Name: תא Fractionation של תאים U937, בהעדר צנטריפוגה במהירות גבוהה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: למדו פרקציית תאים של U937 ללא צנטריפוגה במהירות גבוהה. שיטה זו מאפשרת בידוד של ממברנת פלזמה, ציטופלזמה ומיטוכונדריה לניתוח לוקליזציית חלבונים באימונובלוטינג.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה נתמכה על ידי NIH-1R15HL135675-01 כדי טימותי ג' רוקה

1. מכינים Buffers וראגנטים
הערה: ראה טבלה 1.
<ol><li>להכין פתרונות של מאגר A, פירוק מאגר B, מאגר מדגם digitonin.<ol>
<li>להכין מאגר על-ידי הוספת 8.77 g של NaCl ו- 50 מ של HEPES (1 מ', pH 7.4) יונים 900 מל מים, לכוון עוצמת הקול הסופי כדי 1 ליטר עם מים יונים. הערה: ריכוזי הסופי הם 150 מ מ NaCl 50 מ מ HEPES.</li>
		<li>הכנת מאגר פירוק B על-ידי הוספת 20 מ של HEPES (1 מ', pH 7.4), 0.75 גר' אשלגן כלורי, 0.19 גר' MgCl2, 2 מ ל חומצה Ethylenediaminetetraacetic (0.5 M EDTA), 2 מ של-אתילן גליקול-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-חומצה tetraacetic (0.5 M EGTA) , 38.26 g של מניטול ו- g 23.96 של סוכרוז עד 900 מ"ל של מים יונים, לכוון עוצמת הקול הסופי כדי 1 ליטר מים יונים. הערה: ריכוזי הסופי הם 20 מ מ HEPES, 10 מ מ אשלגן כלורי, 2 מ מ MgCl2, 1 מ מ EDTA, 1 מ"מ EGTA, 210 מ מ מניטול וסוכרוז 70 מ"מ.</li>
		<li>להכין מאגר לדוגמה על-ידי הוספת 0.01 גר' נתרן גופרתי dodecyl (מרחביות) 10 מ ל תמיסת באגירה טריס (TBS) ריכוז סופי של 0.1% מרחביות.</li>
		<li>להכין פתרון מניות של digitonin על-ידי הוספת 25 מ ג של digitonin 100 מ של מים יונים (הריכוז הסופי הוא 250 µg/mL).</li>
		<li>אחסן את כל מאגר הפתרונות ב 4 ° C ו digitonin ב-20 ° C עד תחילת הניסוי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין טרי פתרונות של מעכבי פרוטאז, פוספטאז להוסיף מאגר פתרונות לפני תוספת לתאים.<ol>
<li>להכין פתרון מניות של פלואוריד phenylmethanesulfonyl (PMSF) על-ידי הוספת 17.4 מ"ג של PMSF 1 מ"ל אתנול 100% (הריכוז הסופי הוא 100 מ מ). התראה: ללבוש ציוד מגן מתאים וזהירות פעילות גופנית בעת טיפול PMSF. PMSF הוא מסוכנים אם בולעים אותם מעט מסוכן במקרה של מגע עם העור (גירוי), קשר עין (גירוי) או שאיפה; . זה שמשחית העיניים והעור.</li>
		<li>להכין קוקטייל מעכב פרוטאז זמינים מסחרית (100 ×) לפי הוראות היצרן (ראה את הטבלה של חומרים).</li>
		<li>להכין פתרון מניות של נתרן orthovanadate (SOV) על-ידי הוספת 92 מ ג SOV 1 מ"ל של מים יונים (הריכוז הסופי הוא 500 מ מ). התראה: ללבוש ציוד מגן מתאים, נהג בזהירות בעת הטיפול. SOV הוא מסוכן במקרה של קשר עין (גירוי), בליעה או שאיפה. חשיפת יתר חמורה יכולה לגרום למוות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PBS לשטוף
<ol><li>להתרכז ולשטוף תאים בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) לפני fractionation.<ol>
<li>צנטריפוגה תא ההשעיה במהירות המתאימה ליצירת גלולה. לדוגמה, centrifuge השעיה של תאים U937 ב × 400 g למשך 10 דקות.</li>
		<li>הסר את תגובת שיקוע, resuspend תא גלולה ב- PBS בטמפרטורת החדר-ריכוז סופי של 4 × 106 תאים למ"ל, פיפטה בעדינות כדי לשבור את הגושים.</li>
