ניטור הישרדות עצביים באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות האורך
19 בינואר 2019
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לפקח על הישרדות על בסיס תא בודד ולזהות משתנים באופן משמעותי לחזות מוות של תאים.
פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לעקוב אחר הישרדות על בסיס תא יחיד ולזהות משתנים המנבאים באופן משמעותי מוות או הישרדות של תאים. בדיקות ציטוטוקסיות קונבנציונליות מעריכות אוכלוסיות של תאים וחסרות יכולת להפלות תאים בודדים. מיקרוסקופ אורך מאפשר את המשימה של זמן המוות עבור כל תא באוכלוסייה.
טכניקה זו מתאימה היטב להערכת טיפולים חדשים למחלות ניווניות ולתנאים אחרים. שיטה זו הוכיחה לא יסולא בפז לחקר מנגנוני המחלה בתנאים ניווניים, והוא יכול להיות מיושם ביעילות שווה כלפי הפרעות אחרות שבהן מוות תאי הוא עניין. חוקרים עשויים להיאבק בהשגת יעילות transfection נאותה ללא רעילות מופרזת.
תרגול עם צינור רב ערוצי והיכרות עם הפרוטוקול צריך להפחית קושי אלה לאורך זמן. מיקרוסקופיה היא מתודולוגיה חזותית מטבעה. לכן, הטכניקה עשויה להיות מובנת בקלות רבה יותר על ידי צפייה בנוסף לקריאה.
כדי להתחיל, לשלב את הכמות המתאימה של מדיה סרום מופחתת reagent transfection בצינור אחד, ו מדיה סרום מופחת DNA בצינור נפרד. דגירה אותם בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן, לשלב את התוכן של שני צינורות דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
השתמש צינור רב ערוצי שוקת פלסטיק מעקר לשטוף את הנוירונים קליפת המוח פעמיים עם 100 microliters של מדיה בזלית עצבית לכל באר. ולאחסן את המדיה המותנה ומדיות אחרות שנותרו ב37 מעלות צלזיוס. החלף את ה- NBM ב- 100 מיקרוליטרים של פתרון NBKY שהוכן בעבר לבא.
לאחר 20 דקות, pipet 50 microliters של reagent transfection ותערובת DNA dropwise לתוך כל באר. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. יש לשטוף את התאים פעמיים באמצעות פתרון NBKY.
לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים של מדיה מותנה ו-100 מיקרוליטרים של פתרון NBC ל בארות. כדי להתחיל להדמיין את התאים, מניחים את צלחת 96 באר על מיקרוסקופ פלואורסצנטי. השתמש בסמל נאמנות ייחודי לכל לוח כהפניה ליישור עתידי, ושמור תמונה לעיון בעתיד.
לאחר מכן, נווט לאזורי עניין והתאם את קואורדינטות ה- x וה- y שלהם ביחס לסימני הסימן. השתמש בסמל נאמנות ייחודי לכל לוח כהפניה ליישור עתידי, ושמור תמונה לעיון בעתיד. לבסוף, התמקדו בתאים המהונפים המבטאים תווית פלואורסצנטית.
לצלם תמונות מרובות במרווחים במרווחים קבועים בערוצים הפלואורסצנטיים המתאימים. כדי להתחיל בעיבוד תמונה, לחץ פעמיים על סמל פיג'י. לאחר מכן, לחץ וגרור את מאקרו עיבוד המקף התחתון של התמונה אל סרגל פיג'י כדי לפתוח את המאקרו בתוך פיג'י.
התאם שורות 2 עד 7 של מאקרו עיבוד המקף התחתון של התמונה בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, לחץ על תפירה ולאחר מכן רשת / אוסף תפירה. התאימו את הקצויים בתפריטים הנפתחים, הקלקו והסדר, עד להפקת תמונה תפורה במדויק.
התאם משתני סוג רשת וסדר תפר בשורות שמונה ותשע בהתאם לבחירה זו. לאחר מכן, התאימו את קו 10 כדי לציין את מספר התמונות ל באר והגדירו את אפשרות חיסור הרקע בשורה 14 כ- true, במידת הצורך. התאם את קו 15 כדי להגדיר את רדיוס הכדור המתגלגל בהתאם לפרוטוקול הטקסט ולחץ על הפעל.
לבסוף, פתח את ערימות תמונת הפלט וזהה באופן ידני את הנוירונים המתים בהתאם לפרוטוקול הטקסט. רשום את הנתונים בקובץ גיליון אלקטרוני. כדי לבצע ניתוח סטטיסטי, לחץ פעמיים על הסמל להישרדות.
R תסריט. סמן את קו 2 ולחץ על לחצן ההפעלה כדי לטעון את ספריית ההישרדות. לאחר מכן, שנה את הנתיב בשורה חמש כדי לקרוא לגיליון האלקטרוני של הקלט ולחץ על לחצן ההפעלה.
