Name: שימוש בחוץ גופית וצורה בתא לחקור מולקולה קטנה המושרה שינויים מבניים Pre-mRNA (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: למדו פרוטוקולי SHAPE לבחינת מבנה משני של pre-mRNA בנוכחות מולקולות קטנות. השיטה מאפשרת לחקור דינמיקת RNA ואינטראקציות מולקולריות בצורה יעילה וחסכונית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו התאפשרה על ידי המענק NIH R01 (NS094721, K.A.J.).

<ol><li>Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+2%27-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+%28SHAPE%29%3A+Quantitative+RNA+structure+analysis+at+single+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution.</a> Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).</li>
<li>Trausch, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+diversity+in+the+SAM+clan+of+riboswitches%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).</li>
<li>Souliere, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+a+riboswitch+response+through+structural+extension+of+a+pseudoknot%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences.+110%2C+E3256-E3264%22%5BJournal%5D)">Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).</li>
<li>Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHAPE+Analysis+of+Small+RNAs+and+Riboswitches%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches.</a> Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).</li>
<li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+SHAPE+analysis+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA SHAPE analysis in living cells.</a> Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).</li>
<li>Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+studies+of+a+small-molecule+modulator+of+SMN2+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).</li>
<li>Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mn+2%2B+-Sensing+Mechanisms+of+yybP-ykoY+Orphan+Riboswitches%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches.</a> Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).</li>
<li>Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tertiary+contacts+control+switching+of+the+SAM-I+riboswitch%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch.</a> Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).</li>
<li>Abulwerdi, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Small+Molecules+with+a+Noncanonical+Binding+Mode+to+HIV-1+Trans+Activation+Response+%28TAR%29+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).</li>
<li>Shortridge, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Macrocyclic+Peptide+Ligand+Binds+the+Oncogenic+MicroRNA-21+Precursor+and+Suppresses+Dicer+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing.</a> ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).</li>
<li>Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+for+targeting+RNA+with+drug-like+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Principles for targeting RNA with drug-like small molecules.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).</li>
<li>Mullard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+against+RNA+targets+attract+big+backers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Small molecules against RNA targets attract big backers.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).</li>
<li>Shortridge, M. D., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+based+approaches+for+targeting+non-coding+RNAs+with+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules.</a> Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).</li>
<li>Gallego, J., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+RNA+with+Small-Molecule+Drugs%3A+Therapeutic+Promise+and+Chemical+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges.</a> Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).</li>
<li>Rizvi, N. F., Smith, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+as+a+small+molecule+druggable+target%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">RNA as a small molecule druggable target.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).</li>
<li>Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Emerging+Role+of+RNA+as+a+Therapeutic+Target+for+Small+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules.</a> Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).</li>
<li>Palacino, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMN2+splice+modulators+enhance+U1-pre-mRNA+association+and+rescue+SMA+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice.</a> Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).</li>
<li>Ratni, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+Risdiplam%2C+a+Selective+Survival+of+Motor+Neuron-2+%28+SMN2+%29+Gene+Splicing+Modifier+for+the+Treatment+of+Spinal+Muscular+Atrophy+%28SMA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA).</a> Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).</li>