		<li>Centrifuge התליה תא ב × 400 g 10 דקות הצניפה תאים.</li>
		<li>הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend צנפה תא קר כקרח מאגר A-ריכוז סופי של 2 × 107 תאים למ"ל. הערה: כל השלבים הבאים צריך להתבצע ב 4 ° C או על קרח, כל מאגרי צריך להיות טרום מקורר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. בידוד חלבון cytosolic
<ol><li>תמצית חלבונים cytosolic על ידי דגירה עם digitonin דטרגנט.<ol>
<li>מייד לפני resuspension של תאים (שלב 3.1.3) להוסיף µL 10 מניות PMSF (100 מ מ), 10 µL של מעכבי פרוטאז (100 ×), µL 2 מניות SOV (500 מ מ) ו- µL 100 של digitonin מניות (250 µg/mL) כדי µL 878 מאגר A (ריכוזים הסופי הם 1 מ מ PMSF , 1 × מעכב פרוטאז, 1 מ"מ SOV, digitonin µg/mL 25; לכוון את עוצמת הקול הסופי לפי מספר התאים בשימוש). לשמור את הפתרון על הקרח עד בנוסף תא גלולה.</li>
		<li>Centrifuge התליה תא ב × 400 g 10 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע.</li>
		<li>Resuspend בגדר תא ב בופר A המכיל מעכבי ו digitonin (להכין בשלב 3.1.1)-ריכוז סופי של 2 × 107 תאים למ"ל, פיפטה בעדינות כדי לשבור את הגושים.</li>
		<li>דגירה התליה תא על מסובב מעל קצה--4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.</li>
		<li>Centrifuge התליה תא ב × 400 g עבור 10 דקות לאסוף את תגובת שיקוע ומניחים אותו בתוך שפופרת צנטרפוגה נקי.</li>
		<li>Centrifuge את תגובת שיקוע שנאספו ב × 18,000 g למשך 20 דקות הצניפה פסולת הסלולר.</li>
		<li>להעביר את תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה נקי.</li>
		<li>חזור על שלבים ו 3.1.5 3.1.6 עד אין גלולה מתקבל לאחר צנטריפוגה.</li>
		<li>לאסוף את תגובת שיקוע המכיל חלבונים cytosolic ואחסן אותו ב 4 ° C (תקופות קצרות) או-20 ° C (לטווח ארוך).</li>
	</ol>
</li>
	<li>להסיר את עודף digitonin, חלבונים cytosolic על ידי צנטריפוגה.<ol>
<li>Resuspend בגדר תא digitonin-permeabilized (מתוך שלב 3.1.5) במאגר A-ריכוז סופי של 4 × 106 תאים למ"ל, פיפטה בעדינות כדי לשבור את הגושים.</li>
		<li>Centrifuge התליה תא digitonin-permeabilized ב × 400 g 10 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע. הערה: ניתן לבצע חוזרות שוטף במאגר A כדי להסיר עודפי מזהמים cytosolic.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. תא המגון
<ol><li>דגירה התאים על הקרח במאגר פירוק B ואת lyse אותם באמצעים מכניים.<ol>
<li>מייד לפני resuspension של תאים (שלב 4.1.2) להוסיף µL 10 מניות PMSF (100 מ מ) µL 2 מניות SOV (500 מ מ) µL 988 פירוק מאגר B (ריכוזים הסופי הם 1 מ PMSF ו 1 מ"מ SOV; להתאים את עוצמת הקול הסופי כדי להכיל את מספר התאים להיות lysed) ולשמור על solu tion על הקרח עד בנוסף תא גלולה.</li>
		<li>Resuspend בגדר תא (מתוך שלב 3.2.2) תוך קר כקרח פירוק B בופר המכילה PMSF ו SOV (להכין בשלב 4.1.1)-ריכוז סופי של 4 × 106 תאים למ"ל.</li>
		<li>דגירה התליה תא על קרח למשך 30 דקות.</li>