סמן את קווים 8 ו- 9 ולחץ על לחצן ההפעלה כדי לבצע את ניתוח הסיכונים היחסיים של Cox. סמן קווים 12 עד 16 ו- 19 עד 24. לחץ על לחצן הריצה כדי להתוות את הסיכון המצטבר למוות ואת נתוני ההישרדות כעיקול קפלן-מאייר.
במחקר זה, נוירונים קליפת המוח חולדה הונפו בארבעה ימים לאחר ציפוי עם פלסמיד קידוד חלבון פלואורסצנטי M תפוח. 24 שעות לאחר transfection, נוירונים דימוי על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי כל 24 שעות במשך 10 ימים רצופים. לאחר רכישת התמונה, תמונות עובדו ונבדקו ברצף כדי לסמן את מות התא.
זמן המוות של כל תא נקבע על ידי שינויים ב פלואורסצנטיות, מורפולוגיה ופיצול של גוף התא. ניתוח סכנות פרופורציונלי קוקס שבוצע על נתוני ההישרדות של נוירונים מוטנטים הביא יחס סיכון של 2.2. תוצאה זו הצביעה על קצב מוות מהיר יותר בנוירונים המוטנטים בהשוואה לאוכלוסיית סוגי הבר.
הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת ניסיון הליך זה הוא צינור בזהירות. מזעור החשיפה לאוויר והימנעות מבועות הוא קריטי לתפנית מוצלחת. לאחר ההשתנות, ניתן להשתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית אורך כדי לעקוב אחר גורמים שונים שעשויים לתרום למוות של תאים, כולל לוקליזציה של חלבונים, מחזור ורמת ביטוי, בנוסף להישרדות התאים.
בתחום ניוון עצבי, האופי הדינמי של מיקרוסקופיה אורך שפך אור על האם הצבירה של חלבונים הקשורים למחלות מייצג אירוע רעיל או מגן. אף אחד מהריגנסים או המכשירים האלה לא מסוכן.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול לניטור הישרדות תאים ברמת התא הבודד לצורך זיהוי מדדים למוות או להישרדות של תאים. באמצעות מיקרוסקופיה אורךית (longitudinal microscopy), השיטה עוקבת אחר נוירונים קורטיקליים בודדים כדי לזהות שינויים בחיוניות לאורך זמן, ובמיוחד בהקשר של מחלות ניווניות של מערכת העצבים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- מחקר של מחלות ניווניות של מערכת העצבים
רקע
- בדיקות ציטוטוקסיות קונבנציונליות מעריכות אוכלוסיות תאים, אך אינן מאפשרות להבחין בין תאים בודדים.
- מיקרוסקופיה אורךית מאפשרת מעקב אחר הישרדותם ומותם של תאים בודדים.
- שיטה זו מועילה במיוחד לחקר מנגנוני ניוון עצבי.
- חוקרים נתקלים לעיתים קרובות באתגרים הנוגעים ליעילות הטרנספקציה במהלך מחקרי תאים.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול לניטור הישרדות ומות של תאי עצב.
- זיהוי משתנים המשפיעים באופן משמעותי על גורל התא.
- יישום ממצאים אלו עבור טיפולים חדשים פוטנציאליים למחלות נוירודגנרטיביות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש בשיטות תרבית תאים עם נוירונים קורטיקליים.
- טרנספקציה של נוירונים באמצעות פלסמיד פלואורסצנטי כדי לאפשר דימוי של מוות תאי לאורך תקופה של 10 ימים.
- ביצוע שלבי פיפטינג ואינקובציה מדויקים להבטחת טרנספקציה מוצלחת.
- השיטות האנליטיות כללו ניתוח סיכונים פרופורציונלי של Cox ושרטוט עקומות הישרדות של Kaplan-Meier.
תוצאות עיקריות
- המחקר זיהה יחס סיכון (hazard ratio) של 2.2, המעיד על קצב תמותה מהיר יותר של נוירונים מוטנטיים בהשוואה לסוג הפרא (wild type).
- מות התאים נקבע על סמך שינויים בפלואורסצנציה ובמורפולוגיה שנצפו לאורך זמן.
- כמו כן, נאספו תובנות לגבי הדינמיקה של אגרגציה של חלבונים והשלכותיה על מצבים ניורודגנרטיביים.
מסקנות
- פרוטוקול זה מאפשר ניתוח מפורט של מוות תאי, ומספק תובנות לגבי מנגנוני הישרדות של נוירונים.
- לממצאים יש השלכות משמעותיות על פיתוח טיפולים המכוונים למחלות ניווניות של מערכת העצבים.
- באופן כללי, השיטה משפרת את ההבנה של תגובות תאיות בתנאים שונים שבהם מוות תאי הוא קריטי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיקרוסקופיה פלואורסצנטית אורכית מאפשרת רזולוציה של תא בודד להישרדות נוירונלית, ובכך נותנת מענה למגבלה מרכזית של בדיקות ציטוטוקסיות המבוססות על אוכלוסיית תאים במחקר של מחלות נוירודגנרטיביות. באמצעות מעקב אחר תאים בודדים לאורך זמן, השיטה תומכת בהסרת סיכונים מכניסטית של היפותזות טיפוליות ומשפרת את הביטחון החזוי באימות מטרות. יכולת זו משפרת את תהליך מיון הפורטפוליו על ידי הבחנה בין גורמים פתוגניים לבין תגובות הומאוסטטיות באירועים סוב-צלולריים, כגון אגרגציה של חלבונים או מיקום שגוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי קישור אירועים סוב-סלולריים לתוצאות גורל התא באמצעות הסקה סיבתית.
