Name: ניטור הישרדות עצביים באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות האורך (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: למדו לעקוב אחרי הישרדות נוירונים קורטיקליים בודדים באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות לאורך זמן. שיטה זו מאפשרת לזהות גורמים חיזוי למוות תאי ולפתח טיפולים למחלות נוירודגנרטיביות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים סטיב Finkbeiner וחברי המעבדה Finkbeiner על חלוצית מיקרוסקופ רובוטית. אנו מודים גם דן Peisach לבניה הראשונית התוכנה הדרושות עבור עיבוד תמונה, אוטומטית ניתוח הישרדות. עבודה זו מומן על ידי המכון הלאומי עבור הפרעות נוירולוגיות R01 שבץ (NINDS)-NS097542, אוניברסיטת מישיגן חלבון מתקפלות המחלה יוזמה לבין אן ארבור פעיל נגד ALS.

כל העבודה בעלי חוליות אושרה על ידי הוועדה על שימוש ו טיפול חיות ב אוניברסיטת מישיגן (פרוטוקול # PRO00007096). ניסויים מתוכננים בקפידה כדי למזער את מספר החיות הקריב. בהריון הנשי פראי-סוג (WT), אוונס ארוך שאינו הטרנסגניים חולדות (Rattus norvegicus) שוכנות ביחידים צ'יימברס מצויד עם העשרה סביבתית, המטופלים על ידי היחידה עבור רפואה חיות מעבדה (אולם) ב אוניברסיטת מישיגן, ב בהתאם המדריך הנתמכות על-ידי NIH על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה. כל העכברושים הוחזקו בשגרת דיור כמו זמן קצר ככל האפשר לפני המתת חסד, בקנה אחד עם ההמלצות של המנחים על המתת חסד של האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית, אוניברסיטת מישיגן שיטות של המתת חסד על-ידי הנחיות מינים.
1. הכנה גשמי
<ol><li>לנתח נוירונים בקליפת המוח מיום מתחלקים שהגורים עכברוש ותרבות 19 – 20 עכברוש נוירונים בקליפת המוח ב- 0.5 x 106 תאים למיליליטר על צלחות מצופה פולי-D-ליזין עבור 4 ימים במבחנה, כפי שתואר לעיל13,14, 15,16,17,18,19.</li>
	<li>להכין את פלסמיד-DNA של ריבית בהתאם לשלבים המפורטים על ידי בידוד של דנ א פלסמיד נטולת אנדוטוקסין קיט (ראה טבלה של חומרים). לכמת את תוצאות הדנ א באמצעות ספקטרופוטומטרים.</li>
	<li>ביום במבחנה 4 (DIV4), aliquot, לעקר ומסנן דגירה המדיה הבאים ב- 37 ° c: 6 מ ל מופחת סרום מדיה (RSM; למשל., OptiMEM), 25 מ ל עצביים הבזליים מדיה (NBM), 40 מ"ל NBKY (NBM + חומצה kynurenic 1 מ מ + 10 מ מ MgCl2, יש להתאים ל- pH של 7. 4), 10 מ ל NBC (NBM + עצביים 1 x תא תרבות + 1 x תוספת-גלוטמין + 1 x עט דלקת). הערה: אמצעי אחסון המפורטים מספיקים לצלחת 96-ובכן אחד transfecting. עיין בטבלה של חומרים עבור ריאגנטים ספציפיים.</li>
</ol>2. תקנים של החולדה הנוירונים בקליפת המוח
<ol><li>לשנות את סיפקה דוגמה תרביות תאים בגיליון (ראה 1 קובץ משלים) על-ידי התאמת סוג צלחת, צלחת מפה, מספר DNAs, ריכוז ה-DNA, ומספר של וולס (תיבות ירוק). הערה: ה-DNA הכולל סיכום כדי µg 0.2 לכל טוב, ללא קשר אם אחד (למשל., דנ א) או מרובות (לדוגמה, ה-DNA B ו- C) DNA מבנים נוספים כדי מכל קידוח.</li>
	<li>עובד מהגיליון, לשלב את הכמות המתאימה של RSM ו- DNA בצינור אחד. לשלב את הכמות המתאימה של RSM, תרביות תאים ריאגנט (למשל, Lipofectamine) בצינור נפרדים.</li>
	<li>דגירה בטמפרטורת החדר (RT) במשך 5 דקות.</li>
	<li>לשלב תערובות RSM ריאגנט DNA ו תרביות תאים, דגירה-RT כעשרים דקות.</li>
	<li>במהלך שלב הדגירה, להשתמש פיפטה רב-ערוצי, שקתות פלסטיק סטרילית לשטוף תאים x 2 עם µL 100 לכל טוב של NBM. שמורת התקשורת ממוזגים (ס מ) ולאחסן ב 37 º C. על כך ועל ביצוע השלבים, לטפל כדי למזער את כמות הזמן הנוירונים חשופים לאוויר.</li>