<li>Naryshkin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMN2+splicing+modifiers+improve+motor+function+and+longevity+in+mice+with+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy.</a> Science. 345, (2014).</li>
<li>Chiriboga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+Evidence+for+Pharmacodynamics+Effects+of+RG7916+in+JEWELFISH%2C+a+Study+in+Patients+with+Spinal+Muscular+Atrophy+who+Previously+Participated+in+a+Study+with+Another+SMN2-Splicing+Targeting+Therapy+%28S46.003%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003).</a> Neurology. 90, (2018).</li>
<li>Sivaramakrishnan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+to+SMN2+pre-mRNA-protein+complex+elicits+specificity+for+small+molecule+splicing+modifiers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li>
<li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+SHAPE+reagents+for+mapping+RNA+structures+inside+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells.</a> RNA. 23, 169-174 (2017).</li>
<li>Weeks, K. M., Mauger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+RNA+Structural+Codes+with+SHAPE+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry.</a> Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).</li>
<li>Smola, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHAPE+reveals+transcript-wide+interactions+%2C+complex+structural+domains+%2C+and+protein+interactions+across+the+Xist+lncRNA+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).</li>
<li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+interrogation+of+RNA+secondary+structure+in+living+cells+with+icSHAPE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE.</a> Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).</li>
<li>Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+2+%E2%80%B2+-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+and+mutational+profiling+%28SHAPE-MaP%29+for+direct+%2C+versatile+and+accurate+RNA+structure+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Selective 2 ′ -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis.</a> Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).</li>
<li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+correction+of+SMN2+splicing+in+the+CNS+rescues+necrosis+in+a+type+III+SMA+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model.</a> Genes & Development. 24, 1634-1644 (2010).</li>
<li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+SMN+restoration+is+essential+for+long-term+rescue+of+a+severe+spinal+muscular+atrophy+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model.</a> Nature. 478, 123-126 (2011).</li>
<li>Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+SR+proteins+improves+SMN+expression+in+spinal+muscular+atrophy+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells.</a> PloS One. 9, e115205(2014).</li>
<li>Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+and+functional+implications+of+the+3D+architectures+of+viral+tRNA-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures.</a> RNA. 15, 294-307 (2009).</li>
<li>Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+role+of+RNA+structure+in+alternative+splicing+of+a+critical+exon+in+the+spinal+muscular+atrophy+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes.</a> Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).</li>
<li>Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+SHAPE-directed+RNA+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Accurate SHAPE-directed RNA structure determination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).</li>
<li>Qi, H., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aQi%2C+H+%22Preparation+of+pyridopyrimidine+derivatives+and+related+compounds+for+treating+spinal+muscular+atrophy%22">Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy</a>. , (2013).</li>
<li>Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+nucleotide+in+the+SMN+gene+regulates+splicing+and+is+responsible+for+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).</li>
<li>Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+motif+discovery+by+SHAPE+and+mutational+profiling+%28SHAPE-MaP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP).</a> Nature Methods. 11, 959(2014).</li>
<li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).</li>
<li>Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNase+Footprinting+to+Map+Sites+of+RNA-Protein+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).</li>
<li>Velagapudi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+small+molecule+against+an+oncogenic+noncoding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).</li>
<li>Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+NMR+to+structure+determination+of+RNAs+large+and+small%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).</li>
<li>Scott, L. G., Hennig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+structure+determination+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA structure determination by NMR.</a> Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).</li>
</ol>

המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.

בצורת גופית, חיוני להשתמש בתבנית ה-RNA הומוגנית באיכות גבוהה. T7 שעתוק, עם זאת, לעיתים קרובות התשואות רצפים הטרוגנית36. במיוחד, רצפי עם נוקלאוטיד ±1 בקצהו 3'-עם תשואות שעצירת36 קשים בדרך כלל שיוסרו על-ידי לזיהוי ג'ל לטיהור. תבנית ה-RNA הטרוגניות עלולים לגרום קבוצה אחד או יותר של האות בבניית פרופילים ג'ל רצף של המוצר פריימר הרחבה, אשר לפעמים מקשה לפרש את התוצאה. ריבוזים-שני 5'-3'-סוף בקלטת ביטוי תבנית הרנ א יעשה בשני הקצוות הומוגנית.
עבור צורה במב...

Acylation סלקטיבית-2' הידרוקסיל נותחו על ידי הארכת תחל (צורה) היא שיטת מדידה של קינטיקה של כל נוקלאוטיד ברצף RNA עניין ולאחר שחקרתי את מבנה שניוני-נוקלאוטיד יחיד החלטה1. הצורה מתודולוגיות, שניהם תנאים במבחנה2,3,4 (מטוהרים RNA במערכת מאגר מוגדר), ב-5,בתרבית של תאים חיים6, פותחו כדי לחקור המשני מבנה של רצפי אורך בינוני RNA (בדרך כלל < 1,000 נוקלאוטידים עבור צורה בתוך תא, < נוקלאוטידים 200 עבור צורה במבחנה). זה שימושי במיוחד כדי להעריך את ביצוע שינויים מבניים קולטן ה-RNA על איגוד אינטראקציה-RNA מולקולה קטנה מטבוליטים2,4,7,8 , ללמוד פעולות מכניסטית של מולקולות RNA פילוח במהלך סמים פיתוח9,10.
פילוח RNA גילוי תרופות לאחרונה מושך תשומת לב במעבדות אקדמי ו11,בתעשייה הפרמצבטית12 באמצעות גישות שונות ואסטרטגיות13,14,15 ,16. דוגמאות פילוח RNA מולקולות קטנות לשימוש קליני האחרונות כוללות שתי תרופות ניסיוניות מבנית ברורים, LMI-07017 ו RG-791618,19, עבור ניוון שרירי עמוד השדרה (SMA), אשר הראו מבטיח תוצאות בשלב II ניסויים קליניים20. היו שתי מולקולות הפגינו להישרדות היעד של נוירון מוטורי (SMN) 2 pre-mRNA ולווסת את התהליך splicing של17,216,ג'ין SMN2. אנחנו הפגינו בעבר היישום של במבחנה ואת הצורה בתא במבחן של השינויים המבניים היעד RNA בנוכחות אנלוגי של RG-7916 המכונה SMN-C26.
בעקרון, צורה מודד את שיעור acylation 2'-הו כל נוקלאוטיד של רצף הרנ א בנוכחות כמויות עודפות של ריאגנט acylation עצמית quenching בצורה בלתי לא משוחדת. הכימית acylation אינה יציבה במים, עם מחצית חיים קצר של (למשל, T1/2 = 17 s עבור 1-מתיל-7-nitroisatoic אנהידריד; או 1 מ' 7, ~ 20 דקות עבור 2-methylnicotinic imidazolide חומצה, או נאי)22 ו חוסר רגישות לגבי זהותו של בסיסים23. התוצאה acylation יותר של קבוצות 2'-הו הבסיסים גמיש, אשר יכולה להיהפך הערכה מדויקת של כל נוקלאוטיד הדינמיקות. באופן ספציפי, נוקלאוטיד בזוג הבסיס הוא בדרך כלל מגיב פחות מזו אינטראקצית ל ריאגנט שינוי 2'-הו, נאי ו 1 מ' 7.
מסתכל על המקור של התבנית RNA שם מתקיים acylation 2'-הו, צורה ניתן בדרך כלל לסווג במבחנה וצורה בתא. שימושים חוץ גופית צורה T7 מטוהרים עיבד RNA, חסר הקשר הסלולר בעיצובים ניסיוני. בצורת בתא, שעתוק RNA תבנית והן 2'-הו acylation מתרחשות בתוך תאים חיים; לכן, התוצאות ניתן לסכם המודל המבני RNA בהקשר הסלולר. הצורה בתא שהופנתה כמו vivo צורה עבור הצורה נשא בתאים חיים ספרות24. מאז הניסוי הזה לא מתבצע בחיה, אנחנו כינה את הניסוי הזה בתא הצורה על דיוק.
האסטרטגיות עבור השלב סיומת פריימר של הפריה וצורה בתא הם גם שונים. בצורת גופית, שעתוק במהופך עוצר המיקום acylation 2'-או בנוכחות Mg2 +. סיומת פריימר 32P-בעל התווית ולכן מופיע עם הלהקה ב לזיהוי בג'ל (עמוד), האינטנסיביות של הלהקה הוא יחסי קצב acylation1. בצורת בתא, שעתוק במהופך יוצר מוטציות אקראיות ב- 2'-. הו-adduct עמדה בנוכחות Mn2 +. קצב mutational של כל נוקלאוטיד ניתן ללכוד מאת עומק הדור הבא רצפי ולאחר מכן ניתן לחשב את תגובתיות צורה ברזולוציה נוקלאוטיד יחיד.
בעיה פוטנציאלית עבור צורה בתא הוא יחס אות לרעש נמוך (קרי, רוב הקבוצות 2'-הו הוא שלא שונתה, ואילו רצפי יאומתו לכבוש את רוב קרא ב הדור הבא רצפי). לאחרונה, שיטה להעשיר 2'-. הו-שינוי RNA, המכונה כמו vivo לחץ על צורה (icSHAPE), פותחה על ידי מעבדה צ'אנג25. שיטה זו העשרה עשוי להיות יתרון בלימוד חלש מולקולות קטנות כגון אינטראקציות RNA, בפרט חקירה transcriptome ברוחב.