- ערך תפעולי: מספק רזולוציה של תא בודד להבחנה בין גורמים פתוגניים לבין תופעות מקריות באוכלוסיות נוירונליות.
- ערך ניבוי: תומך בהערכת יחס סיכון באמצעות ניתוח סיכונים פרופורציונלי של Cox לצורך כימות של משני סיכון להישרדות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר נתונים של זמן-עד-אירוע עבור כל תא, מה שמאפשר ניתוח הישרדות כמותי מעבר למדידות חיות בנקודת הסיום.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של זרימות עבודה של דימוי לאורך זמן באמצעות סימון נקודות ייחוס ותפירה אוטומטית למעקב הדירות ברב-בארים באופן הדיר.
- מוכנות הבדיקה: מפיק ערימות תמונות מעובדות המתאימות לדירוג מוות ידני או אוטומטי המבוסס על פלואורסצנציה, מורפולוגיה ופרגמנטציה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך תרגומי: מקשר בין הפרעות מולקולריות (למשל, ביטוי של חלבון מוטנטי) לתוצאות הישרדות בתרביות עצביות ראשוניות הרלוונטיות למחלה.
- הסרת סיכונים מנגנונית: מבהיר האם אגרגציה של חלבונים היא רעילה או מגנה על ידי הקשר בין היווצרות פונקטה (puncta) לזמן המוות.
- המשכיות פרה-קלינית: תומך בהערכה ארוכת טווח של מודיפייקטורים מועמדים במודלים של ניוון עצבי לפני תיקוף in vivo.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות של מטרות ועד לאופטימיזציה של מובילים (leads), ובמיוחד עבור תוכניות המתמקדות בניוון עצבי הדורשות קריאות פנוטיפיות דינמיות.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות לגבי השפעות של גנים או חלבונים על הישרדות נוירונלית באמצעות תרביות ראשוניות מסומנות פלואורסצנטית.
- סריקה: מספקת פלטים כמותיים בעלות רזולוציית זמן, המתאימים למודל הישרדות ולניתוח השוואתי של תנאים.
- אנליזה: מפיקה נתוני זמן הישרדות התואמים למודל סיכונים פרופורציונליים של Cox ולהערכת Kaplan-Meier לצורך כימות גודל האפקט.
- מחקר תרגומי: מקשרת פנוטיפים של הישרדות in vitro למנגנוני מחלה בנוירונים קורטיקליים ראשוניים, המהווים מודל תרגומי לניוורו-דגנרציה אנושית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת צינור (pipeline) הדימיון והניתוח בר-שימוש למחקרים אורכיים של גורל תאים במערכות נוירונליות או גליאליות מרובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות על ידי הפחתת העמימות בקשרים המכניסטיים בין אירועים מולקולריים לבין מוות תאי.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות שלבי טרנספקציה, דימוג ועיבוד תמונה סטנדרטיים, כולל יישור סימני ייחוס (fiducial alignment) והסרת רקע.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של "המשך/עצור" (go/no-go) על ידי אספקת הערכות של גודל האפקט (למשל, hazard ratio) במקום תוצאות בינאריות של חיוניות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מטרות מותאם סיכון, המבוסס על כימות של ויסות ההישרדות בהקשרים נוירונליים רלוונטיים לבני אדם.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות עצביות ראשוניות, אופטימיזציה של טרנספקציה ומיקרוסקופיה פלורסצנטית כדי למזער רעילות ולהגביר את גילוי האות.
- תלוי ביעילות טרנספקציה יציבה וביטוי של חלבון פלורסצנטי לצורך מעקב ארוכי טווח אמין של תאים בודדים.
- מחייב מרווחי רכישת תמונות ופרמטרי עיבוד סטנדרטיים (למשל, סדר תפרים, חיסור רקע) כדי להבטיח עקביות של הנתונים בין בארות ופלטות.
- כולל אישור ידני של קביעת מוות תאי בהתבסס על קריטריונים מורפולוגיים ופלורסצנטיים, מה שדורש בדיקות מהימנות בין בוחנים לצורך יכולת הרחבה.
- מוגבל על ידי סיכוני פוטוטוקסיות במהלך דימות תכוף, מה שמחייב אופטימיזציה של עוצמת הלייזר, זמן החשיפה ובחירת אורך הגל.
שאלות נפוצות על ביו-פארמה
Chapters in this video
0:04
Title
1:06
Transfection of Rat Cortical Neurons
2:22
Imaging
3:09
Image Processing and Scoring Cell Death
4:35
Performing Cox Proportional Hazards Analysis and Visualizing Results
5:19
Results: Assessing Neuronal Survival on a Single-cell Basis
6:16
Conclusion