	<li>מסיר את המדיה NBM והחלף µL 100 לכל טוב של NBKY.</li>
	<li>לאחר 20 דקות עברו, להוסיף 50 µL של תערובת מגיב/ה-DNA תרביות תאים dropwise כל טוב.</li>
	<li>דגירה תאים עם מתחמי מגיב/ה-DNA של תרביות תאים עבור 20 דקות ב 37 º C.</li>
	<li>לשטוף 2 x עם NBKY והחלף µL 100 ס מ ו- µL 100 של NBC לכל טוב.</li>
	<li>בהצלחה transfected תאים צריך להיות גלוי על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ בתוך 16-24 h של תרביות תאים. למדוד יעילות, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לבדוק תרביות של תאים לאחר דגירה לילה ב 37 º C. הערה: טכניקה זו תוצאות יעילות תרביות תאים הכולל של 5-10%.</li>
</ol>3. הדמיה
<ol><li>מניחים את הצלחת על מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם שלב ממונע, ולהקים להחזרי (למשל, סימן על החלק התחתון של הצלחת) אשר יאפשרו למשתמש ליישר את הצלחת בכל פעם שזה הוא עם תמונה. לשמור תמונה של נאמנות זה לעיון.</li>
	<li>נווט אל שדה עניין ורשום הקואורדינטות x-y יחסית אפוטרופסות.</li>
	<li>מתמקדים transfected תאים המבטאים תווית פלורסנט.</li>
	<li>לקחת תמונות פלורסנט הערוץ המתאים או ערוצים (למשל, חלבון פלואורסצנטי חלבון פלואורסצנטי אדום [RFP], ירוק [GFP], 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole [דאפי]), באופן ידני או באופן אוטומטי. על ידי לקיחת מספר תמונות במרווחי זמן שווים באופן קבוע, מצרף של הבאר יכול להיות התאספו במהלך עיבוד תמונה (ראה שלב 4). הערה: המרווח תלויה במספר גורמים, כולל הגדלה, את המערכת האופטית של המיקרוסקופ, ואת גודל גלאי. באופן כללי, המרווח אופטי בין התמונות יהיה בין 90 עד 95 אחוז מגודלו של כל תמונה בנפרד, כדי לאפשר מידה קטן של התמונה חפיפה וכוללים יישור.</li>
	<li>חזור על תהליך זה לעיתים קרובות ככל הנדרש, ושילוב כדי להחזרי המקורי בכל פעם. לצורך ניתוח הישרדות, הדמיה מתקיים כל 6 – 24 h, בהתאם לסוג התא ואת מטרת הניסוי.</li>
</ol>4. עיבוד תמונה
הערה: בעקבות רכישת התמונה, סדרה של צעדים עיבוד נדרשים לפני ניתוח תמונות. אלה כוללים, אך אינם מוגבלים, תפרים, סידור בערימה ואת הרקע חיסור (איור 1). מטרת השלבים היא לייצר של אוסף תמונות, או סדרת הזמן, שבו תאים הם בבירור ניכר מהרקע שלהם וקלים למעקב על נקודות זמן מרובות. מאקרו פיג'י ייעודי (Image_Processing.ijm, ראו 2 קובץ משלים), מבצעת תפירה בסיסי, בערימה, ועל רקע חיסור. הסבר על כל שלב ואת הפרמטרים שיש לקחת בחשבון בעת ביצוע עיבוד תמונה מסופק במקטע דיון.
<ol><li>להתאים את הנתונים הגולמיים או מדריך קלט כדי להתאים את העיצוב באיור 2.</li>
	<li>אם נקודות זמן אינם רציפים (קרי, T1, T2, T3), לשנות תיקיות אלה כך שיהיו. שלב זה הוא קריטי כדי להבטיח כי המאקרו Image_Processing אינה מוחצת במהלך סידור בערימה.</li>
	<li>לחץ פעמיים על הסמל כדי לפתוח את התוכנית, ולאחר מכן לחץ וגרור את המאקרו Image_Processing הבר פיג'י פיג'י. פעולה זו תפתח את המאקרו בתוך פיג'י.</li>
	<li>להתאים שורות 2-7 של המאקרו Image_Processing כדי לציין קלט הספריה המכילה תמונות, את ספריית הפלט הרצוי עבור תמונות התפר ומוערם, מספר timepoints הדמיה, מספר ערוצים פלורסנט ותבנית צלחת.</li>
	<li>לקבוע את הסדר שבו נרכשו התמונות. כדי לבדוק את זה, לתפור ידנית מצרף תמונות בפיג'י על ידי תמרונים כדי תוספים הנפתחת | תפרים | רשת/אוסף סיכות. התאם את ההגדרות בתוך התפריטים הנפתחת סוג ואת הסדר עד תמונה תפור במדויק מופק.</li>
	<li>התאם את המשתנים GRID_TYPE ו- STITCH_ORDER שורות 8 ו-9 של המאקרו Image_Processing כדי להתאים בחירות אלה.</li>
