שימוש בחוץ גופית וצורה בתא לחקור מולקולה קטנה המושרה שינויים מבניים Pre-mRNA

וידאו זה יספק פרוטוקולים מפורטים עבור ניסויים בצורת במבחנה כדי לקבוע את המבנה המשני של רצפי RNA של עניין בנוכחות RNA מיקוד מולקולה קטנה. בצורת במבחנה היא שיטה חסכונית להבנת הדינמיקה של כל נוקלאוטידים על אלמנט RNA בגודל אמינו שהוא בדרך כלל פחות מ -200 נוקלאוטידים. לאחר הכנת תבנית ה- RNA כמתואר בכתב היד, תווית רדיו הופכת את תעתיק פריימרים על ידי הוספת ATP גמא 32P, פריימר שעתוק הפוך.

חיץ תגובת 10XPNK, קינאז פולינוקלאוטיד ומים חופשיים של RNA בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.7 מיליליטר בנפח כולל של 20 מיקרוליטר. ואז דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר מכן אתה מפעיל את הדגימות במשך 20 דקות מאז 65 מעלות צלזיוס ולאחר מכן לסנן את הדגימות בעמודה התפלה צנטריפוגה ב 1000 פעמים G.Add 25 microliters של חיץ מדגם אוריאה 2XTBE ולערבב.

הורידו את המוצרים המסומן לג'ל אקרילמיד של 10% ודאגו להימנע מדימום הרדיואקטיביות למאגרים העליונים. הפעל את הג'ל ב 20 וואט במשך שעה אחת. לאחר הריצה, להסיר את צלחות הזכוכית של קלטת ג'ל.

מניחים את הג'ל על חתיכת ניילון נצמד. מקפלים את הפלסטיק על החלק העליון של הג'ל כדי להפוך כריך אוויר הדוק. מניחים את כריך הג'ל על מסך זרחן סידן-טונגסטאט וחושפים בעזרת מכשיר דמיוני.

תמונה הג'ל שוב עם אור רגיל כדי לדעת איפה הקצוות של הג'ל. השתמש בתוכנה לעיבוד תמונה כדי שכבת-על של שתי התמונות ושכבות-על של התמונות בהירות וכהות. לאחר מכן הפוך את התמונה העליונה לאטמה מעט כדי לראות את שתי התמונות בו-זמנית.

ודא שהתמונה המודפסת בגודל זהה לגודל הג'ל בפועל. לאחר מכן יישר את הג'ל על התמונה המודפסת. לבסוף, השתמש בסכין גילוח מעוקר כדי לחתוך את העיקולים הרצויים מתוך הג'ל ולהחנות כל חתיכת ג'ל בצינור מיקרוצנטריפוגה נפרד של 1.7 מיליליטר.

כדי לשחזר את ה-DNA מפרוסת הג'ל על ידי אלוטיון פסיבי, להוסיף 0.3 מיליליטר של תערובת משקעים אלוטיון לכל צינור 1.7 מיליליטר. דגירה הצינורות במיכל רדיואקטיבי בטוח על מסובב בארבע מעלות צלזיוס במשך 16 שעות. לאחר הדגירה, מעבירים את הנוזל לצינור חדש של 1.7 מיליליטר.

מוסיפים 2.5x קרח קר 200 אתנול הוכחה להפוך את הצינורות שש פעמים כדי לערבב את הנוזל. דוגרים את הצינורות במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות. לאחר צנטריפוגה ב 10, 000g ו 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, להסיר את supernatant בזהירות על ידי צינורות.

מוסיפים מיליליטר אחד של 80% אתנול כדי לשטוף את גלולה. וורטקס למשך 15 שניות וצנטריפוגה שוב באותם תנאים. לאחר הסרת supernatant על ידי צינורות, אוויר לייבש את גלולת ה-DNA במשך חמש דקות.

מוסיפים 50 מיקרוליטרים של המים החופשיים של RNA ומערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה 10 פעמים. לנרמל את ריכוז ה-DNA על 100, 000 ספירות לדקה למיקרוליטר בדלפק קליטה. כדי להכין ארבע דגימות לשינוי כימי, להוסיף שמונה picomoles של RNA ב 32 microliters של 0.5 חיץ XTE לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.7 מיליליטר.

