוסיפו עוצמה חדשה ובחרו במצב המיזוג לשימוש לעיבוד תלת-ממדי. להתאמת זווית הצפייה, השתמשו במצביע העכבר כדי לגרור את התמונה ולהמשיך לכמת כמתואר בכתב היד.

קולאז' של תמונות OCT לא מפוקדות של כדוריות קו התא HCT116 נוצר מהנתונים המעובדים, עם תוצאות דומות לתמונות של מערכות הדמיה דו-ממדיות אחרות בעלות תפוקה גבוהה. יתר על כן, הקולאז' של תמונות כדוריות חתך 2D מ 96 בארות נוצר כדי לפקח על גבהים כדוריים, לדמיין inhomogeneity כדורית בכיוון האנכי. קולאז' של תמונות כדוריות מעובדות תלת-ממדיות יכול להיווצר מכל זווית מוגדרת מראש כדי לדמיין את הצורה הכוללת של תלת-ממדי ולהעריך את העגולות של הכדורואיד.

לאחר עיבוד כללי OCT לאחר עיבוד, 3D OCT תמונות מבניות של spheroid הגידול הושגו. מנתוני OCT, נוצרו פוסט משטח תלת-מימדי ופרוסות אורתוגונליות של XZ, YZ ו- XY כדי לדמיין את מבנה הגידול בכיוון כלשהו. ניטור אורך של spheroid גידול יחיד בוצע כדי לאפיין את הקוטר שלה, גובה, נפח מבוסס voxel, יצירת עקומות הצמיחה בגודל ובנפח במהלך הפיתוח 21 יום.

כאן, הכדוריד שובש ביום ה-11, והתמוטט לחלוטין ביום ה-21. מעקב אורך הראה את הגידול של אזורי תאים מתים בספירואיד הגידול. תמונות מעובדות 3D של spheroid הגידול הראה את המראה והצמיחה של אזורי תאים מתים מהיום השביעי עד היום 14, כפי שמוצג על ידי עלייה של אזורים נמקיים מודגשים אדום.

ככל שאחוז האזורים הנקרוטיים גדל, הגידול לא הצליח לשמור על צורתו המושלמת, ולכן התמוטט. עם פלטפורמת הדמיה זו אנו יכולים להמשיך לחקור מודלים מורכבים אחרים של כדור הגידול, כגון מודל הדמיה תלת מימדית, מודל יצור עצום ומודלים של תרבות שותף כדי לדמות טוב יותר גידולים vivo. מערכת ההדמיה OCT בתפוקה גבוהה שלנו יכולה לספק גישה משתנה להקרנת תרופות בגילוי תרופות לסרטן.

זה משהו גם מאופיין, דגימות biofabricated 3D עבור יישומים ביו רפואיים שונים.