	<li>ציין את מספר תמונות לכל טוב על-ידי התאמת קו 10 במאקרו Image_Processing . הערה: עבור 2 x 2 מצרף תמונות, הקו הזה יקרא DIM = 2.</li>
	<li>אם נדרש רקע חיסור, התאמת קו 14 במאקרו Image_Processing bgsub ב = true.</li>
	<li>הגדר את רדיוס הכדור מתגלגל על-ידי התאמת קו 15 במאקרו Image_Processing . הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, הגדר את הרדיוס לפחות בקוטר של הקידמה הגדולה ביותר בתמונה.</li>
	<li>לחץ על הפעל כדי להפעיל את המאקרו Image_Processing . מרגע שהתחלנו, Image_Processing יתקדמו באופן אוטומטי באמצעות תפרים בערימה, רקע חיסור.</li>
</ol>5. הניקוד מוות תאי
הערה: עיין בסעיף הדיון לקבלת מידע נוסף על הניקוד מוות של תאים ונתונים הצנזורה.
<ol><li>אתר את אוספי תמונות המופק באמצעות Image_Processing script. פתח את אלה בפיג'י.</li>
	<li>לתייג כל תא בנפרד עם מספר לצפות בקבצים יש להשתמש בתוכנת עריכה התומכת בפורמט של הצבע כלי בתוך פיג'י. הקשה על t אחרי כל נקודה יוסיף את מזהה תא למנהל (אזור-של-ריבית) של רועי. הערה: ניתן לאבחן את מזהי בלחיצה על תוויות , הצג את כל תיבות הסימון במנהל ROI.</li>
	<li>
ההתקדמות timepoints כל אוסף תמונות, שיא timepoint, כאשר כל תא מת או צריך להיות צנזורה בקובץ ה- Survival_spreadsheet.csv (ראה קובץ משלים 3).
	<ol>
<li>כל תא תופסת שורה בודדת בגיליון האלקטרוני, היכן מזהה ייחודי (ID) עבור כל תא מורכב המתאים טוב שלה ואת מספר רועי בתוך הבאר. tp_death הוא נקודת הזמן האחרון שתא נצפית בחיים, בעוד time_death מייצג את הזמן הממשי של מוות תוך שעות. עבור כל תא, קלט נתונים אלה. זה חיוני כדי לשמור על מבנה זה לצורך ניתוח מאוחר יותר באמצעות הישרדות . R (ראה 4 קובץ משלים). הערה: הקריטריונים לקביעת מוות תאי מכריעים והם עשויים להשתנות בהתאם לסוג התא. שלושה קריטריונים עיקריים משמשים הזיהוי של נוירונים מתים11,20 (איור 3): איבוד עוצמת קרינה פלואורסצנטית (למשל, תא עצב 1-69 h), עיגול של הגוף תאים (למשל, תא עצב 2 ב 188 h), האובדן של neurite שלמות או blebbing (למשל, תא עצב 2 ב 188 h).</li>
	</ol>
</li>
	<li>לתעד את מצב הצנזור של התא בעמודה האחרונה. הערה: כאן, בשל הדרך המיוחדת לצנזר את מטופלת על ידי R, תאים מצונזרים שסומנו על-ידי 0, בעוד לא מצונזר תאים מסומנים ב- 1. שים לב כי כל התאים שחיים האחרון נקודת זמן צונזר, לכן מסומן כ- 0.</li>
</ol>6. ביצוע קוקס פרופורציונלי ובטיחותיים ניתוח ותוצאות להמחיש
<ol><li>במידת הצורך, הורד סטודיו R ב- https://cran.r-project.org/mirrors.html.</li>
	<li>לפתוח סטודיו R ולחץ פעמיים על הסמל של הישרדות . R סקריפט.</li>
	<li>מקם את הסמן על קו 2 של הישרדות . R , ולחץ על הלחצן הפעל בחלון הראשי של סטודיו R כדי לטעון את ספריית הישרדות.</li>
	<li>שינוי קו 5 של הישרדות . R סקריפט כדי להתאים את המיקום של קובץ ה- Survival_spreadsheet.csv. לחץ על הפעל כדי לטעון את נתוני הישרדות כמו dataframe.</li>
	<li>להאיר את שורות 8 ו-9, לחץ על לחצן הפעל בחלון המסוף סטודיו R על מנת לבצע ניתוח סיכונים ביחס קוקס. תוצאות וסטטיסטיקות פלט מופיעים בחלון המסוף של סטודיו R.</li>
	<li>הדגש שורות 12-16 של הישרדות . R וללחוץ על הכפתור הפעל כדי לייצר סיכון מצטבר של מוות מגרש, אשר תופיע בכרטיסיה ' חלקות ' בסטודיו R. ניתן לשמור את הקובץ על ידי לחיצה על הלחצן ' ייצוא ' שמעל העלילה.</li>
	<li>אם זה רצוי להתוות את הנתונים הישרדות כמו עיקול קפלן-מאייר, הדגש שורות 19-24 של הישרדות . R וללחוץ על הכפתור הפעל .</li>
</ol>

