שיפוץ עצם מדידה ויצירה משולבת של מיקרוסביבה של עצם הגידול באמצעות Calvaria Co-תרבות והימאנורמוטוריקה
14 במרץ 2020
התרבות vivo ex של explants העצם יכול להיות כלי רב ערך לחקר הפיזיולוגיה של העצם ואת הערכה פוטנציאלית של תרופות שיפוץ העצם ומחלות העצם. הפרוטוקול המוצג מתאר את ההכנה והתרבות של calvarias מבודדים מגולגלות העכברים היילוד, כמו גם את יישומיה.
מטרת הליך זה היא להיות מודל vivo לשעבר כדי להעריך את שיפוץ העצם ולשחזר את microenvironment עצם הגידול באמצעות תרבות קלבריה או שיתוף תרבות עם תאים סרטניים. רוב טכניקת calvaria היא מערכת תרבות איברים באמצעות עצמות calvaria מעכברים יילודים כדי להעריך את שיפוץ העצם. אתה יכול לבדוק את הפוטנציאל הטיפולי של מולקולות מגוונות, או אפילו לשחזר את microenvironment גידול העצם כאשר אתה משתמש בתרבויות שיתוף עם תאים סרטניים.
כל זה בהתראה פשוטה וקלה בזמן קצר ועלות נמוכה. מטרת טכניקה זו היא לקבל כלי להערכת התחדשות העצם ב microenvironment עצם סרטן, באמצעות מודל vivo לשעבר של תרבות איברים קלבריאליים העכבר. ראשית, בחר גור עכבר והצב אותו מתחת למכסה המנוע.
אנחנו משתמשים בגולגולתא מגורי עכברים בני חמישה עד שבעה ימים. קח את הראש עם המזרק, לחתוך את העור, ולנקה את אזור הקרקפת מספיק כדי לנתח את הקלבריה. זהה את התפרים של הגולגולת, קשת, קורונדל, ו lambdoids.
לעשות חתך ישר לאורך התפרים lambdoid, על רמת העין. חותכים מכל צד, מתפרים lambdoid לכיוון התפר קורונטל. ב 45 זווית, לעשות חתך נוסף כדי לחבר את הקצה של החתך עשה עם החתך של fontanel הקדמי.
חשוב מאוד להגדיר את תפרי הגולגולת, קשתית, פרונטלית, קורונאלית, lambdoid, כדי להבטיח את הכללת הרקמה הנכונה וניתוח היסטולוגיה. עם מדפים טיפים עדין, להסיר את calvaria, ולשים אותו על כיסוי צלחת פטרי. עם אזמל, לעשות חתך ישר מן fontanel האחורי לאורך התפר sagittal דרך התפר קורונאל.
שני hemicalvarias מתקבלים. הרם כל קלבריה עם המדפים, והצב אותם בצלחת פטרי חדשה עם PBS. לתרבות, מניחים את hemicalvaria בצלחת תרבות רקמות 24 באר, המכיל מיליליטר אחד של מדיה, ודגירה במשך 24 שעות ב 37 מעלות.
אנחנו יכולים גם להשתמש בתרבויות עגליות ראשוניות כדי לשחזר את microenvironment עצם הגידול עבור resorption העצם. כדי לעשות זאת, אנו שיתוף תרבות calvarias עם תאים סרטניים, או עם מדיה מותנה של תאים סרטניים. 24 שעות לאחר מכן, להסיר את המדיה ולהחליף אותו עם מדיה המכילה את הטיפול שאתה רוצה לבדוק.
אם ברצונך להעריך תאים סרטניים ואינטראקציות עצם, או לשחזר את microenvironment עצם הגידול, להעביר את calvaria לצלחת התקשרות הסלולר נמוך, כדי למנוע את ההחזקה של תאים סרטניים לצלחת. טריפסיניזציה של התאים הסרטניים, לספור אותם, ולמקם אותם בזהירות בחלק העליון של hemicalvaria. אתה יכול גם להשתמש במדיה מותנית מתאים סרטניים, ולהשתמש בו כדי להחפיר את hemicalvaria.
