Name: זיהוי של סובסטרטים קינאז CK2 הרומן תוך שימוש בגישה הביוכימי רב-תכליתי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: למד לזהות סובסטרטים אנדוגניים של קינאז CK2 מתוך ליזטים תאיים או רקמות באמצעות תיופוספורילציה ואלקילציה. שיטה זו מאפשרת עשירה ספציפית וזיהוי חלבוני מטרה לחקר תפקידי CK2 בתא.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק שיפור המחקר אוניברסלי קהיליה מחלקת פנסילבניה הבריאות T.I.S.

הערה: ודא כי החומרים הדרושים הם זמינים הוכנו כראוי (ראה טבלה של חומרים).
1. הכנה
<ol><li>מכנית lyse דגימת הרקמות (1-2 מ ג של רקמות µL 100 פירוק מאגר, טבלה 1) או תרבותי תאים (10 ס מ זה 80-90% confluent ב µL 350 מאגר פירוק), לוחית עם המטרה היא לאסוף סכום של 900 µL מדגם לניסוי. שימו לב כי נפח זה עודף קל של מה נדרש בשביל הניסוי המתואר להלן.</li>
	<li>ספין למטה הדוגמאות על ידי צנטריפוגה ב 17,500 x g במשך 3 דקות ב 4 º C. בגמר, העברה µL 270 של תגובת שיקוע כל אחד שלושה צינורות microcentrifuge החדש של 1.7 mL. יהיו כ 90 µL שנותרו. הסר µL 40 כדי לשמש של "בקרת קלט" ומקום צינור חדש. במקום כל דוגמאות על קרח.</li>
</ol>2. קינאז assay: thiophosphorylation, אלקילציה
<ol><li>תווית שלושה צינורות המכיל 270 µL כדלקמן: "rxn קינאז", "GTPγS בלבד", ו "PNBM (p-nitrobezyl מסילייט) בלבד". הכינו את התגובות קינאז.<ol>
<li>אל הרכבת התחתית "קינאז rxn", להוסיף µL 2.7 (שקול ל- 1,350 U) של CK2 ולאחר מכן להוסיף µL 2.7 של 2.5 מ מ GTPγS.</li>
		<li>אל הרכבת התחתית "GTPγS בלבד", להוסיף µL 2.7 של 2.5 מ מ GTPγS, ולאחר מכן להוסיף µL 2.7 פירוק המאגר.</li>
		<li>כדי הרכבת התחתית "PNBM בלבד", להוסיף µL 5.4 פירוק המאגר. קפיצי לכל הצינורות כדי לערבב ולאחר מכן מקם באופן מיידי על קרח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>דגירה כל שלושה צינורות עבור 1 דקות באמבט מים של 30 מעלות צלזיוס. בעקבות דגירה, להוסיף µL 13.5 של 12 מ"ג/מ"ל PNBM כל שלושה צינורות. ' היפוך ' כדי לערבב דגימות. דגירה הדגימות בטמפרטורת החדר מאובטח.</li>
	<li>לאחר תחילת הדגירה בשלב 2.2, להכין את העמודות desalting ברגע ככל האפשר התהליך נמשך כ- 45 דקות.</li>
</ol>3. הכנת desalting עמודות
<ol><li>בתחילה הכן עמודות (3 לניסוי הזה למשל) על ידי היפוך כל עמודה מספר פעמים כדי מחדש להשעות G-25 ספדקס שרף במאגר של אחסון. לאפשר שרף להתיישב על ידי הצמדת כל עמודה עמדה קלאמפ ולתת לזה לשבת ללא הפרעה במשך כ 5 דקות.</li>
	<li>בעקבות שיקוע של שרף ספדקס G-25, להסיר את הפקקים הן העליון והתחתון של העמודה כדי לאפשר מאגר אחסון ניקוז על ידי כוח המשיכה, יש לו צינור הממוקמת מתחת הפתח התחתון כדי לאסוף את הזרימה דרך עבור ביטול.</li>
	<li>לאחר אחסון מאגר תיגמר, להוסיף כ- 2.7 mL פירוק המאגר כדי equilibrate את העמודות. לאסוף את הזרימה דרך וזורקים. חזור על 3 פעמים. בעקבות equilibration הסופית, העמודות מוכנים עבור שלב 4.1.</li>
</ol>4. הסרת PNBM
<ol><li>לאחר דגירה 1 h (שלב 2.2) והכנת עמודה (שלב 3) הושלמו, להחיל את הדגימות לעמודות. תווית כל עמודה כדלקמן: "קינאז rxn", "GTPγS בלבד" ו- "PNBM בלבד". לטעון את כל כל דגימה על גבי שלה העמודות בהתאמה. אוספים וזורקים את הזרימה דרך.</li>
	<li>רחץ דוגמאות על-ידי הוספת µL 420 פירוק מאגר כל עמודה. לאפשר פירוק המאגר לסנן באמצעות המדור ולאסוף את הזרימה דרך עבור ביטול. בעקבות צעד זה לשטוף, למקם את צינורות במיקום עבור אוסף של דוגמאות.</li>
	<li>Elute דוגמאות על-ידי הוספת µL 500 פירוק מאגר כל עמודה. לאסוף את הזרימה דרך המכיל עכשיו thiophosphorylated ותערובות CK2 alkylated.</li>
</ol>5. Immunoprecipitation: חלק א'
<ol><li>להכין דגימות immunoprecipitation על ידי הראשון µL 80 הסרת עבור דוגמה "• תנאי קלט שליטה" מכל אחת elutions בהתאמה ("קינאז rxn", "GTPγS בלבד" ו- "PNBM רק") שנאספו בשלב 4.3. בעקבות הסרת µL 80 מ כל דגימה, יהיו כ 420 µL הנותרים עבור דגימה.<ol>