<ol><li>Lockshin, R. A., Zakeri, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell death in health and disease.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11, 1214-1224 (2007).</li>
<li>Kepp, O., Galluzzi, L., Lipinski, M., Yuan, J., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+assays+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cell death assays for drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10, 221-237 (2011).</li>
<li>Lemasters, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+permeability+transition+in+cell+death%3A+a+common+mechanism+in+necrosis%2C+apoptosis+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial permeability transition in cell death: a common mechanism in necrosis, apoptosis and autophagy.</a> Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics. , 177-196 (1998).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Chien, K. R., Abrams, J., Serroni, A., Martin, J. T., Farber, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+phospholipid+degradation+and+associated+membrane+dysfunction+in+irreversible%2C+ischemic+liver+cell+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Accelerated phospholipid degradation and associated membrane dysfunction in irreversible, ischemic liver cell injury.</a> Journal of Biological Chemistry. 253, 4809-4817 (1978).</li>
<li>Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+exposure+of+phosphatidylserine+in+pathological+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 62, 971-988 (2005).</li>
<li>Mitchell, D. B., Santone, K. S., Acosta, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cytotoxicity+in+cultured+cells+by+enzyme+leakage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Culture+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cytotoxicity in cultured cells by enzyme leakage.</a> Journal of Tissue Culture Methods. 6, 113-116 (1980).</li>
<li>Moran, J. H., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+beta-NADH-linked+fluorescence+assay+for+lactate+dehydrogenase+in+cellular+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">A rapid beta-NADH-linked fluorescence assay for lactate dehydrogenase in cellular death.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 36, 41-44 (1996).</li>
<li>Mossman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival%3A+Application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li>
<li>Guerzoni, L. P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Modulation+of+TrkB+Receptor+Signaling+upon+Sequential+Delivery+of+Curcumin-DHA+Loaded+Carriers+Towards+Promoting+Neuronal+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">In Vitro Modulation of TrkB Receptor Signaling upon Sequential Delivery of Curcumin-DHA Loaded Carriers Towards Promoting Neuronal Survival.</a> Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).</li>
<li>Arrasate, M., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+microscope+system+for+determining+factors+that+predict+neuronal+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102, 3840-3845 (2005).</li>
<li>Christensen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+survival+analysis+using+Cox%E2%80%99s+regression+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Multivariate survival analysis using Cox’s regression model.</a> Hepatology. 7, 1346-1358 (1987).</li>
<li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+induction+enhances+TDP43+turnover+and+survival+in+neuronal+ALS+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models.</a> Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).</li>
<li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+toxicity+in+neuronal+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+by+hUPF1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).</li>
<li>Malik, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrin+3-dependent+neurotoxicity+is+modified+by+nucleic+acid+binding+and+nucleocytoplasmic+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Matrin 3-dependent neurotoxicity is modified by nucleic acid binding and nucleocytoplasmic localization.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Archbold, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP43+nuclear+export+and+neurodegeneration+in+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">TDP43 nuclear export and neurodegeneration in models of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia.</a> Scientific Reports. 8, 4606(2018).</li>
<li>Green, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAN+translation+at+C9orf72-associated+repeat+expansions+is+selectively+enhanced+by+the+integrated+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response.</a> Nature Communications. 8, 2005(2017).</li>
<li>Park, S. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+essential+Sis1+chaperone+reduces+TDP-43+effects+on+toxicity+and+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the essential Sis1 chaperone reduces TDP-43 effects on toxicity and proteolysis.</a> PLOS Genetics. 13, e1006805(2017).</li>
<li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Proline%2FArginine+Dipeptide+from+Hexanucleotide+Repeat+Expanded+C9ORF72+Inhibits+the+Proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">The Proline/Arginine Dipeptide from Hexanucleotide Repeat Expanded C9ORF72 Inhibits the Proteasome.</a> eNeuro. 4, (2017).</li>
<li>Angelov, B., Angelova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+clustering+of+the+neurotrophin+receptor+TrkB+revealed+by+super-resolution+STED+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Nanoscale clustering of the neurotrophin receptor TrkB revealed by super-resolution STED microscopy.</a> Nanoscale. 9 (28), 9797-9804 (2017).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן מוצגת מתודולוגיה לעקוב ישירות אחר הישרדות העצבית על בסיס תא בודד. בניגוד מבחני מסורתי על מות תאים הנמצאים מוגבל זמן בדידים נקודות ועל אוכלוסיות שלמות של תאים, שיטה זו מאפשרת להערכה מתמשכת של מגוון גורמים כגון מורפולוגיה הסלולר, ביטוי חלבונים או לוקליזציה, ו ניתן לקבוע כיצד כל גורם משפיע על הישרדות הסלולר באופן פרוספקטיבי.
מתודולוגיה זו יכולה להיות שונה כדי להתאים מגוון רחב של צרכים ניסיוני. התדירות והמשך של הדמיה ניתן להתאים בקלות, כל חלבון עניין וניתן transfected שיתוף עם הסמן פלורסנט על ...