		<li>להעביר את המתלים תא מהמגן דאונס טרום מקורר (עם B ההדוקות כבעלי) על הקרח ולבצע עובר 40 עם איחדו מהמגן בתנועות איטיות, משיחות אפילו. הערה: לחלופין לנצל אמצעים אחרים של פירוק מכני תא כמפורט בסעיף הדיון.</li>
		<li>לאסוף את homogenate, להעביר אותו שפופרת צנטרפוגה נקי.</li>
		<li>לשטוף מהמגן איחדו את התחתית עם נפח קטן (1-2 מ ל) של פירוק מאגר B ולהוסיף אותו homogenate.</li>
		<li>Centrifuge את homogenate × 400 גרם (או את המהירות המינימלי הנדרש כדי הצניפה תאים רצופה) למשך 10 דקות.</li>
		<li>להעביר את תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה נקי. הערה: אם גלולה משמעותי נותר חזור על שלבים 4.1.4 דרך 4.1.6 להגברת שברים כמו מפורט במקטע דיון. ניתן להשהות את הפרוטוקול פה, homogenate השמורים ב 4 ° C לטווח קצר (24 שעות).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. צנטריפוגה דיפרנציאלית
<ol><li>Centrifuge את homogenate בהגברת מהירויות להסרת פסולת הסלולר, המיטוכונדריה ולבודד ושברים ממברנה.<ol>
<li>Centrifuge את תגובת שיקוע (מתוך שלב 4.1.8) ב × 500 g עבור תגובת שיקוע העברת 10 דקות כדי שפופרת צנטרפוגה נקי, ולמחוק את כל גלולה.</li>
		<li>Centrifuge תגובת שיקוע (מתוך שלב 5.1.1) ב × 1000 גרם במשך 10 דקות להעביר את תגובת שיקוע על שפופרת צנטרפוגה נקי, ולמחוק את כל גלולה.</li>
		<li>Centrifuge את תגובת שיקוע (מתוך שלב 5.1.2) ב × 2,000 g עבור 10 דקות להעביר תגובת שיקוע על שפופרת צנטרפוגה נקי, ולמחוק את כל גלולה.</li>
		<li>Centrifuge את תגובת שיקוע (מתוך שלב 5.1.3) ב × 4,000 גרם במשך 15 דקות העברה תגובת שיקוע על שפופרת צנטרפוגה נקי, לשמור על גלולה המכילה המיטוכונדריה.</li>
		<li>Resuspend בגדר המיטוכונדריה באמצעי אחסון קטן (0.5\u20121 מ"ל) פירוק מאגר B.</li>
		<li>Centrifuge בגדר תנאי ב × 4,000 גרם במשך 15 דקות להסיר את תגובת שיקוע ואת resuspend מיטוכונדריאלי צניפה בהיקף הסופי הרצוי של מאגר מדגם (למשל, 250 עד 500 µL, בהתאם לגודל בגדר והרצוי ריכוז).</li>
		<li>צנטריפוגה תגובת שיקוע (מתוך שלב 5.1.4) ב × 4,000 גרם במשך 15 דקות להעביר את תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה נקי. חזור על שלב זה עד אין גלולה מתקבל לאחר צנטריפוגה.</li>
		<li>לסובב את תגובת שיקוע ב × 18,000 g עבור 3 שעות.</li>
		<li>הסר את תגובת שיקוע, ולשמור את גלולה המכילה חלבונים ממברנה. Resuspend בגדר ממברנה באמצעי אחסון קטן (0.5-1 מ ל) של פירוק מאגר B.</li>
		<li>Centrifuge בגדר תנאי ב × 18,000 g עבור 1 h.</li>
		<li>הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר ממברנה באמצעי הסופי הרצוי דוגמת המאגר (250 עד 500 µL, בהתאם לגודל של גלולה, הריכוז הרצוי).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sonicate כדורי מדגם 3 s באמבט קרח בקביעה כוח של 5 (50% של 125 כוח מרבי W ב-20 קילו-הרץ, ראה טבלה של החומרים).</li>
	<li>אחסן את הדגימות ב 4 ° C (תקופות קצרות) או-20 ° C (לטווח ארוך).</li>
	<li>לבחון את הדגימות טוהר של fractionation על ידי ביצוע של תספיג ניצול נוגדנים נגד סמני חלבונים נמצאו בתאים ציטופלזמה, המיטוכונדריה, הממברנה של התא (עיין בסעיף התוצאות נציג).</li>
</ol>