<table><tbody><tr><td>DNA oligonucleotide</td><td>IDT</td><td></td><td>gBlock עבור >200 bp DNA סינתזת DNA</td></tr><tr><td>Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher</td><td>F566S</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin ג'ל וערכת ניקוי PCR</td><td>Takara</td><td>740609.50</td><td></td></tr><tr><td>ערכת תמלול MegaScript T7</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1333</td><td>מכיל מאגר תגובה פי 10, אנזים T7, NTP וטורבו DNase</td></tr><tr><td>מים שטופלו ב-DEPC</td><td>Thermo Fisher</td><td>750023</td><td></td></tr><tr><td>2x TBE-urea מאגר דגימה</td><td>תרמו פישר</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>40% תמיסת אקרילאמיד/ביסקרילאמיד (29:1)</td> <td>Bio-Rad</td><td>1610146</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE buffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>15581044</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow&trade; יחידת סינון</td><td>Thermo Fisher</td><td>166-0045</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Thermo Fisher</td><td>17919</td><td></td></tr><tr><td>SYBR-Safe dye</td><td>Thermo Fisher</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>6% TBE-urea מיני ג'ל</td><td>Thermo Fisher</td><td>EC6865BOX</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;-32P-ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG035C005MC</td><td></td></tr><tr><td>Hyperscreen&trade; מסך מתעצם</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN1669</td><td>סידן טונגסטט זרחן</td></tr><tr><td>מסך אחסון זרחן</td><td>דינמיקה מולקולרית</td><td>BAS-IP MS 3543 E</td><td></td></tr><tr><td>אמרשם טייפון</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NAI (2M)</td> <td>EMD Millipore</td><td>03-310</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9515</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV הפוך Transcriptase</td><td>Thermo Fisher</td><td>18090010</td><td>מכיל 5x מאגר RT, תערובת SuperScript IV</td></tr><tr><td>dNTP (10 מ"מ)</td> סט <td>Thermo Fisher</td><td>R0192</td><td></td></tr><tr><td>ddNTP (5 מ"מ)</td> <td>Sigma</td><td>GE27-2045-01</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון גדול</td><td>Whatman</td><td>1001-917</td><td></td></tr><tr><td>מייבש ג'ל</td><td>Hoefer</td><td>GD 2000</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA דם מיני ערכת</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>מכיל גם RNase A ופרוטאז K</td></tr><tr><td>SMN2 minigene34</td><td>Addgene</td><td>72287</td><td></td></tr><tr><td>מומת בחום FBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>FuGene HD</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>TrpLE</td><td>Thermo Fisher</td><td>12605010</td><td></td></tr><tr><td>DPBS ללא Ca/Mg</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Thermo Fisher</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy מיני טור</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>מכיל גם RW1, מאגר RPE</td></tr><tr><td>ללא RNase DNase סט</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>מכיל DNase I ו-RDD</td></tr><tr><td>מאגר פורממיד</td> <td>דה-יוניםתרמו פישר</td><td>AM9342</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2&bull; 4H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>nonamer</td><td>אקראי Sigma-Aldrich</td><td>R7647</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript מערכת סינתזה ראשונה</td><td>Thermo Fisher</td><td>11904-018</td><td>מכיל 10x RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase</td></tr><tr><td>AccuPrime pfx DNA polymerse</td><td>Thermo Fisher</td><td>12344024</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq500</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עמוד NucAway</td><td>תרמו פישר</td><td>AM10070</td><td>למטרת התפלה</td></tr></tbody></table>

שימוש בחוץ גופית וצורה בתא לחקור מולקולה קטנה המושרה שינויים מבניים pre-mrna

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

בתהליך של פיתוח תרופות של פילוח RNA מולקולות קטנות, שחקרתי את השינויים המבניים על האינטראקציות שלהם עם רצפי RNA יעד רצוי. בזאת אנו מספקים של נתונים היסטוריים במבחנה , בתא סלקטיבי 2'-הידרוקסיל acylation נותחו על ידי הארכת תחל (צורה) פרוטוקול ללמוד השינוי המבני RNA בנוכחות תרופה ניסיונית עבור ניוון שרירי עמוד השדרה (SMA), הישרדות מוטור נוירון (SMN)-C2, ו ב אקסון 7 של pre-mRNA של הגן SMN2. בצורת גופית, רצף הרנ א של נוקלאוטידים 140 המכיל SMN2 אקסון 7 עיבד על ידי T7 RNA פולימראז, מקופל בנוכחותו של SMN-C2, שונה לאחר מכן על ידי תגובה כימית acylation מתון-2' הו, 2-methylnicotinic imidazolide חומצה (NAI). זה adduct 2'-הו-נאי נוסף שנבדק על-ידי בגודל 32הארכת תחל התווית על-ידי P, נפתרת על-ידי אלקטרופורזה בג'ל לזיהוי (עמוד). לעומת זאת, 2'-הו acylation במצב בתא מתקיים באתרו עם RNA הסלולר SMN-C2 מאוגד בתאים חיים. רצף ה-pre-mRNA של אקסון 7 בגן SMN2 יחד עם צורה-induced מוטציות בהרחבה פריימר, היה אז מוגבר על-ידי ה-PCR ובכפוף הדור הבא רצפי. משווים את שתי מתודולוגיות, צורה במבחנה היא שיטה חסכונית יותר, לא דורשת כוח חישובית לדמיין תוצאות. עם זאת, הדגם RNA נגזר צורה במבחנה לפעמים סוטה מן המבנה משני בהקשר הסלולר, ככל הנראה בשל האובדן של כל האינטראקציות עם RNA מחייב חלבונים. הצורה בתאים אינו צריך מקום העבודה חומרים רדיואקטיביים ותשואות מבנה שניוני מדויקת יותר של RNA בהקשר הסלולר. יתר על כן, בתא בצורה ישימה כלל עבור רצפי טווח של RNA גדול יותר (~ 1,000 נוקלאוטידים) על-ידי ניצול רצפי הדור הבא, לעומת הפריה צורה (~ 200 נוקלאוטידים) כי בדרך כלל מסתמך על דף ניתוח. במקרה של אקסון 7 ב- SMN2 pre-mRNA, נגזר הצורה במבחנה, בתא RNA מודלים דומים אחד לשני.