<li>לפצל כל מדגם 2 צינורות המכיל 200 µL. תווית כל שפופרת בהתאמה: "קינאז rxn אנטי-thiophosphate אסתר", "rxn קינאז IgG", "GTPγS אנטי-thiophosphate אסתר", "GTPγS אג", "PNBM אנטי-thiophosphate אסתר" ו- 'PNBM אג'.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הוסף µg 2.8 של נוגדן anti-thiophosphate אסתר לכל אחד הצינורות התווית על-ידי אסתר anti-thiophosphate ואת µg 2.8 של נוגדן שליטה isotype לכל אחד הצינורות התווית על-ידי IgG. במקום צינורות על מסובב ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.</li>
	<li>להתחיל הכנה של חלבון A/G חרוז במהלך 15 דקות האחרונות של הדגירה 2 h בשלב 5.2.</li>
</ol>6. חלבון A/G agarose חרוז הכנה
<ol><li>בקצרה מערבולת הצינור אחסון כדי להבטיח חרוזים הם לגמרי מחדש על תנאי. לחתוך את סוף P200 עצה פיפטה בעזרת סכין גילוח נקי כדי להגדיל את מד גודל. Pipet 100 µL של slurry חרוז לכל immunoprecipitation לתוך צינור microcentrifuge 1.7 מ ל. עבור דוגמה זו, סכום כולל של 6 צינורות נחוצים.</li>
	<li>Centrifuge הצינורות ב x 17,500 g עבור 1 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע וזורקים. מחדש להשעות את החרוזים ב 200 µL של פירוק מאגר, בקצרה מערבולת. חזור על הספין ולשטוף שלבים 3 פעמים.</li>
	<li>בעקבות בכביסה הסופי, במקום את החרוזים על הקרח עד הדגירה בשלב 5.2 תושלם.</li>
</ol>7. Immunoprecipitation: חלק ב'
<ol><li>לאחר 2 h הדגירה מהשלב 5.2, ספין למטה הדגימות ב x 17,500 g עבור מינימום 3-4 מעלות צלזיוס. בעקבות צנטריפוגה להוסיף 200 µL מהדגימה כל הצינורות עם החרוזים שטף. במקום הצינורות על מסובב ב 4 ° C עבור 1 h.</li>
	<li>בעקבות הדגירה 1 h, centrifuge הצינורות ב x 17,500 g עבור 1 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס. הבא להסיר כל מדגם µL 40 של תגובת שיקוע ולשמור ככל "פקד דלדול" (סה כ 6 צינורות). הסר את השארית של תגובת שיקוע, להשליך. . שמור על עצמך שלא להפריע את החרוזים.</li>
	<li>לשטוף את הדוגמאות על-ידי הוספת µL 200 של פירוק מאגר, vortexing בקצרה. צנטריפוגה ואז ב x 17,500 g עבור 1 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס. הסר את תגובת שיקוע וזורקים. חזור על לשטוף את ולסובב שלבים 3 פעמים. . שמור על עצמך שלא להפריע את החרוזים במהלך שלבים אלה.</li>
	<li>לאחר השלמת השלבים לשטוף, להוסיף 50 µL 2 x מדגם מאגר כל מדגם המכילה חרוזים. כל דוגמאות אחרות, הוסיפו µL 8 של 6 x מאגר מדגם: "בקרת קלט", "בקרות קלט • תנאי" ופקדים "מחסור".</li>
	<li>ברגע מאגר נוסף הצינורות, pipet למעלה ולמטה כדי לערבב, מחממים כל דוגמאות ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות לפני שתמשיך עם עמודים מרחביות.</li>
</ol>8. ניתוח/אימות של תוצאות
<ol><li>אמת thiophosphorylation תלויי-CK2 מוצלחת, אלקילציה.<ol>
<li>כדי לקבוע את היעילות של thiophosphorylation בתיווך CK2 בשלב 2.2, מבצעים מרחביות-דף סופג המערבי על-ידי הפעלת µL 15-20 של "• תנאי קלט הפקדים" אסף בשלב 5.1 על ג'ל לזיהוי 12.5%.</li>
		<li>בדיקה ממברנות עם נוגדנים הבאים: אנטי-thiophosphate אסתר, anti-CK2α, ו- anti-GAPDH (או פקד הטעינה מתאים אחר). אם שלב זה היה מוצלח, אות אסתר נגד משופרת-thiophosphate צריך להיות לכאורה במסלול "rxn קינאז" לעומת אחרים שני המסלולים (איור 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>דמיינו דיאלקטריים בשם מועשר של CK2 ולקבוע זהות החלבון.<ol>
<li>כדי להעריך אם המדרגות immunoprecipitation היו מוצלחות, הפעל 25-30 µL של הדגימות eluted של החרוזים בשלב 7.4 על ג'ל לזיהוי נפרד 12.5%. ודא כי כל הציוד הוא נקי, לבשו כפפות בכל עת במהלך שלב זה כדי למזער את הזיהום.</li>
		<li>מכתים את הג'ל עם Coomassie כחול להמחיש מהחלבונים מועשר בשלבים שונים של פרוטוקול נסיוני (איור 3). משתמש חדש razorblades, בזהירות להקות ייחודי בלו מציגים בנתיב "קינאז rxn אנטי-thiophosphate אסתר IP", וציין משקולות מולקולרית המשוער שלהם.</li>