<ol><li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li>
<li>Hwang, S. II, Han, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+fractionation+for+identification+of+biomarkers%3A+Serial+detergent+extraction+by+subcellular+accessibility+and+solubility%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility.</a> Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).</li>
<li>Song, Y., Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+project+for+the+subcellular+proteome+of+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver.</a> Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).</li>
<li>Lenstra, J. A., Bloemendal, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+of+the+total+protein+population+from+cultured+cells+upon+fractionation+by+chemical+extractions%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Topography of the total protein population from cultured cells upon fractionation by chemical extractions.</a> European Journal of Biochemistry. 135 (3), 413-423 (1983).</li>
<li>Michelsen, U., von Hagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+19+Isolation+of+Subcellular+Organelles+and+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Chapter 19 Isolation of Subcellular Organelles and Structures.</a> Methods in Enzymology. 463 (C), 305-328 (2009).</li>
<li>Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+isolation+of+mitochondria+for+proteomic+analyses%29%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses).</a> Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).</li>
<li>Williamson, C. D., Wong, D. S., Bozidis, P., Zhang, A., Colberg-Poley, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Endoplasmic+Reticulum%2C+Mitochondria%2C+and+Mitochondria-Associated+Membrane+and+Detergent+Resistant+Membrane+Fractions+from+Transfected+Cells+and+from+Human+Cytomegalovirus-Infected+Primary+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of Endoplasmic Reticulum, Mitochondria, and Mitochondria-Associated Membrane and Detergent Resistant Membrane Fractions from Transfected Cells and from Human Cytomegalovirus-Infected Primary Fibroblasts.</a> Current protocols in cell biology. 68, 3.27.1-3.27.33 (2015).</li>
<li>Sundström, C., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+histiocytic+lymphoma+cell+line+%28U-937%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937).</a> International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAPDH+as+a+housekeeping+gene%3A+analysis+of+GAPDH+mRNA+expression+in+a+panel+of+72+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues.</a> Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).</li>
<li>Hodge, T., Colombini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+metabolite+flux+through+voltage-gating+of+VDAC+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels.</a> Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).</li>
<li>Therien, aG., Blostein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+sodium+pump+regulation.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology.</a> Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).</li>
<li>Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2CK-ATPase+transport+from+endoplasmic+reticulum+to+Golgi+requires+the+Golgi+spectrin-ankyrin+G119+skeleton+in+Madin+Darby+canine+kidney+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).</li>
<li>McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemia+potentiates+a+shift+from+apoptosis+to+RIP1-dependent+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discovery%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis.</a> Cell Death Discovery. 4, 55(2018).</li>
<li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogenization+of+Mammalian+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Homogenization of Mammalian Tissue.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), (2010).</li>
</ol>