אנחנו הפגינו בעבר כי RNA שחבור אפנן, SMN-C2, אינטראקציה עם מוטיב AGGAAG על אקסון 7 של pre-mRNA הגן SMN2, המשמש צורה כדי להעריך את השינויים המבניים של RNA בנוכחותו של SMN-C26. אתר איגוד של SMN-C2 היא נבדלת שאושרו על-ידי ה-FDA antisense oligonucleotide (אסו) עבור SMA, nusinersen, אשר נקשר וחוסם intronic splicing משתיק הקול (ISS) על אינטרון 727,28 (איור 1 א'). הכי ידוע splicing הר...

פרוטוקולים מפורט עבור שני acylation במבחנה, בתא סלקטיבי 2'-הידרוקסיל נותחו על ידי פריימר ניסויים סיומת (צורה) כדי לקבוע את מבנה שניוני של רצפי ה-pre-mRNA עניין בנוכחות מולקולה קטנה פילוח RNA הם הציג במאמר זה.

שימוש בחוץ גופית וצורה בתא לחקור מולקולה קטנה המושרה שינויים מבניים Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

וידאו זה יספק פרוטוקולים מפורטים עבור ניסויים בצורת במבחנה כדי לקבוע את המבנה המשני של רצפי RNA של עניין בנוכחות RNA מיקוד מולקולה קטנה. בצורת במבחנה היא שיטה חסכונית להבנת הדינמיקה של כל נוקלאוטידים על אלמנט RNA בגודל אמינו שהוא בדרך כלל פחות מ -200 נוקלאוטידים. לאחר הכנת תבנית ה- RNA כמתואר בכתב היד, תווית רדיו הופכת את תעתיק פריימרים על ידי הוספת ATP גמא 32P, פריימר שעתוק הפוך.חיץ תגובת 10XPNK, קינאז פולינוקלאוטיד ומים חופשיים של RNA בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.7 מיליליטר בנפח כולל של 20 מיקרוליטר. ואז דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר מכן אתה מפעיל את הדגימות במשך 20 דקות מאז 65 מעלות צלזיוס ולאחר מכן לסנן את הדגימות בעמודה התפלה צנטריפוגה ב 1000 פעמים G.Add 25 microliters של חיץ מדגם אוריאה 2XTBE ולערבב.הורידו את המוצרים המסומן לג'ל אקרילמיד של 10% ודאגו להימנע מדימום הרדיואקטיביות למאגרים העליונים. הפעל את הג'ל ב 20 וואט במשך שעה אחת. לאחר הריצה, להסיר את צלחות הזכוכית של קלטת ג'ל.מניחים את הג'ל על חתיכת ניילון נצמד. מקפלים את הפלסטיק על החלק העליון של הג'ל כדי להפוך כריך אוויר הדוק. מניחים את כריך הג'ל על מסך זרחן סידן-טונגסטאט וחושפים בעזרת מכשיר דמיוני.תמונה הג'ל שוב עם אור רגיל כדי לדעת איפה הקצוות של הג'ל. השתמש בתוכנה לעיבוד תמונה כדי שכבת-על של שתי התמונות ושכבות-על של התמונות בהירות וכהות. לאחר מכן הפוך את התמונה העליונה לאטמה מעט כדי לראות את שתי התמונות בו-זמנית.ודא שהתמונה המודפסת בגודל זהה לגודל הג'ל בפועל. לאחר מכן יישר את הג'ל על התמונה המודפסת. לבסוף, השתמש בסכין גילוח מעוקר כדי לחתוך את העיקולים הרצויים מתוך הג'ל ולהחנות כל חתיכת ג'ל בצינור מיקרוצנטריפוגה נפרד של 1.7 מיליליטר.כדי לשחזר את ה-DNA מפרוסת הג'ל על ידי אלוטיון פסיבי, להוסיף 0.3 מיליליטר של תערובת משקעים אלוטיון לכל צינור 1.7 מיליליטר. דגירה הצינורות במיכל רדיואקטיבי בטוח על מסובב בארבע מעלות צלזיוס במשך 16 שעות. לאחר הדגירה, מעבירים את הנוזל לצינור חדש של 1.7 מיליליטר.מוסיפים 2.5x קרח קר 200 אתנול הוכחה להפוך את הצינורות שש פעמים כדי לערבב את הנוזל. דוגרים את הצינורות במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות. לאחר צנטריפוגה ב 10, 000g ו 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, להסיר את supernatant בזהירות על ידי צינורות.