		<li>להגיש את הלהקות האלה לזיהוי חלבון באמצעות ספקטרומטר מסה טנדם/כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS/MS) (איור 4). אם נוגדנים נגד החלבונים מזוהה זמינים, לאשר את התוצאות של ספקטרומטר מסה מאת מרחביות-דף immunoblotting של קלט, דלה, שברים IP שנאספו במהלך הקורס של הפרוטוקול (איור 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Litchfield, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+CK2%3A+structure%2C+regulation+and+role+in+cellular+decisions+of+life+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Protein kinase CK2: structure, regulation and role in cellular decisions of life and death.</a> Biochemical Journal. 369 (Pt 1), 1-15 (2003).</li>
<li>Ahmed, K., Gerber, D. A., Cochet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joining+the+cell+survival+squad%3A+an+emerging+role+for+protein+kinase+CK2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2).</a> Trends in Cell Biology. 12 (5), 226-230 (2002).</li>
<li>Meggio, F., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-thousand-and-one+substrates+of+protein+kinase+CK2%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">One-thousand-and-one substrates of protein kinase CK2.</a> The FASEB Journal. 17 (3), 349-368 (2003).</li>
<li>Niefind, K., Guerra, B., Ermakowa, I., Issinger, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+human+protein+kinase+CK2%3A+insights+into+basic+properties+of+the+CK2+holoenzyme%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of human protein kinase CK2: insights into basic properties of the CK2 holoenzyme.</a> The EMBO Journal. 20 (19), 5320-5331 (2001).</li>
<li>Sarno, S., Ghisellini, P., Pinna, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+activation+mechanism+of+protein+kinase+CK2.+The+N-terminal+segment+is+essential+for+constitutive+activity+of+the+catalytic+subunit+but+not+of+the+holoenzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Unique activation mechanism of protein kinase CK2. The N-terminal segment is essential for constitutive activity of the catalytic subunit but not of the holoenzyme.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22509-22514 (2002).</li>
<li>Niefind, K., Putter, M., Guerra, B., Issinger, O. G., Schomburg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP+plus+water+mimic+ATP+in+the+active+site+of+protein+kinase+CK2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">GTP plus water mimic ATP in the active site of protein kinase CK2.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 6 (12), 1100-1103 (1999).</li>
<li>Lou, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alpha+catalytic+subunit+of+protein+kinase+CK2+is+required+for+mouse+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">The alpha catalytic subunit of protein kinase CK2 is required for mouse embryonic development.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (1), 131-139 (2008).</li>
<li>Buchou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+regulatory+beta+subunit+of+protein+kinase+CK2+in+mice+leads+to+a+cell-autonomous+defect+and+early+embryonic+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Disruption of the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice leads to a cell-autonomous defect and early embryonic lethality.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (3), 908-915 (2003).</li>