מחממים ב-80 מעלות במשך שתי דקות ומתקררים על הקרח למשך דקה אחת לפחות. לאחר מכן הוסיפו שמונה מיקרוליטרים של תערובת קיפול פי 5, ערבבו 9 מיקרוליטרים של תערובת RNA זו לכל אחד מארבעת צינורות ה-PCR, המסומנים מאחד לארבעה. הוסף מיקרוליטר אחד של 10%DMSO לצינור המסומן כאחד, מיקרוליטר אחד של פתרון מולקולה קטנה מרוכזת לצינור 2, מיקרוליטר אחד של פתרון מולקולה קטנה מדוללת לצינור שלוש ומיקרוליטר אחד של מים לצינור ארבע.

הדגירה כל צינורות PCR ב 37 מעלות צלזיוס במחזור תרמי במשך 30 דקות. ממש לפני שתי התגובות העיקריות לשינוי OH, לדלל מיקרוליטר אחד של שני פתרון מלאי NAI טוחן בשלושה microliters של מים שטופלו DEPC להניב פתרון עבודה טוחן 0.5. מיד להוסיף מיקרוליטר אחד של פתרון זה לתוך צינורות אחד, שתיים ושלוש.

הוסיפו מיקרוליטר אחד של 25% DMSO לצינור 4 ודגירה במחזור תרמי ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. הכינו ארבעה צינורות מיקרוצנטריפוגה טריים של 1.7 מיליליטר והוסיפו 100 מיקרוליטרים של תערובת משקעים אלוטיונים ושני מיקרוליטרים של גליקוגן לכל צינור. ואז לתוך כל הצינורות האלה להעביר את כל הנוזל מצינורות PCR המתאימים.

מוסיפים 0.34 מיליליטר של אתנול 200 הוכחה קר כקרח לתוך כל צינור ומערבבים על ידי מערבולת במשך חמש שניות. מניחים את הצינורות במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות. ואז צנטריפוגה הצינורות במשך 15 דקות ב 14, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס.

מבלי להפריע גלולת RNA, להסיר את supernatant מכל צינור. הוסיפו 0.5 מיליליטר של 80% אתנול לצינור כדי לשטוף את גלולת ה-RNA והמערבולת למשך 15 שניות. לאחר צנטריפוגה באותם תנאים שוב, להסיר את על טבעי אוויר יבש גלולת RNA במשך חמש דקות.

הוסף תשעה microliters של המים החופשיים של RNA וצינור כי למעלה ולמטה 10 פעמים לערבב. העבר את ה- RNA שהשתנה לארבעה צינורות PCR חדשים ותייג אותם אחד עד ארבעה כמו בשלב הקודם. הוסף שני picomoles של RNA בשבעה microliters של מים שטופלו DEPC לכל אחד מארבעה צינורות PCR נוספים ולתייג אותם עם מספרים חמש עד שמונה.

הוסף שני מיקרוליטרים של פריימר radiolabeled התאושש לכל אחד משמונה צינורות PCR מסומן אחד עד שמונה. לאחר חימום ב 65 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, מיד להתקרר לארבע מעלות צלזיוס במחזור התרמי. הוסף ארבעה מיקרוליטרים של חיץ RT 5x, מיקרוליטר אחד של DTT טוחן 0.1 ומיקרוליטר אחד של תערובת DNTP לכל אחד מהצינורות.

לאחר מכן הוסיפו שני מיקרוליטרים של מים שטופלו ב-DEPC לצינורות 1 עד 4. הוסף ארבעה microliters של 5 מילימולרים ddATP לצינור חמש, ארבעה microliters של חמישה מילימולרים ddTTP לצינור שש וארבעה microliters של 5 מילימולרים ddCTP לצינור שבע ואחד microliter של חמישה מילימולרים ddGTP ושלושה microliters של מים שטופלו DEPC צינור שמונה פיגט ארבע פעמים לערבב. לאחר חימום כל צינורות PCR ב 52 מעלות צלזיוס במשך דקה אחת במחזור תרמי, להוסיף מיקרוליטר אחד של תעתיק הפוך לכל צינור אותו למעלה ולמטה ארבע פעמים כדי לערבב.