דגירה במשך שישה עד שבעה ימים ב 37 מעלות, עם חמישה אחוזים CO2. ביום השלישי, לשנות את התקשורת ולהמשיך דגירה. מספר התאים המשתמשים בתרבות השיתוף תלוי בקו התאי של הסרטן.
אתה צריך, תחילה, כדי למטב את מספר התאים הדרושים כדי לגרום לתגובה באחד. לאחר התרבות, הקלבריה עוברת תהליך של קיבעון, דקלציה ופרפין מוטבע. יתר על כן, הרקמות חתוכו במיקרוטום, מוכתמות, וניתוח היסטומורפי מבוצע.
הכללת הקלבריה יכולה להיות מסובכת. כדי לוודא כי הרקמה מוגנת במהלך ההכללה, אתה יכול לשים את הרקמה בין ספוגים או להשתמש בנייר טישו או נייר סופג אחר לפני לשים אותו בקלטת. לעיבוד רקמות, לעטוף את hemicalvaria בנייר טישו.
לאחר מכן, למקם אותו לתוך קלטת הטבעה, ולתקן במאגר ניטרלי בפורמלין, במשך 24 שעות בארבע מעלות. כדי לתקן את הקלבריה, הנח את הקלטת ב- 10%EDTA למשך 48 שעות בארבע מעלות. לעבד את קלטות הרקמה עם hemicalvaria במעבד רקמות אוטומטי.
בצע מחזור סיבוב יום רגיל, ולאחר מכן, כלול בפרפין. לצורך חתך, לחתוך ארבעה חלקים מיקרוטיים עם microtome, לעלות את החלקים על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית, וכתם עם hematoxylin, אאוסין. ניתוח היסטולוגיה שימש לביצוע ניתוח כמותי של משטח העצם ושטחי שיפוץ העצמות.
התמונות של הקלבריה בשבעת הימים נותחו באמצעות תוכנת ההדמיה. עבור הערכה כמותית, ראשית, הגדר את האזור לניתוח. תסתכל בקטעים על הטלופה שבו ארבעה X כדי לזהות את האוריינטציה ואת התפרים.
הגדר את התפר התותח, וזהה את משטח העצם הארוך בצד אחד, ולאחר מכן את המשטח הקצר בצד השני. תחת ההגדלה 40X, לזהות את התפר הכתר ולהזיז שניים או שלושה שדות אופטיים מן התפר, לאורך פני השטח הארוכים. צלם את התמונה של אזור זה לצורך ניתוח.
אתה יכול להשתמש בתוכנת תמונות כדי לנתח את השלמות המבנית של העצם. ניתוח היסטומורפי כמותי לעובי ולאזור העצם של ההמיקלוואריה יכול להיעשות. ניתוח הקלבריה הנכון תלוי בהטבעה טובה ובכיוון הנכון לתוצאות היסטולוגיות עקביות.
הקפד להשתמש לפחות שלושה קלבריה לכל מצב ניסיוני. כאן, אנו יכולים לראות את מבנה העצם. בכתום, העצם נצפית.
אנחנו יכולים גם לראות את הנוכחות של periosteum, ostocyte, אנדוסטיום, וחלקים אחרים של העצם. במקרה שלנו, אנו משתמשים באינסולין כדי להגדיל את שיפוץ העצם. בהשוואה לשליטה, אנו יכולים לראות עלייה משמעותית באזור העצם.
כאן, אנו יכולים לראות את ההשפעה של קו תא מד"א-MB-231 על קלבריה מודל. אנו יכולים לראות, בהשוואה לשליטה, כי נוכחותם של תאים סרטניים לגרום גורמים osteolytic הממריצים הרס העצם. השתמשנו במודל קלבריה כדי למדוד התחדשות עצם ואינטראקציות סרטן בין עצם התא על ידי תרבויות שיתוף עם תאים סרטניים והיסטולוגיה.