<li>Chua, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CK2+in+Cancer%3A+Cellular+and+Biochemical+Mechanisms+and+Potential+Therapeutic+Target%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">CK2 in Cancer: Cellular and Biochemical Mechanisms and Potential Therapeutic Target.</a> Pharmaceuticals (Basel). 10 (1), (2017).</li>
<li>Tawfic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+CK2+signal+in+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Protein kinase CK2 signal in neoplasia.</a> Histology and Histopathology. 16 (2), 573-582 (2001).</li>
<li>Hanif, I. M., Hanif, I. M., Shazib, M. A., Ahmad, K. A., Pervaiz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Casein+Kinase+II%3A+an+attractive+target+for+anti-cancer+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Casein Kinase II: an attractive target for anti-cancer drug design.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (10), 1602-1605 (2010).</li>
<li>Siddiqui-Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX-4945%2C+an+orally+bioavailable+selective+inhibitor+of+protein+kinase+CK2%2C+inhibits+prosurvival+and+angiogenic+signaling+and+exhibits+antitumor+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">CX-4945, an orally bioavailable selective inhibitor of protein kinase CK2, inhibits prosurvival and angiogenic signaling and exhibits antitumor efficacy.</a> Cancer Research. 70 (24), 10288-10298 (2010).</li>
<li>Chon, H. J., Bae, K. J., Lee, Y., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+casein+kinase+2+inhibitor%2C+CX-4945%2C+as+an+anti-cancer+drug+in+treatment+of+human+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The casein kinase 2 inhibitor, CX-4945, as an anti-cancer drug in treatment of human hematological malignancies.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 70(2015).</li>
<li>Perea, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CIGB-300%2C+a+novel+proapoptotic+peptide+that+impairs+the+CK2+phosphorylation+and+exhibits+anticancer+properties+both+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">CIGB-300, a novel proapoptotic peptide that impairs the CK2 phosphorylation and exhibits anticancer properties both in vitro and in vivo.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. (1-2), 163-167 (2008).</li>
<li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+expression+of+nucleolin+phosphorylation-deficient+mutant+confers+dominant-negative+effect+on+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Induced expression of nucleolin phosphorylation-deficient mutant confers dominant-negative effect on cell proliferation.</a> PLoS One. 9 (10), e109858(2014).</li>
<li>Shi, Y., Brown, E. D., Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+recombinant+human+casein+kinase+II+and+recombinant+heat+shock+protein+90+in+Escherichia+coli+and+characterization+of+their+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expression of recombinant human casein kinase II and recombinant heat shock protein 90 in Escherichia coli and characterization of their interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2767-2771 (1994).</li>
<li>Mollapour, M., Tsutsumi, S., Kim, Y. S., Trepel, J., Neckers, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Casein+kinase+2+phosphorylation+of+Hsp90+threonine+22+modulates+chaperone+function+and+drug+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Casein kinase 2 phosphorylation of Hsp90 threonine 22 modulates chaperone function and drug sensitivity.</a> Oncotarget. 2 (5), 407-417 (2011).</li>