המחברים מצהירים אין ניגוד אינטרסים

הפיתוח של פרוטוקול זה עלתה מחוסר היכולת להפריד מיטוכונדריאלי ודוגמאות ממברנה, באמצעות ערכות זמינים מסחרית, לניתוח של חלבון לוקליזציה במהלך necroptosis14. המגבלות העיקרי של ערכות premade הם היכולת שלהם להתאים את הצרכים של חוקרים בודדים, שלהם עלות לדוגמה, מספר מצומצם של דוגמאות מסוגל להיות מעובד. השיטה המוצגת כאן יכול להתבצע ללא שימוש ריאגנטים יקר וללא הצורך של ציוד יקר. בשיטה זו וניתן לשנותם כדי להכיל כל מספר של תאים, והוא מסוגל להיות משתנה בהתאם לצרכים של חוקרים. פעולה זו מאפשרת את התשואה של כל שב...

זיהוי אמין של חלבון לוקליזציה הכרחי לעתים קרובות בעת בחינת מסלולים מולקולריים בתאים האיקריוטים. שיטות להשגת שברים subcellular מנוצלים על ידי חוקרים לבחון מקרוב את מרכיבי התא עניין.
רוב שיטות קיימות fractionation תא בדרך כלל נחלקים לשתי קטגוריות רחבות, המבוסס על אבקת1,2 ומבוסס-ultracentrifugation3,4,5, אשר יכול להיות מובחנת על ידי מהירות, דיוק ועלות. דטרגנט פרוטוקולים מבוסס מסתמכים על השימוש במאגרים עם הגדלת כוח דטרגנט solubilize רכיבים נפרדים של התא. זו היא שיטה מהירה ונוחה לעיבוד דגימות והוא יכול להיות העלות האפקטיבית אם המספר והגודל של דגימות קטנות. ניתן לרכוש ערכות המבוסס על אבקת לבודד cytoplasmic ממברנה/אברון (שבר מעורב), שברים גרעיני תאים. עם זאת, מספר חסרונות הקשורים עם ערכות אלה להגביל את התועלת שלהם לחוקרים. הם נועדו בקלות לבודד את מרכיבי התא אחד או שניים, אך אינם מסוגלים לבודד כל שברים מתוך מדגם בו-זמנית. השימוש של דטרגנטים אומר כי קרום פלזמה של organelles מוקף קרום להיות באותה מידה solubilized ולכן אין אפשרות להיות מופרדים אחד מהשני. סיבוך נוסף נובע הרכיבים קניינית ערכות אלה אשר מונעת חוקרים שינוי התנאים עבור יישומים ספציפיים. לבסוף, הם מוגבלים למספר שימושים, עשוי להיות יקר מדי עבור ניסויים בקנה מידה גדול יותר. ערכות בסיס חומרי שאינם קיימים עבור בידודו של המיטוכונדריה, עם זאת, הם לא נועדו כדי לבודד קרום פלזמה, התשואה מדגם הוא משמעותית פחות מזה של צפיפות צנטריפוגה מבוסס בידוד פרוטוקולים6,7 .
שיטות לנצל ultracentrifugation להשיג שברים הם יותר זמן צריכת, אבל לעתים קרובות התוצאה בחלקים מזוכך יותר ערכות מבוססי דטרגנט. כדי לבודד ממברנות פלזמה מתאי ללא הראשון solubilizing אותם (וכתוצאה מכך זיהום עם קרום organelles) דורש מהם כדי להיות lysed על ידי שיטה ללא חומרי ואחריו ההפרדה של מרכיבי התא באמצעות דיפרנציאל צנטריפוגה — עם בידוד קרום פלזמה הדורשים מהירויות של × 100,000 g כדי להשיג. במקרים רבים, צנטריפוגה דיפרנציאלית חייב להיות במעקב על-ידי isopycnic צפיפות הדרגתיות צנטריפוגה להפרדה נוספת של שברים הסלולר או הסרה של מזהמים. בעוד ששיטות אלה הם יסודי ומשתנות, החסרונות כוללים עלות צריכת זמן, את הצורך ultracentrifuge על הפרדה בין שברים ומספרים נוספים טיהור באמצעות צפיפות הדרגתיות צנטריפוגה. צנטריפוגות במהירות גבוהה ביותר הן בעלות זה אוסרני עבור חוקרים בודדים ולעיתים קרובות משותף, ליבה של ציוד במוסדות אקדמיים. לפיכך, זמינות ultracentrifuge הופך אוסרני במצבים אלה.
ב פרוטוקול fractionation זה נדגים את ניתוקה של שברים subcellular ללא שימוש solubilizing דטרגנטים וללא צנטריפוגה במהירות גבוהה. שיטה זו תאפשר חוקרים לבודד את קרום פלזמה, המיטוכונדריה, cytoplasmic מרכיבי תא האיקריוטים עם זיהום מזערי בין שברים.