מוסיפים מיליליטר אחד של 80% אתנול כדי לשטוף את גלולה. וורטקס למשך 15 שניות וצנטריפוגה שוב באותם תנאים. לאחר הסרת supernatant על ידי צינורות, אוויר לייבש את גלולת ה-DNA במשך חמש דקות.מוסיפים 50 מיקרוליטרים של המים החופשיים של RNA ומערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה 10 פעמים. לנרמל את ריכוז ה-DNA על 100, 000 ספירות לדקה למיקרוליטר בדלפק קליטה. כדי להכין ארבע דגימות לשינוי כימי, להוסיף שמונה picomoles של RNA ב 32 microliters של 0.5 חיץ XTE לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.7 מיליליטר.מחממים ב-80 מעלות במשך שתי דקות ומתקררים על הקרח למשך דקה אחת לפחות. לאחר מכן הוסיפו שמונה מיקרוליטרים של תערובת קיפול פי 5, ערבבו 9 מיקרוליטרים של תערובת RNA זו לכל אחד מארבעת צינורות ה-PCR, המסומנים מאחד לארבעה. הוסף מיקרוליטר אחד של 10%DMSO לצינור המסומן כאחד, מיקרוליטר אחד של פתרון מולקולה קטנה מרוכזת לצינור 2, מיקרוליטר אחד של פתרון מולקולה קטנה מדוללת לצינור שלוש ומיקרוליטר אחד של מים לצינור ארבע.הדגירה כל צינורות PCR ב 37 מעלות צלזיוס במחזור תרמי במשך 30 דקות. ממש לפני שתי התגובות העיקריות לשינוי OH, לדלל מיקרוליטר אחד של שני פתרון מלאי NAI טוחן בשלושה microliters של מים שטופלו DEPC להניב פתרון עבודה טוחן 0.5. מיד להוסיף מיקרוליטר אחד של פתרון זה לתוך צינורות אחד, שתיים ושלוש.הוסיפו מיקרוליטר אחד של 25% DMSO לצינור 4 ודגירה במחזור תרמי ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. הכינו ארבעה צינורות מיקרוצנטריפוגה טריים של 1.7 מיליליטר והוסיפו 100 מיקרוליטרים של תערובת משקעים אלוטיונים ושני מיקרוליטרים של גליקוגן לכל צינור. ואז לתוך כל הצינורות האלה להעביר את כל הנוזל מצינורות PCR המתאימים.מוסיפים 0.34 מיליליטר של אתנול 200 הוכחה קר כקרח לתוך כל צינור ומערבבים על ידי מערבולת במשך חמש שניות. מניחים את הצינורות במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות. ואז צנטריפוגה הצינורות במשך 15 דקות ב 14, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס.מבלי להפריע גלולת RNA, להסיר את supernatant מכל צינור. הוסיפו 0.5 מיליליטר של 80% אתנול לצינור כדי לשטוף את גלולת ה-RNA והמערבולת למשך 15 שניות. לאחר צנטריפוגה באותם תנאים שוב, להסיר את על טבעי אוויר יבש גלולת RNA במשך חמש דקות.הוסף תשעה microliters של המים החופשיים של RNA וצינור כי למעלה ולמטה 10 פעמים לערבב. העבר את ה- RNA שהשתנה לארבעה צינורות PCR חדשים ותייג אותם אחד עד ארבעה כמו בשלב הקודם. הוסף שני picomoles של RNA בשבעה microliters של מים שטופלו DEPC לכל אחד מארבעה צינורות PCR נוספים ולתייג אותם עם מספרים חמש עד שמונה.הוסף שני מיקרוליטרים של פריימר radiolabeled התאושש לכל אחד משמונה צינורות PCR מסומן אחד עד שמונה. לאחר חימום ב 65 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, מיד להתקרר לארבע מעלות צלזיוס במחזור התרמי. הוסף ארבעה מיקרוליטרים של חיץ RT 5x, מיקרוליטר אחד של DTT טוחן 0.1 ומיקרוליטר אחד של תערובת DNTP לכל אחד מהצינורות.