שיפוץ עצם מדידה ויצירה משולבת של מיקרוסביבה של עצם הגידול באמצעות Calvaria Co-תרבות והימאנורמוטוריקה
March 14th, 2020
התרבות vivo ex של explants העצם יכול להיות כלי רב ערך לחקר הפיזיולוגיה של העצם ואת הערכה פוטנציאלית של תרופות שיפוץ העצם ומחלות העצם. הפרוטוקול המוצג מתאר את ההכנה והתרבות של calvarias מבודדים מגולגלות העכברים היילוד, כמו גם את יישומיה.
מטרת הליך זה היא להיות מודל vivo לשעבר כדי להעריך את שיפוץ העצם ולשחזר את microenvironment עצם הגידול באמצעות תרבות קלבריה או שיתוף תרבות עם תאים סרטניים. רוב טכניקת calvaria היא מערכת תרבות איברים באמצעות עצמות calvaria מעכברים יילודים כדי להעריך את שיפוץ העצם. אתה יכול לבדוק את הפוטנציאל הטיפולי של מולקולות מגוונות, או אפילו לשחזר את microenvironment גידול העצם כאשר אתה משתמש בתרבויות שיתוף עם תאים סרטניים.
כל זה בהתראה פשוטה וקלה בזמן קצר ועלות נמוכה. מטרת טכניקה זו היא לקבל כלי להערכת התחדשות העצם ב microenvironment עצם סרטן, באמצעות מודל vivo לשעבר של תרבות איברים קלבריאליים העכבר. ראשית, בחר גור עכבר והצב אותו מתחת למכסה המנוע.
אנחנו משתמשים בגולגולתא מגורי עכברים בני חמישה עד שבעה ימים. קח את הראש עם המזרק, לחתוך את העור, ולנקה את אזור הקרקפת מספיק כדי לנתח את הקלבריה. זהה את התפרים של הגולגולת, קשת, קורונדל, ו lambdoids.
לעשות חתך ישר לאורך התפרים lambdoid, על רמת העין. חותכים מכל צד, מתפרים lambdoid לכיוון התפר קורונטל. ב 45 זווית, לעשות חתך נוסף כדי לחבר את הקצה של החתך עשה עם החתך של fontanel הקדמי.
חשוב מאוד להגדיר את תפרי הגולגולת, קשתית, פרונטלית, קורונאלית, lambdoid, כדי להבטיח את הכללת הרקמה הנכונה וניתוח היסטולוגיה. עם מדפים טיפים עדין, להסיר את calvaria, ולשים אותו על כיסוי צלחת פטרי. עם אזמל, לעשות חתך ישר מן fontanel האחורי לאורך התפר sagittal דרך התפר קורונאל.
שני hemicalvarias מתקבלים. הרם כל קלבריה עם המדפים, והצב אותם בצלחת פטרי חדשה עם PBS. לתרבות, מניחים את hemicalvaria בצלחת תרבות רקמות 24 באר, המכיל מיליליטר אחד של מדיה, ודגירה במשך 24 שעות ב 37 מעלות.
אנחנו יכולים גם להשתמש בתרבויות עגליות ראשוניות כדי לשחזר את microenvironment עצם הגידול עבור resorption העצם. כדי לעשות זאת, אנו שיתוף תרבות calvarias עם תאים סרטניים, או עם מדיה מותנה של תאים סרטניים. 24 שעות לאחר מכן, להסיר את המדיה ולהחליף אותו עם מדיה המכילה את הטיפול שאתה רוצה לבדוק.
אם ברצונך להעריך תאים סרטניים ואינטראקציות עצם, או לשחזר את microenvironment עצם הגידול, להעביר את calvaria לצלחת התקשרות הסלולר נמוך, כדי למנוע את ההחזקה של תאים סרטניים לצלחת. טריפסיניזציה של התאים הסרטניים, לספור אותם, ולמקם אותם בזהירות בחלק העליון של hemicalvaria. אתה יכול גם להשתמש במדיה מותנית מתאים סרטניים, ולהשתמש בו כדי להחפיר את hemicalvaria.
דגירה במשך שישה עד שבעה ימים ב 37 מעלות, עם חמישה אחוזים CO2. ביום השלישי, לשנות את התקשורת ולהמשיך דגירה. מספר התאים המשתמשים בתרבות השיתוף תלוי בקו התאי של הסרטן.