<table><tbody><tr><td>Digitonin</td><td>TCI Chemicals</td><td>D0540</td><td>למיצוי ציטופלזמה</td></tr><tr><td>D-מניטול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M4125</td><td>עבור מאגר ליזה B</td></tr><tr><td>Dounce הומוגנייזר</td><td>VWR</td><td>22877-282</td><td>להומוגניזציה</td></tr><tr><td>מסובב קצה</td><td>על הקצה Barnstead</td><td>N/A</td><td>למיצוי ציטופלזמה</td></tr><tr><td>אתילן גליקול-ביס(&בטא;-אתר אמינואתיל)-N,N,N' ,N'-tetraacetic acid (EGTA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61721</td><td>עבור מאגר ליזה B</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td>עבור מאגר ליזה B</td></tr><tr><td>GAPDH (14C10)</td><td>Cell Signalling Technologies</td><td>2118</td><td>לזיהוי שברים ציטופלזמיים על כתם מערבי, דילול: 1:10000</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>J848</td><td>עבור מאגרי ליזה A ו-B</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>עבור מאגר ליזה B</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Alfa Aesar</td><td>12315</td><td>עבור מאגר ליזה B</td></tr><tr><td>Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)</td> <td>טכנולוגיות איתות תאים</td><td>23565</td><td>לזיהוי שברי קרום פלזמה על כתם מערבי, דילול: 1:1000</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td>עבור מאגר ליזה A</td></tr><tr><td>פנילמתאן סולפוניל פלואוריד (PMSF<חזק>)</חזק></td><td>VWR</td><td>M145</td><td>למיצוי ציטופלזמה והומוגניזציה</td></tr><tr><td>סוניקטור בדיקה</td><td>מאגר Qsonica</td><td>Q125-110</td><td>לדגימות סופיות</td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז, שימוש כללי</td><td>VWR</td><td>M221-1ML</td><td>למיצוי ציטופלזמה</td></tr><tr><td>צנטריפוגה מקוררת</td><td>בקמן-קולטר</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS)</td> <td>VWR</td><td>227</td><td>עבור מאגר מדגם</td></tr><tr><td>נתרן אורתוואנדאט (SOV)</td> <td>450243 סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td>עבור מאגרי ליזה A ו-B</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S0389</td><td>עבור מאגר ליזה B</td></tr><tr><td>תמיסת מלח עם חוצץ טריס (TBS)</td> <td>VWR</td><td>788</td><td>עבור מאגר מדגם</td></tr><tr><td>VDAC (D73D12)</td> <td>טכנולוגיות איתות תאים</td><td>4661</td><td>לזיהוי שברים מיטוכונדריאלים בכתם מערבי, <דילול u>: 1:1000</td></tr></tbody></table>

תא fractionation של תאים u937, בהעדר צנטריפוגה במהירות גבוהה

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

ב פרוטוקול זה אנחנו מפרטים שיטה להשיג שברים subcellular של תאים U937 ללא שימוש ultracentrifugation או בדטרגנטים ללא הבחנה. שיטה זו משתמשת מאגרי היפוטוניק, digitonin, פירוק מכני, צנטריפוגה דיפרנציאלית כדי לבודד את הציטופלסמה, המיטוכונדריה ואת קרום פלזמה. התהליך וניתן לשנותם כדי להתאים את הצרכים של החוקרים, היא פעולה פשוטה וזולה. שיטה זו יאפשר לחוקרים לקבוע לוקליזציה של חלבונים בתאים ללא בדיקות מיוחדות וללא שימוש קיטים מסחריים, אשר שניהם ניתן לחדשו. אנחנו משתמשים בהצלחה זו שיטה להפרדת cytosolic, קרום פלזמה, חלבונים מיטוכונדריאלי בקו התא האנושי מונוציט U937.