לאחר מכן הוסיפו שני מיקרוליטרים של מים שטופלו ב-DEPC לצינורות 1 עד 4. הוסף ארבעה microliters של 5 מילימולרים ddATP לצינור חמש, ארבעה microliters של חמישה מילימולרים ddTTP לצינור שש וארבעה microliters של 5 מילימולרים ddCTP לצינור שבע ואחד microliter של חמישה מילימולרים ddGTP ושלושה microliters של מים שטופלו DEPC צינור שמונה פיגט ארבע פעמים לערבב. לאחר חימום כל צינורות PCR ב 52 מעלות צלזיוס במשך דקה אחת במחזור תרמי, להוסיף מיקרוליטר אחד של תעתיק הפוך לכל צינור אותו למעלה ולמטה ארבע פעמים כדי לערבב.הדגירה את התגובות ב 52 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות במחזור התרמי. כדי הידרוליזה RNA, להוסיף microliter אחד של חמישה נתרן הידרוקסיד טוחן לתוך כל הצינורות לחמם אותם ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של חומצה הידרוכלורית אחת כדי לנטרל את התגובה ולחזור על משקעים אתנול כפי שתואר קודם לכן.לאחר ייבוש האוויר את גלולת ה- DNA במשך חמש דקות, להוסיף 10 microliters של מים ו 10 microliters של 2xTBE אוריאה מדגם חיץ טעינה בצינורות 1.7 מיליליטר צינורות צינור אותו למעלה ולמטה 10 פעמים כדי להתגייס מחדש. מחממים את הדגימות ב 70 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולאחר מכן מניחים את הצינורות על קרח, לפני טעינה על הג'ל. טען 10 מיקרוליטרים של הדגימה שהונחה על קרח על 8%ג'ל רצף פוליאקרילמיד.הפעל את הג'ל ב 65 וואט במשך שעתיים או עד הצבע התחתון מגיע 3/4ths של הג'ל. הסר את הרווח בעדינות להכניס מרית כדי להסיר את צלחת זכוכית סיליקון העליון. מכסים את הג'ל בפיסת נייר סינון גדול ולחץ בעדינות כדי לאפשר לג'ל לדבוק בנייר הסינון.החל מהסוף התחתון, להרים את נייר המסנן ולהסיר את הג'ל מצלחת הזכוכית יחד עם הנייר. לאחר העברת הג'ל לנייר עטיפה כפי שנעשה בעבר, ייבשו אותו ב-70 מעלות צלזיוס למשך שעה עם ואקום, ודאגו להשתמש בכמה ניירות סינון בין הג'ל למייבש. מעבירים את כריך הג'ל לקלטת מסך אחסון זרחן מולבן וחושפים את הרדיואקטיביות של הג'ל למסך במשך ארבע עד 16 שעות.לבסוף, מניחים את מסך אחסון הזרחן על מכשיר הדמיה וסורקים ברזולוציה בינונית במשך כ-30 דקות. לאחר חשיפת ג'ל רצף פוליאקרילמיד למסך אחסון הזרחן, ניסוי צורה מוצלח הראה עיקול יחיד ואינטנסיבי ביותר בחלק העליון של הג'ל ומתכופף ברחבי הג'ל ברזולוציית נוקלאוטיד אחת ללא מריחה. הג'ל גם הראה כי העוצמה של כמה עיקולים השתנה בנוכחות מולקולות קטנות, המציין שינויים של כוח זיווג הבסיס.בעיה נפוצה בניתוח דף היא שאזור מריחה המכונה חזית המלח עשוי להופיע באמצע הג'ל, כנראה בשל ריכוז גבוה של מלח, DMSO או חומר לא רצוי אחר בדגימה טעינה. זה יכול להימנע על ידי הסרת החומר הלא רצוי על ידי משקעים אתנול. תבנית RNA הומוגנית עדיפה על צורת במבחנה.אנו משתמשים ריבוזום בשני קצוות ראשוניים ושלושה ראשוניים כדי להשיג RNA כזה. ניתן לבצע צורה בתא גם כדי לקבל מבנה משני RNA בהקשר התאי. זכור, בצורת במבחנה לא יכול לסכם מחדש vivo RNA מחייב אינטראקציות חלבון.צורת במבחנה היא שיטה רבת עוצמה לגילוי שינויים במבנה RNA בשל נוכחותה של מולקולה קטנה. הדבר נעשה על-ידי כימות שינויים בעוצמת התבנית של עצירות תעתיק הפוכות. היזהר שכל הניסויים המתוארים בסרטון זה יבוצעו במקום עבודה רדיואקטיבי מורשה עם הגנה אישית מתאימה ומיגון פלקסיגלס.