אתה צריך, תחילה, כדי למטב את מספר התאים הדרושים כדי לגרום לתגובה באחד. לאחר התרבות, הקלבריה עוברת תהליך של קיבעון, דקלציה ופרפין מוטבע. יתר על כן, הרקמות חתוכו במיקרוטום, מוכתמות, וניתוח היסטומורפי מבוצע.
הכללת הקלבריה יכולה להיות מסובכת. כדי לוודא כי הרקמה מוגנת במהלך ההכללה, אתה יכול לשים את הרקמה בין ספוגים או להשתמש בנייר טישו או נייר סופג אחר לפני לשים אותו בקלטת. לעיבוד רקמות, לעטוף את hemicalvaria בנייר טישו.
לאחר מכן, למקם אותו לתוך קלטת הטבעה, ולתקן במאגר ניטרלי בפורמלין, במשך 24 שעות בארבע מעלות. כדי לתקן את הקלבריה, הנח את הקלטת ב- 10%EDTA למשך 48 שעות בארבע מעלות. לעבד את קלטות הרקמה עם hemicalvaria במעבד רקמות אוטומטי.
בצע מחזור סיבוב יום רגיל, ולאחר מכן, כלול בפרפין. לצורך חתך, לחתוך ארבעה חלקים מיקרוטיים עם microtome, לעלות את החלקים על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית, וכתם עם hematoxylin, אאוסין. ניתוח היסטולוגיה שימש לביצוע ניתוח כמותי של משטח העצם ושטחי שיפוץ העצמות.
התמונות של הקלבריה בשבעת הימים נותחו באמצעות תוכנת ההדמיה. עבור הערכה כמותית, ראשית, הגדר את האזור לניתוח. תסתכל בקטעים על הטלופה שבו ארבעה X כדי לזהות את האוריינטציה ואת התפרים.
הגדר את התפר התותח, וזהה את משטח העצם הארוך בצד אחד, ולאחר מכן את המשטח הקצר בצד השני. תחת ההגדלה 40X, לזהות את התפר הכתר ולהזיז שניים או שלושה שדות אופטיים מן התפר, לאורך פני השטח הארוכים. צלם את התמונה של אזור זה לצורך ניתוח.
אתה יכול להשתמש בתוכנת תמונות כדי לנתח את השלמות המבנית של העצם. ניתוח היסטומורפי כמותי לעובי ולאזור העצם של ההמיקלוואריה יכול להיעשות. ניתוח הקלבריה הנכון תלוי בהטבעה טובה ובכיוון הנכון לתוצאות היסטולוגיות עקביות.
הקפד להשתמש לפחות שלושה קלבריה לכל מצב ניסיוני. כאן, אנו יכולים לראות את מבנה העצם. בכתום, העצם נצפית.
אנחנו יכולים גם לראות את הנוכחות של periosteum, ostocyte, אנדוסטיום, וחלקים אחרים של העצם. במקרה שלנו, אנו משתמשים באינסולין כדי להגדיל את שיפוץ העצם. בהשוואה לשליטה, אנו יכולים לראות עלייה משמעותית באזור העצם.
כאן, אנו יכולים לראות את ההשפעה של קו תא מד"א-MB-231 על קלבריה מודל. אנו יכולים לראות, בהשוואה לשליטה, כי נוכחותם של תאים סרטניים לגרום גורמים osteolytic הממריצים הרס העצם. השתמשנו במודל קלבריה כדי למדוד התחדשות עצם ואינטראקציות סרטן בין עצם התא על ידי תרבויות שיתוף עם תאים סרטניים והיסטולוגיה.
אנו גם מאמתים את הנתונים שלנו לפי PCR כמותי בזמן אמת. למודל האקס ויוו הזה יש יתרונות רבים, כמו הארגון התלת מימדי והמגוון התאי של העצם נשמרים, ותנאים ניסיוניים יכולים להיות נשלטים. חוץ מזה, המודל הוא פשוט, אתה יכול לראות תוצאות בתקופה קצרה של זמן, וזה בעלות נמוכה.
וזה יכול להיות משולב עם טכניקות אחרות, כמו PCR כמותי בזמן אמת, מיקרוסקופיה, מיקרו-CT.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לגידול ex vivo של קלבריה מעכברים שזה עתה נולדו, שמטרתו לחקור את פיזיולוגית העצם ולהעריך את השפעות התרופות על שיפוץ העצם. הטכניקה מאפשרת שחזור של מיקרו-סביבת הגידול-עצם.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- פיזיולוגית עצם
- שיפוץ עצם
- ביולוגיה של סרטן
רקע
- ניתן לגדל אקספלנטים של עצם לחקר תהליכים פיזיולוגיים.