הדגירה את התגובות ב 52 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות במחזור התרמי. כדי הידרוליזה RNA, להוסיף microliter אחד של חמישה נתרן הידרוקסיד טוחן לתוך כל הצינורות לחמם אותם ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של חומצה הידרוכלורית אחת כדי לנטרל את התגובה ולחזור על משקעים אתנול כפי שתואר קודם לכן.

לאחר ייבוש האוויר את גלולת ה- DNA במשך חמש דקות, להוסיף 10 microliters של מים ו 10 microliters של 2xTBE אוריאה מדגם חיץ טעינה בצינורות 1.7 מיליליטר צינורות צינור אותו למעלה ולמטה 10 פעמים כדי להתגייס מחדש. מחממים את הדגימות ב 70 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולאחר מכן מניחים את הצינורות על קרח, לפני טעינה על הג'ל. טען 10 מיקרוליטרים של הדגימה שהונחה על קרח על 8%ג'ל רצף פוליאקרילמיד.

הפעל את הג'ל ב 65 וואט במשך שעתיים או עד הצבע התחתון מגיע 3/4ths של הג'ל. הסר את הרווח בעדינות להכניס מרית כדי להסיר את צלחת זכוכית סיליקון העליון. מכסים את הג'ל בפיסת נייר סינון גדול ולחץ בעדינות כדי לאפשר לג'ל לדבוק בנייר הסינון.

החל מהסוף התחתון, להרים את נייר המסנן ולהסיר את הג'ל מצלחת הזכוכית יחד עם הנייר. לאחר העברת הג'ל לנייר עטיפה כפי שנעשה בעבר, ייבשו אותו ב-70 מעלות צלזיוס למשך שעה עם ואקום, ודאגו להשתמש בכמה ניירות סינון בין הג'ל למייבש. מעבירים את כריך הג'ל לקלטת מסך אחסון זרחן מולבן וחושפים את הרדיואקטיביות של הג'ל למסך במשך ארבע עד 16 שעות.

לבסוף, מניחים את מסך אחסון הזרחן על מכשיר הדמיה וסורקים ברזולוציה בינונית במשך כ-30 דקות. לאחר חשיפת ג'ל רצף פוליאקרילמיד למסך אחסון הזרחן, ניסוי צורה מוצלח הראה עיקול יחיד ואינטנסיבי ביותר בחלק העליון של הג'ל ומתכופף ברחבי הג'ל ברזולוציית נוקלאוטיד אחת ללא מריחה. הג'ל גם הראה כי העוצמה של כמה עיקולים השתנה בנוכחות מולקולות קטנות, המציין שינויים של כוח זיווג הבסיס.

בעיה נפוצה בניתוח דף היא שאזור מריחה המכונה חזית המלח עשוי להופיע באמצע הג'ל, כנראה בשל ריכוז גבוה של מלח, DMSO או חומר לא רצוי אחר בדגימה טעינה. זה יכול להימנע על ידי הסרת החומר הלא רצוי על ידי משקעים אתנול. תבנית RNA הומוגנית עדיפה על צורת במבחנה.

אנו משתמשים ריבוזום בשני קצוות ראשוניים ושלושה ראשוניים כדי להשיג RNA כזה. ניתן לבצע צורה בתא גם כדי לקבל מבנה משני RNA בהקשר התאי. זכור, בצורת במבחנה לא יכול לסכם מחדש vivo RNA מחייב אינטראקציות חלבון.

צורת במבחנה היא שיטה רבת עוצמה לגילוי שינויים במבנה RNA בשל נוכחותה של מולקולה קטנה. הדבר נעשה על-ידי כימות שינויים בעוצמת התבנית של עצירות תעתיק הפוכות. היזהר שכל הניסויים המתוארים בסרטון זה יבוצעו במקום עבודה רדיואקטיבי מורשה עם הגנה אישית מתאימה ומיגון פלקסיגלס.