אנו גם מאמתים את הנתונים שלנו לפי PCR כמותי בזמן אמת. למודל האקס ויוו הזה יש יתרונות רבים, כמו הארגון התלת מימדי והמגוון התאי של העצם נשמרים, ותנאים ניסיוניים יכולים להיות נשלטים. חוץ מזה, המודל הוא פשוט, אתה יכול לראות תוצאות בתקופה קצרה של זמן, וזה בעלות נמוכה.
וזה יכול להיות משולב עם טכניקות אחרות, כמו PCR כמותי בזמן אמת, מיקרוסקופיה, מיקרו-CT.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לתרבית ex vivo של קלבריה (עצמות הגולגולת) מעכברים רכים, במטרה לחקור פיזיולוגיה של העצם ולהעריך השפעות של תרופות על שכתוב העצם. הטכניקה מאפשרת שחזור של המיקרו-סביבה של גידולים בעצם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- פיזיולוגיה של העצם
- חילוף תאי עצם (Bone remodeling)
- ביולוגיה של הסרטן
רקע
- ניתן לתרבת רקמות עצם מושתלות (explants) כדי לחקור תהליכים פיזיולוגיים.
- גולגלות של עכברים בניונוטליים משמשות כמודל למחקרי עצם.
- תרבית משותפת (Co-culture) עם תאי סרטן יכולה לדמות את המיקרו-סביבה של הגידול בעצם.
- שיטה זו יעילה מבחינת עלויות ופשוטה לביצוע.
מטרת המחקר
- להערכת שחזור העצם במודל ex vivo.
- לבחינת הפוטנציאל הטיפולי של מולקולות שונות.
- לשחזור המיקרו-סביבה של גידול העצם.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד של calvaria מעכברים רכים.
- טכניקות תרבית ex vivo עבור שתולי עצם.
- מערכות תרבית משולבת (Co-culture) עם תאי סרטן.
- הערכה של התחדשות עצם והשפעות תרופתיות.
תוצאות עיקריות
- גידול מוצלח של calvaria למחקר של עיצוב מחדש של העצם (bone remodeling).
- יכולת לבחון סוכני טיפול בסביבה מבוקרת.
- הדגמה של שחזור מיקרו-סביבת גידול-עצם.
- השיטה הוכחה כיעילה ובעלת עלות נמוכה.
מסקנות
- תרבית Calvaria ex vivo היא כלי בעל ערך למחקר עצם.
- היא מאפשרת לחקור את השפעתם של תרופות על פיזיולוגיה של העצם.
- מערכות של תרבית משותפת (Co-culture) משפרות את ההבנה של אינטראקציות בין סרטן לעצם.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודל קלוואריה (calvaria) ex vivo זה מספק מערכת רלוונטית פיזיולוגית להערכת דינמיקת שחזור העצם ואינטראקציות בין גידול לעצם בפורמט מבוקר וניתן לשחזור. הוא מאפשר הפחתת סיכונים (de-risking) מכניסטית בשלבים מוקדמים עבור מועמדים טיפוליים המכוונים למטסטזות בעצם או לאוסטאופורוזיס, זאת על ידי שימור ארכיטקטורת הרקמה המקורית והגיוון התאי. הבדיקה תומכת בביטחון חיזוי בזיהוי מועמדים מובילים (leads) באמצעות כימות תגובות אנאבוליות וקטבוליות של העצם תחת תנאים מוגדרים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בחינת היפותזות טיפוליות בנושאי מסלולי בנייה ובליעה של עצם באמצעות שימוש באינסולין או בתיביית תאי סרטן כמודולטורים.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות מדידת שינויים בשטח העצם בתגובה לחומרים אוסטאוליטיים או אוסטאו-אקטיביים.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי תרופות על ידי הבחנה בין תרכובים המעוררים לעומת כאלה המעכבים שכתוב עצם במערכת הרלוונטית למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצרת פלטים היסטומורפומטריים כמותיים וסטנדרטיים של פני השטח של העצם ואזור השחזור לאחר קיבוע, חיתוך וצביעה.