Fractionation מוצלחת של U937 מובחן8 תאים גדל ההשעיה הושג באמצעות פרוטוקול שתוארו לעיל, מאויר באיור1. הדגימות שהושג עם שיטה זו היו נענשים המערבי סופג9 ניצול שיטת העברה רטוב כדי קרום פלואוריד (PVDF) polyvinylidene. הקרום נבדקה לאחר מכן עם נוגדנים נגד cytoplasmic, מיטוכונדריאלי, ממברנה מקומי סמני חלבונים (איור 2, איור 3, איור 4</strong...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד את קרום פלזמה, הציטופלסמה ואת המיטוכונדריה U937 תאים ללא שימוש צנטריפוגה במהירות גבוהה. טכניקה זו ניתן לטהר שברים subcellular הבאים בחינת לוקליזציה חלבון באמצעות immunoblotting.

תא Fractionation של תאים U937, בהעדר צנטריפוגה במהירות גבוהה

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים להשיג שברים ברורים של תא ללא שימוש בציוד מיוחד, רייגנטים יקרים או טכניקות מורכבות. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא הפשטות של הטכניקות המאפשרות לו להיות ניתן לשכפול וקל לביצוע. הדגמת ההליך יהיה מאט Deragon, רוב Haluska ואלכסה הודג'ס.שלושה סטודנטים לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להתחיל צנטריפוגה ההשעיה התא מוכן כדי ליצור גלולה. הסר את supernatant ולהשעות מחדש את גלולה בטמפרטורת החדר PBS. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 400 xg במשך עשר דקות. ואז להסיר את supernatant מחדש להשעות את גלולת התא במאגר קר קרח. הכנת מאגר פתרון בהתאם לפרוטוקול הטקסט. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 400 xg במשך עשר דקות ולהסיר את supernatant. להשעות מחדש את גלולה במאגר פתרון לריכוז סופי של 200 מיליון תאים לכל מ"ל, ו pipette בעדינות כדי לשבור את כל הגושים. לאחר דגירה זו ההשעיה התא על קצה מעל מסובב קצה ב 4

cell-fractionation-u937-cells-absence-high-speed

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

סרטון זה מתאר את הכנת השברים התת-תאיים מתאים לוקמיים, שהיא שיטה ליצירת שברים תאיים וגרעיניים מתאים לוקמיים. ניתן להשתמש בשברים הגרעיניים והציטופלזמיים לניתוח נוסף במורד הזרם.

הכנת שברים תת-תאיים מתאים לוקמיים: שיטה ליצירת שברים תאיים וגרעיניים מתאים לוקמיים

בסרטון זה, אנו מדגימים את הבידוד של תאים חד-גרעיניים lamina propria מרקמת המעי הגס על ידי עיכול אנזימטי באמצעות collagenase E והפרדת צפיפות מבוססת סיליקה הפרדת מדיה הדרגתית. התאים החד-גרעיניים המבודדים יכולים לשמש לניתוח במורד הזרם.

Lamina Propria בידוד תאים חד-גרעיניים: טכניקת צנטריפוגה הדרגתית מבוססת סיליקה להשגת תאים חד-גרעיניים מהמעי הגס של מורין

הסרטון מדגים בידוד של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים חודרי גידול ממוח עכבר באמצעות דיסוציאציה מכנית ועיכול אנזימטי. זה ואחריו צפיפות הדרגתית צנטריפוגה לאסוף את התאים החיסונית לניתוח נוסף.