מוות של תאים חריגים מהווה גורם המניע במחלות רבות, כולל סרטן, הקשורים ניוון מוחיים של קו1. מבחני רגישות ועמיד עבור מוות תאים חיוניים האפיון של הפרעות אלה, כמו גם הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות תוך הרחבה או צמצום הישרדות הסלולר. כיום יש עשרות טכניקות למדידת מוות של תאים, באופן ישיר או באמצעות פונדקאית סמני2. לדוגמה, מוות של תאים יכולים להידרש באופן חזותי עם העזרה של המשתמשות באופן סלקטיבי כתם תאים מתים או חיים3צבעים חיוני, או על-ידי ניטור את המראה של פוספוליפידים מסוימים קרום פלזמה4,5,6 . מדידות של רכיבים תאיים או הסלולר מטבוליטים שוחרר לתוך כלי התקשורת שנפרעו הסלולר יכול גם לשמש כאל שליחים לתא המוות7,8. לחלופין, הכדאיות הסלולר ניתן לקרב את ערכיהן על-ידי הערכת פעילות חילוף החומרים9,10. למרות ששיטות אלה מספקים אמצעי מהיר הערכת את הישרדות cell, הם לא בלי אזהרות. כל טכניקה מתבונן התרבות כאוכלוסייה אחת, טיוח זה בלתי. אפשרי להבחין בין תאים בודדים שלהם המחירים ייחודי של הישרדות. יתר על כן, מבחני מבוסס-אוכלוסייה כזו אינם יכולים למדוד גורמים שעשויים להיות חשוב עבור מוות של תאים, כולל מורפולוגיה הסלולר, ביטוי חלבונים או לוקליזציה. במקרים רבים, מבחני אלה הן מוגבל לנקודות זמן בדידים, אינם מאפשרים את התצפית רציף של תאים לאורך זמן.
לעומת זאת, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות האורך היא מתודולוגיה גמיש במיוחד ישירות ובאופן רצוף מפקח על הסיכון למוות תא בודד בסיס11. בקצרה, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות האורך מאפשר אלפי תאים בודדים כדי לאתר במרווחי זמן קבועים לתקופות ממושכות של זמן, ומאפשר האישושים מדויק של מוות של תאים, את הגורמים לשפר או לדכא את מות תאים. בבסיסו, השיטה כוללת של תרביות תאים ארעי או התמרה חושית של תאים עם וקטורים קידוד חלבונים פלורסנט. להחזרי ייחודי אז נוסדה, המיקום של כל תא transfected ביחס ציון זה מאפשר למשתמש תמונה ולעקוב אחר תאים בודדים במשך שעות, ימים או שבועות. כאשר תמונות אלה מוצגים ברצף, מוות של תאים מסומן על ידי שינויים אופייניים פלורסצנטיות, מורפולוגיה, פיצול בגוף התא, המאפשר את ההקצאה של שעת המוות עבור כל תא. הקצב מחושב של מוות, נקבעים על-ידי הפונקציה הזארד, שניתן לאחר מכן באופן כמותי בהשוואה בין תנאי או הקשורים בחר מאפיינים הסלולר באמצעות univariate או רב משתנית קוקס מפגעים פרופורציונלי ניתוח12. יחד, גישות אלה מאפשרים את האפליה מדויק ואובייקטיבי של שערי מוות תאי בקרב אוכלוסיות הסלולר, וזיהוי של משתנים באופן משמעותי לחזות מוות תאי ו/או הישרדות (איור 1).
אמנם ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לעקוב אחר הישרדות בכל סוג התא הפוסט-mitotic במגוון של תבניות ציפוי, פרוטוקול זה יתאר תנאים transfecting, הדמיה החולדה הנוירונים קורטיקלית תרבותי בצלחת 96-ובכן.