using-vitro-cell-shape-to-investigate-small-molecule-induced-pre-mrna

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

בשל האופי החולף של mRNA מראש, זה יכול להיות קשה לבודד...

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

acylation הידרוקסיל '2 סלקטיבית תפוקה גבוהה נותח על ידי הארכה תחל (SHAPE) מנצל כימי רומן חיטוט טכנולוגיה, שעתוק לאחור, אלקטרופורזה נימים ותוכנות לחיזוי מבנה משנית כדי לקבוע את המבנים של RNAs מכמה מאה עד כמה אלף נוקלאוטידים ברזולוציה נוקלאוטיד יחידה.

חיזוי מבנה המשני RNA באמצעות SHAPE תפוקה גבוהה

במאמר זה וידאו, אנו מתארים את הסינתזה במבחנה של mRNA שונה לזירוז של ביטוי חלבון בתאים.

במבחנת הסינתזה של mRNA השתנה לאינדוקציה של ביטוי חלבון בתאים אנושיים

כאן אנו מתארים בדיקת גן מדווח מבוססת תאים ככלי רב ערך לסינון ספריות כימיות עבור תרכובות המווסתות מנגנוני בקרה פוסט-שעתוק המופעלים באמצעות 3' UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור ויזואליזציה, זיהוי, ניתוח ומעקב של סחר האנטי-מסוגגני mRNA בחיים Drosophila ילה מלאנוסטר תא ביצה באמצעות משואות מולקולריות, מיקרוסקופיה דיסק מסתובב, וניתוח קוד פתוח תוכנה.

חזותי ומעקב אחר mRNAs בשידור חי דרוזוסופילה מלאנוגסטר צ'יימברס

נייר זה מציג שיטות לגידול מיוציטים לבביים עם צורות שונות, המייצגות פתולוגיות שונות, ומיון מיוציטים לביים דבקים אלה בהתבסס על המורפולוגיה שלהם ברמת תא אחד. הפלטפורמה המוצעת מספקת גישה חדשנית לתפוקה גבוהה והקרנת סמים עבור סוגים שונים של אי ספיקת לב.

גישה לחקר תעתיק תלוי צורה ברמת תא יחיד

מעקב אחר אירועי תרגום בודדים מאפשר מחקרים קינטיים ברזולוציה גבוהה של מנגנוני תרגום תלויי כובע. כאן אנו מדגימים מבחנה במבחנה של מולקולה אחת המבוססת על אינטראקציות הדמיה בין נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית לפפטידים המתהווים המתויגים באפיטופ. שיטה זו מאפשרת אפיון מולקולה אחת של קינטיקה של חניכה והתארכות פפטיד במהלך תרגום פעיל תלוי כובע במבחנה.

מבחני הדמיה של מולקולות בודדות במבחנה לניתוח קינטיקה של תרגום תלוי-כובע

אנו מציגים טכניקה לייצוב מהיר של מתחמים תרגומיים (ביוסינטזה של חלבונים) עם קשרים צולבים פורמלדהידים בתאי שמרים ויונקים חיים. הגישה מאפשרת לנתח מתווכים ארעיים ואינטראקציות דינמיות של RNA:חלבון. ניתן להשתמש במתחמים המקושרים ביישומים מרובים במורד הזרם, כגון בשיטות פרופיל מבוססות רצף עמוק, מיקרוסקופיה וספקטרומטריית מסה.

קיבוע מהיר ב- Vivo ובידוד מתחמים תרגומיים מתאי אוקריוטיים

הפרוטוקול מספק הוראות לשינוי RNA עם דימתיל סולפט לניסויים בפרופיל מוטציות. הוא כולל בדיקה במבחנה ו - in vivo עם שתי שיטות הכנה חלופיות לספרייה.

בדיקת מבנה RNA עם פרופיל מוטציה של דימתיל סולפט עם ריצוף במבחנה ובתאים

המבנה המשני של ה-RNA נצפה בעיקר ב-RNA בוגר בשיטות בדיקת מבנה. רצף מעקב מבנה קו-טרנספריפליונלי (CoSTseq) מאחד את ריצת הגרעין, ששימשה לחקר מיקום הפולימראז על RNA מתהווה, עם חקירת מבנה. כך CoSTseq מאפשר תצפית על מבנה ה-RNA המשני ב-RNA תחת שעתוק פעיל.

ניתוח השוואתי של מבנה RNA של תעתיקים צעירים ובוגרים ב-Saccharomyces cerevisiae

פרוטוקול זה מתאר בדיקה ויזואלית באמצעות דיווחי RNA ברוקולי מפוצלים לזיהוי וכימות של זיווג בסיסים בין-מולקולריים באשכולות RNA במבחנה.

הדמיה וכימות של זיווג בסיסי RNA בין-מולקולריים באשכולות RNA במבחנה באמצעות דיווחי RNA ברוקולי מפוצל

למדו פרוטוקולי SHAPE לבחינת מבנה משני של pre-mRNA בנוכחות מולקולות קטנות. השיטה מאפשרת לחקור דינמיקת RNA ואינטראקציות מולקולריות בצורה יעילה וחסכונית.

שימוש בחוץ גופית וצורה בתא לחקור מולקולה קטנה המושרה שינויים מבניים Pre-mRNA

גלה סרטונים נוספים