בידוד תאי חיסון חודרי גידול ממוח מוריני

פרוטוקול זה מתאר דיסוציאציה לא אנזימטית מהירה של שברי רקמות אנושיות טריות לצורך הערכה איכותית וכמותית של תאי CD45+ (לימפוציטים/לויקוציטים) הקיימים ברקמות אנושיות נורמליות וממאירות שונות. בנוסף, ניתן לאסוף ולאחסן את הסופרנטנט המתקבל מהרקמה הראשונית הומוגנטית לצורך ניתוח או ניסויים נוספים.

פרוטוקול פשוט ומהיר לללא אנזימי רקמות אנושיות טריות לנתק לניתוח להחדרה לימפוציטים

מוצג כאן היא שיטה פשוטה לניתוח cytometric הבידוד וזרימה של תאי דם היקפי mononuclear הסתננות-גליומה שמניב נתונים כמותיים זמן תלוי במעמד המספר והפעלת תאים חיסוניים הנכנסים למייקרו-סביבת גידול במוח מוקדם.

בידוד וניתוח תזרים cytometric של תאי הדם ההיקפיים mononuclear הסתננות-Glioma

פרוטוקול זה מתאר את השימוש elutriation צנטריפוגלי כדי להפריד בין תאים לוקמיה לימפובלסטית חריפה העיקרי לשלבים שונים של מחזור התא.

הכנה של תאים לוקמיה לימפובלסטית חריפה העיקרית בשלבים שונים של מחזור התא על ידי צנטריפוגלי Elutriation

פרוטוקול זה מאפשר אופטימיזציה ולאחר מכן הדור יעיל של שברים גרעיניים ו cytoplasmic מתאי לוקמיה לימפוציטית כרונית ראשית. דגימות אלה משמשות כדי לקבוע לוקליזציה חלבונים, כמו גם שינויים בסחר בחלבונים המתרחשים בין התאים הגרעיניים cytoplasmic על גירוי התא וטיפול בסמים.

שבירה משנית של תאים לוקמיה לימפוציטית כרונית ראשונית לניטור גרעיני/Cytoplasmic סחר בחלבונים

פרוטוקול פיצול זה יאפשר לחוקרים לבודד חלבונים ציטופלסמיים, גרעיניים, מיטוכונדריאליים וממברנות מתאי יונקים. שני השברים התת-תאיים האחרונים מטוהרים עוד יותר באמצעות שיפוע צפיפות איזופיקני.

פיצול תאים של תאי U937 על ידי טיהור הדרגתי בצפיפות איזופיקנית

אנו מציגים טכניקה לייצוב מהיר של מתחמים תרגומיים (ביוסינטזה של חלבונים) עם קשרים צולבים פורמלדהידים בתאי שמרים ויונקים חיים. הגישה מאפשרת לנתח מתווכים ארעיים ואינטראקציות דינמיות של RNA:חלבון. ניתן להשתמש במתחמים המקושרים ביישומים מרובים במורד הזרם, כגון בשיטות פרופיל מבוססות רצף עמוק, מיקרוסקופיה וספקטרומטריית מסה.

קיבוע מהיר ב- Vivo ובידוד מתחמים תרגומיים מתאי אוקריוטיים

עבודה זו מתארת פרוטוקול לכימות שינויים גלובליים בהיסטון באמצעות ציטומטריית זרימה תוך-גרעינית במיקרוגליה מבודדת במוח. העבודה מכילה גם את פרוטוקול בידוד תאי המיקרוגליה ששימש לאיסוף נתונים.

כימות שינויים גלובליים בהיסטון לאחר תרגום באמצעות ציטומטריית זרימה תוך-גרעינית במיקרוגליה מבודדת במוח עכבר

למדו פרקציית תאים של U937 ללא צנטריפוגה במהירות גבוהה. שיטה זו מאפשרת בידוד של ממברנת פלזמה, ציטופלזמה ומיטוכונדריה לניתוח לוקליזציית חלבונים באימונובלוטינג.

תא Fractionation של תאים U937, בהעדר צנטריפוגה במהירות גבוהה

גלה סרטונים נוספים