- קלבריה מעכברים ניונטליים משמשים כמודל לחקר עצם.
- גידול משותף עם תאי סרטן יכול לדמות את מיקרו-סביבת הגידול-עצם.
- שיטה זו חסכונית ופשוטה.
מטרת המחקר
- להעריך את שיפוץ העצם במודל ex vivo.
- להעריך את הפוטנציאל הטיפולי של מולקולות שונות.
- לשחזר את מיקרו-סביבת הגידול-עצם.
שיטות בשימוש
- בידוד קלבריה מעכברים שזה עתה נולדו.
- טכניקות גידול ex vivo לאקספלנטים של עצם.
- מערכות גידול משותף עם תאי סרטן.
- הערכת התחדשות העצם והשפעות התרופות.
תוצאות עיקריות
- גידול מוצלח של קלבריה לחקר שיפוץ העצם.
- יכולת לבחון חומרים טיפוליים בסביבה מבוקרת.
- הוכח שחזור של מיקרו-סביבת הגידול-עצם.
- השיטה הוכחה כיעילה וחסכונית.
מסקנות
- הגידול ה-ex vivo של הקלבריה הוא כלי חשוב למחקר עצם.
- היא מאפשרת את המחקר של השפעות התרופות על פיזיולוגית העצם.
- מערכות גידול משותף משפרות את ההבנה של האינטראקציות של סרטן עם העצם.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This ex vivo calvaria model provides a physiologically relevant system for evaluating bone remodeling dynamics and tumor-bone interactions in a controlled, reproducible format. It enables early-stage mechanistic de-risking of therapeutic candidates targeting bone metastasis or osteoporosis by preserving native tissue architecture and cellular diversity. The assay supports predictive confidence in lead identification by quantifying anabolic and catabolic bone responses under defined conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses on bone formation and resorption pathways using insulin or cancer cell co-culture as modulators.
- Operational Value: Enables functional target validation by measuring bone area changes in response to osteolytic or osteoactive agents.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing compounds that stimulate versus inhibit bone remodeling in a disease-relevant system.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative histomorphometric outputs for bone surface and remodeling area after fixation, sectioning, and staining.
- Reproducibility: Requires a minimum of three biological replicates per condition to ensure consistent histological analysis and data reliability.
- Scalability: Compatible with downstream analytics such as qPCR, microscopy, and micro-CT for multi-parametric validation of bone-tumor interactions.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models cancer-induced bone resorption using MDA-MB-231 cells or conditioned medium to recapitulate osteolytic microenvironment.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo relevance by maintaining 3D tissue organization and cellular diversity of neonatal calvaria.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether test compounds modulate bone remodeling via direct effects on osteoblasts/osteoclasts or through cancer-mediated signaling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, particularly for bone-modulating agents and anticancer agents with skeletal effects.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on Wnt, RANKL, or PTHrP pathways by quantifying bone formation/resorption in response to pathway modulators.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs on bone area and structural integrity suitable for hit-to-lead progression.
- Analytics: Enables statistical comparison of bone thickness and area across conditions using imaging software and histomorphometry.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling human-relevant tumor-bone interactions in a murine ex vivo system.
- Enterprise Reuse: Serves as a reusable platform for evaluating diverse compounds, including small molecules, biologics, or conditioned media, in bone pathophysiology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into bone remodeling regulation and cancer-bone crosstalk with high physiological fidelity.
- Operational Value: Offers a low-cost, simple, and rapid ex vivo system with results achievable within one week.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing false positives in bone-active compound screening through disease-relevant modeling.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on validated effects on bone formation or resorption in a co-culture context.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine tissue dissection, histology processing, and histomorphometric analysis.
- Dependent on microtome, embedding cassettes, formalin, EDTA, and staining reagents for tissue preparation.
- Necessitates standardized orientation and sectioning protocols to ensure consistent histological and quantitative results.
- Adaptation to other model systems may require validation of tissue preservation and cellular viability.
- Practical limitations include tissue fragility during processing and the need for careful handling to avoid artifacts in bone surface quantification.