<table><tbody><tr><td>Neurobasal בינוני</td><td>GIBCO</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>CompactPrep פלסמיד ערכת מקסי</td><td>Qiagen</td><td>12863</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידראט</td><td>סיגמא</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>הידרט חומצה קינורן</td><td>TCI</td><td>H0303</td><td></td></tr><tr><td>פולי D-ליזין</td><td>Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>GIBCO</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>ליפופקטמין 2000</td><td>Invitrogen</td><td>52887</td><td></td></tr><tr><td>תוסף B27</td><td>תרמו פישר</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>GIBCO</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>96 צלחות באר</td><td>TPP</td><td>0876</td><td></td></tr></tbody></table>

ניטור הישרדות עצביים באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות האורך

Monitoring Neuronal Survival via Longitudinal Fluorescence Microscopy

מבחני סטנדרט cytotoxicity, אשר דורשים את האוסף של lysates או תאים קבוע בנקודות זמן מרובים, מוגבלת הרגישות ויכולת להעריך גורמים המשפיעים על גורל עצביים. מבחני אלה דורשים התצפית של אוכלוסיות נפרדות של תאים בנקודות זמן בדידים. כתוצאה מכך, תאים בודדים לא יכול להיות במעקב פרוספקטיבי לאורך זמן, מגבילה מאוד את היכולת להבחין בין אם אירועים subcellular, כגון היווצרות puncta או חלבון mislocalization, הם פתוגניים הנהגים של המחלה, תגובות homeostatic, . או תופעות רק צירוף מקרים... מיקרוסקופ האורך תא בודד מתגבר על מגבלות אלו, ומאפשר החוקר לקבוע הבדלים הישרדות בין אוכלוסיות וצייר סיבתי קשרי גומלין עם רגישות משופרת. מדריך וידאו זה מתאר עבודה נציג לניסויים מדידה תא בודד ההישרדות של החולדה הנוירונים קורטיקלית הראשית המבטאת סמן חלבון פלואורסצנטי. הצופה למד כיצד להשיג יעילות גבוהה transfections, לאסוף, לעבד תמונות המאפשר איתור פוטנציאליים של תאים בודדים, ולהשוות את ההישרדות היחסי של אוכלוסיות עצביים באמצעות ניתוח סיכונים ביחס קוקס.

DIV4 החולדה הנוירונים בקליפת המוח באמצעות ההליך תרביות תאים המתואר כאן, היו transfected עם פלסמיד קידוד מאפל את חלבון פלואורסצנטי. החל 24 שעות שלאחר תרביות תאים, התאים היו עם תמונה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ כל 24 שעות למשך 10 ימים רצופים. הדימויים הנובעת היו מאורגנים כמצוין איור 2, ואז תפור, מוערמים, הבקיע עבור מוות תאי (איור 1). איור 3 מראה קורס זמן עבור 3 נוירונים נציג, שניים אשר למות במה...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לפקח על הישרדות על בסיס תא בודד ולזהות משתנים באופן משמעותי לחזות מוות של תאים.

Standard cytotoxicity assays, which require the collection of lysates or fixed cells at multiple time points, have limited sensitivity and capacity to ...

פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לעקוב אחר הישרדות על בסיס תא יחיד ולזהות משתנים המנבאים באופן משמעותי מוות או הישרדות של תאים. בדיקות ציטוטוקסיות קונבנציונליות מעריכות אוכלוסיות של תאים וחסרות יכולת להפלות תאים בודדים. מיקרוסקופ אורך מאפשר את המשימה של זמן המוות עבור כל תא באוכלוסייה.טכניקה זו מתאימה היטב להערכת טיפולים חדשים למחלות ניווניות ולתנאים אחרים. שיטה זו הוכיחה לא יסולא בפז לחקר מנגנוני המחלה בתנאים ניווניים, והוא יכול להיות מיושם ביעילות שווה כלפי הפרעות אחרות שבהן מוות תאי הוא עניין. חוקרים עשויים להיאבק בהשגת יעילות transfection נאותה ללא רעילות מופרזת.תרגול עם צינור רב ערוצי והיכרות עם הפרוטוקול צריך להפחית קושי אלה לאורך זמן. מיקרוסקופיה היא מתודולוגיה חזותית מטבעה. לכן, הטכניקה עשויה להיות מובנת בקלות רבה יותר על ידי צפייה בנוסף לקריאה.כדי להתחיל, לשלב את הכמות המתאימה של מדיה סרום מופחתת reagent transfection בצינור אחד, ו מדיה סרום מופחת DNA בצינור נפרד. דגירה אותם בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן, לשלב את התוכן של שני צינורות דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.השתמש צינור רב ערוצי שוקת פלסטיק מעקר לשטוף את הנוירונים קליפת המוח פעמיים עם 100 microliters של מדיה בזלית עצבית לכל באר. ולאחסן את המדיה המותנה ומדיות אחרות שנותרו ב37 מעלות צלזיוס. החלף את ה- NBM ב- 100 מיקרוליטרים של פתרון NBKY שהוכן בעבר לבא.לאחר 20 דקות, pipet 50 microliters של reagent transfection ותערובת DNA dropwise לתוך כל באר. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. יש לשטוף את התאים פעמיים באמצעות פתרון NBKY.לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים של מדיה מותנה ו-100 מיקרוליטרים של פתרון NBC ל בארות. כדי להתחיל להדמיין את התאים, מניחים את צלחת 96 באר על מיקרוסקופ פלואורסצנטי. השתמש בסמל נאמנות ייחודי לכל לוח כהפניה ליישור עתידי, ושמור תמונה לעיון בעתיד.לאחר מכן, נווט לאזורי עניין והתאם את קואורדינטות ה- x וה- y שלהם ביחס לסימני הסימן. השתמש בסמל נאמנות ייחודי לכל לוח כהפניה ליישור עתידי, ושמור תמונה לעיון בעתיד. לבסוף, התמקדו בתאים המהונפים המבטאים תווית פלואורסצנטית.לצלם תמונות מרובות במרווחים במרווחים קבועים בערוצים הפלואורסצנטיים המתאימים. כדי להתחיל בעיבוד תמונה, לחץ פעמיים על סמל פיג'י. לאחר מכן, לחץ וגרור את מאקרו עיבוד המקף התחתון של התמונה אל סרגל פיג'י כדי לפתוח את המאקרו בתוך פיג'י.התאם שורות 2 עד 7 של מאקרו עיבוד המקף התחתון של התמונה בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, לחץ על תפירה ולאחר מכן רשת / אוסף תפירה. התאימו את הקצויים בתפריטים הנפתחים, הקלקו והסדר, עד להפקת תמונה תפורה במדויק.התאם משתני סוג רשת וסדר תפר בשורות שמונה ותשע בהתאם לבחירה זו. לאחר מכן, התאימו את קו 10 כדי לציין את מספר התמונות ל באר והגדירו את אפשרות חיסור הרקע בשורה 14 כ- true, במידת הצורך. התאם את קו 15 כדי להגדיר את רדיוס הכדור המתגלגל בהתאם לפרוטוקול הטקסט ולחץ על הפעל.לבסוף, פתח את ערימות תמונת הפלט וזהה באופן ידני את הנוירונים המתים בהתאם לפרוטוקול הטקסט. רשום את הנתונים בקובץ גיליון אלקטרוני. כדי לבצע ניתוח סטטיסטי, לחץ פעמיים על הסמל להישרדות.R תסריט. סמן את קו 2 ולחץ על לחצן ההפעלה כדי לטעון את ספריית ההישרדות. לאחר מכן, שנה את הנתיב בשורה חמש כדי לקרוא לגיליון האלקטרוני של הקלט ולחץ על לחצן ההפעלה.סמן את קווים 8 ו- 9 ולחץ על לחצן ההפעלה כדי לבצע את ניתוח הסיכונים היחסיים של Cox. סמן קווים 12 עד 16 ו- 19 עד 24. לחץ על לחצן הריצה כדי להתוות את הסיכון המצטבר למוות ואת נתוני ההישרדות כעיקול קפלן-מאייר.במחקר זה, נוירונים קליפת המוח חולדה הונפו בארבעה ימים לאחר ציפוי עם פלסמיד קידוד חלבון פלואורסצנטי M תפוח. 24 שעות לאחר transfection, נוירונים דימוי על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי כל 24 שעות במשך 10 ימים רצופים. לאחר רכישת התמונה, תמונות עובדו ונבדקו ברצף כדי לסמן את מות התא.זמן המוות של כל תא נקבע על ידי שינויים ב פלואורסצנטיות, מורפולוגיה ופיצול של גוף התא. ניתוח סכנות פרופורציונלי קוקס שבוצע על נתוני ההישרדות של נוירונים מוטנטים הביא יחס סיכון של 2.2. תוצאה זו הצביעה על קצב מוות מהיר יותר בנוירונים המוטנטים בהשוואה לאוכלוסיית סוגי הבר.הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת ניסיון הליך זה הוא צינור בזהירות. מזעור החשיפה לאוויר והימנעות מבועות הוא קריטי לתפנית מוצלחת. לאחר ההשתנות, ניתן להשתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית אורך כדי לעקוב אחר גורמים שונים שעשויים לתרום למוות של תאים, כולל לוקליזציה של חלבונים, מחזור ורמת ביטוי, בנוסף להישרדות התאים.בתחום ניוון עצבי, האופי הדינמי של מיקרוסקופיה אורך שפך אור על האם הצבירה של חלבונים הקשורים למחלות מייצג אירוע רעיל או מגן. אף אחד מהריגנסים או המכשירים האלה לא מסוכן.

monitoring-neuronal-survival-via-longitudinal-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מתארים פרוטוקול המאפשר הדמיה של המיטוכונדריה לחיות הנוירונים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי פני משכי זמן ארוכים. הדמיה על תקופות ממושכות נעשה באמצעות הביטוי lentivirus בתיווך של חלבון פלואורסצנטי ממוקד mitochondrially ושימוש זול הבמה העליון חממה כי תוכנן ונבנה במעבדה שלנו.

Neuromodulation ותחבורה מיטוכונדריאלי: הדמיה חיה נוירונים בהיפוקמפוס פני משכי זמן ארוכים

Live-תא הדמיה של אפופטוזיס caspase-3 בתיווך ב-N19 oligodendrocyte תרבויות הנציח התא...

ביקע ניטור caspase-3 פעילות אפופטוזיס של תאים Oligodendroglial הונצח באמצעות Live-תא הדמיה Cleaveable Fluorogenic-צבע מצעים בעקבות שלילת קוטביות אשלגן-Induced ממברנה

דו"ח זה מתאר את השימוש הדמיה תא חי וטכניקות photobleach לקבוע את הבעת פני, מסלולי תחבורה קינטיקה סחר exogenously GFP-מתוייגים הביע pH רגיש, חלבונים על הממברנה של נוירונים.