- שחזוריות: דורשת לפחות שלושה חזרות ביולוגיות לכל תנאי כדי להבטיח ניתוח היסטולוגי עקבי ואמינות של הנתונים.
- מדרגיות: תואמת לניתוחים המשכיים כגון qPCR, מיקרוסקופיה ו-micro-CT לצורך תיקוף רב-פרמטרי של אינטראקציות בין עצם לגידול.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה ספיגת עצם מושראת מסרטן באמצעות תאי MDA-MB-231 או מצע מותנה (conditioned medium) כדי לשחזר מיקרו-סביבה אוסטאוליטית.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין ממצאים in vitro לרלוונטיות in vivo על ידי שמירה על ארגון רקמתי בתלת-ממד וגיוון תאי של גולגולת רך-עוברית (neonatal calvaria).
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מבהיר האם תרכובות הבדיקה מווסתות את בניית העצם מחדש באמצעות השפעות ישירות על אוסטאובלסטים/אוסטאוקלסטים או באמצעות סיגנלינג המתווך על ידי הסרטן.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לאופטימיזציה של המוליך, ובמיוחד עבור סוכנים מושפעי עצם וסוכנים נגד סרטן בעלי השפעות שלדיות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבחינת השערות על נתיבי Wnt, RANKL או PTHrP באמצעות כימות של בניית/ספיגת עצם בתגובה למודולטורים של הנתיבים.
- סריקה: מספקת פלטים כמותיים ומוכנים לבדיקה לגבי שטח העצם והשלמות המבנית, המתאימים למעבר משלב זיהוי הפגיעות (hit) לשלב פיתוח המוביל (lead).
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה סטטיסטית של עובי ושטח העצם בין תנאים שונים באמצעות תוכנת דימוי והיסטומורפומטריה.
- מחקר תרגומי: מקשר לעבודה פרה-קלינית על ידי מידול אינטראקציות בין גידול לעצם הרלוונטיות לבני אדם במערכת ex vivo עכברית.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה רב-פעמית להערכת תרכובות מגוונות, כולל מולקולות קטנות, תרופות ביולוגיות או מצע גידול מותנה (conditioned media), בפתופיזיולוגיה של העצם.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק תובנה מכניסטית לגבי הבקרה של שחזור העצם (bone remodeling) והמעבר המידעי (crosstalk) בין סרטן לעצם בנאמנות פיזיולוגית גבוהה.
- ערך תפעולי: מציע מערכת ex vivo פשוטה, מהירה ובקוסט נמוך, עם תוצאות שניתן להשיג תוך שבוע אחד.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשכיות הפיתוח (go/no-go) על ידי הפחתת תוצאות חיוביות כוזבות בסריקת תרכובות הפעילות בעצם, באמצעות מידול הרלוונטי למחלה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מועמדים מותאם-סיכון על בסיס השפעות מאומתות על בניית עצם או ספיגת עצם (resorption) בהקשר של תרבית משולבת (co-culture).
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיסקציה של רקמות עכבר, עיבוד היסטולוגי ואנליזה היסטומורפומטרית.
- תלוי במיקרוטום, קסטות להטמעה, פורמלין, EDTA וריאגנטים לצביעה עבור הכנת הרקמה.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים של אוריינטציה וחיתוך כדי להבטיח תוצאות היסטולוגיות וכמותיות עקביות.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש תיקוף של שימור הרקמה והחיוניות התאית.
- מגבלות מעשיות כוללות שבירות של הרקמה במהלך העיבוד והצורך בטיפול זהיר כדי למנוע ארטיפקטים בכימות של פני השטח של העצם.