דיפוזיה Exocytosis לרוחב של חלבונים בממברנה של נוירונים בתרבית הוערכה באמצעות שחזור פלואורסצנציה Fluorescence מסופקים Photobleaching

מקור: Krishnamurthy, K. et al. מדידה פלואורסצנטית בזמן אמת של פונקציות סינפטיות במודלים של טרשת אמיוטרופית צידית. J. Vis. Exp. (2021)סרטון זה מדגים הדמיית סידן בזמן אמת כדי לנטר פעילות סינפטית בתאי עצב מוטנטיים של ALS המבטאים חיישן ביולוגי של סידן מקודד גנטית. הוא מתאר את השלבים להכנת הנוירונים להדמיה, גירוי דינמיקת סידן והקלטת פלואורסצנטיות כדי למדוד שינויים בזמן אמת ברמות הסידן התוך-תאי, המשקפות פעילות סינפטית עצבית.

הדמיה פלואורסצנטית של דינמיקת סידן סינפטית במודל חוץ גופי של טרשת אמיוטרופית לרוחב

עיצוב מחדש של Ca2+ תוך תאי בהזדקנות עשוי לתרום לאקסיטוטוקסיות ולנזק לנוירונים, תהליכים המתווכים על ידי עומס יתר של Ca2+. מטרתנו הייתה לחקור שיפוץ Ca2+ במוח המזדקן באמצעות הדמיה פלואורסצנטית וביו-לומינסנציה של Ca2+ ציטוזולי ומיטוכונדריאלי בתרביות ארוכות טווח של נוירונים בהיפוקמפוס של חולדות, מודל של הזדקנות עצבית.

הקרינה ופליטת אור הדמיה של Ca subcellular<sup&gt; 2 +</sup&gt; בבני נוירונים בהיפוקמפוס

פרוטוקול חזקים כדי לפקח אוכלוסיות עצבית על ידי זמן לשגות וידאו-מיקרוסקופיה ואחריו-מבוססות תוכנה שלאחר עיבוד מתואר. שיטה זו מייצגת כלי רב עוצמה לזיהוי אירועים הביולוגי בקרב אוכלוסיה הנבחר במהלך הניסויים הדמיה בשידור חי.

חיים הדמיה ואחריו תא בודד מעקב צג Cell Biology, ההתקדמות שושלת היוחסין של אוכלוסיות עצבית מרובים

הציגו כאן היא שיטת צינור רולר ששונה culturing, לסירוגין דימות ברזולוציה של המוח מכרסמים פרוסות בשבועות רבים עם שינוי מיקום מדויק על photoetched coverslips. הכדאיות עצביים, מורפולוגיה פרוסה מתוחזקים היטב. יישומים של השיטה במלואו סגור באמצעות וירוסים עבור ביטוי מסוים סוג התא הינם מסופקים.

רולר ששונתה שיטת צינור לדימות לסירוגין במדויק לשפות אחרות וחוזר על עצמו במהלך תרבות לטווח ארוך של פרוסות המוח בכל מערכת סגורה

הדמיה לחיות תאים מספק שפע של מידע על תאים בודדים או באוכלוסיות שלמות כי הוא בלתי ניתן להשגה על-ידי תא קבוע הדמיה לבד. כאן, מתוארים פרוטוקולי הדמיה לחיות תאים כדי להעריך את החלטות גורל התא לאחר הטיפול עם פקליטקסל סמים אנטי mitotic.

לטווח ארוך לחיות תאים הדמיה כדי להעריך את גורל בתגובה פקליטקסל

תאי גזע/מחולל קדמון מציגים דינמיקה של ביטויים שונים של רכיבי איתות מדרגה שמובילים לתוצאות שונות של אירועי הסלולר. ביטוי דינמי כזה יכול להתגלות על ידי ניטור בזמן אמת, לא על ידי ניתוח סטטי, באמצעות מערכת הדמיה ביולומינציה רגישה מאוד המאפשרת ויזואליזציה של שינויים מהירים בביטויי גנים.

בזמן אמת ביולומינסנציה הדמיה של מערכת איתות דינמיקה במהלך מורנין נוירוגנזה

שתי שיטות קשורות מתוארות כדי לדמיין אירועים תת-תאיים הנדרשים לשידור סינפטי. פרוטוקולים אלה מאפשרים ניטור בזמן אמת של הדינמיקה של זרם סידן presynaptic והיתוך קרום שלפוחית סינפטי באמצעות הדמיה של תאים חיים של נוירונים בתרבית הפריה חוץ גופית .

מדידה פלואורסצנטית בזמן אמת של פונקציות סינפטיות במודלים של טרשת אמיוטרופית לרוחב

למדו לעקוב אחרי הישרדות נוירונים קורטיקליים בודדים באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות לאורך זמן. שיטה זו מאפשרת לזהות גורמים חיזוי למוות תאי ולפתח טיפולים למחלות נוירודגנרטיביות.

ניטור הישרדות עצביים באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות האורך

גלה סרטונים נוספים