<li>McMillan, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+kinase+CK2+substrate+Jabba+modulates+lipid+metabolism+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The protein kinase CK2 substrate Jabba modulates lipid metabolism during Drosophila oogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (8), 2990-3002 (2018).</li>
<li>Turowec, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+CK2+is+a+constitutively+active+enzyme+that+promotes+cell+survival%3A+strategies+to+identify+CK2+substrates+and+manipulate+its+activity+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Protein kinase CK2 is a constitutively active enzyme that promotes cell survival: strategies to identify CK2 substrates and manipulate its activity in mammalian cells.</a> Methods in Enzymology. , 471-493 (2010).</li>
<li>Rusin, S. F., Adamo, M. E., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Candidate+Casein+Kinase+2+Substrates+in+Mitosis+by+Quantitative+Phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biologyl%22%5BJournal%5D)">Identification of Candidate Casein Kinase 2 Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biologyl. 5, 97(2017).</li>
<li>Bian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+screening+of+CK2+kinase+substrates+by+an+integrated+phosphoproteomics+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Global screening of CK2 kinase substrates by an integrated phosphoproteomics workflow.</a> Scientific Reports. 3, 3460(2013).</li>
<li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+a+phosphoproteome+readily+altered+by+the+protein+kinase+CK2+inhibitor+quinalizarin+in+HEK-293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of a phosphoproteome readily altered by the protein kinase CK2 inhibitor quinalizarin in HEK-293T cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1854 (6), 609-623 (2015).</li>
<li>Franchin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluation+of+protein+kinase+CK2+pleiotropy%3A+new+insights+provided+by+a+phosphoproteomics+analysis+of+CK2+knockout+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Re-evaluation of protein kinase CK2 pleiotropy: new insights provided by a phosphoproteomics analysis of CK2 knockout cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (11), 2011-2026 (2018).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן, אנו מתארים שיטה הביוכימי פשוט יחסית לזיהוי סובסטרטים של קינאז CK2 מתוך מדגם ביולוגיות מורכבות. השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה מבוססים על מאפייני אנזימטי יוצא דופן CK2 וכוללים CK2 תלוית thiophosphorylation של חלבונים ספציפיים המצע באמצעות GTPוγS ו immunoprecipitation הבאים וזיהוי שלהם. עם התוצאות האלה, הראו את השירות ואת צדדיות של גישה זו כפי שאנחנו עכשיו יישמו אסטרטגיה זו תאים אנושיים גליובלסטומה והן דרוזופילה השחלות18.
מספר מחקרים שפורסמו בעבר שי...

חלבונים kinases הם רכיבי מפתח של האות התמרה חושית cascades. זרחון של חלבונים המצע על ידי אנזימים אלה מעורר תגובות ביולוגיות להסדיר אירועים קריטיים שליטה חלוקת התא, חילוף החומרים, בידול, בין היתר. CK2 הוא קינאז ביטוי ubiquitously, acidophilic סרין/טראונין זה חוק של שמרים לבני אדם, זה ממלא תפקידים חשובים רבים תהליכים תאיים ועד תקנה תעתיק מחזור התא התקדמות אפופטוזיס1 ,2,3. האנזים הוא heterotetramer המורכב שני α קטליטי (או α') subunits וβ רגולטוריות שני subunits4. בנוסף להיותו מאוד pleiotropic, CK2 מוצגים שני יוצא דופן מאפיינים אחרים זה לסבך את הניתוח שלה, כלומר פעילות מכוננת5 ו- ירידה לפרטים מצע משותף כפול6. המאפיין האחרון הזה מעניק CK2 עם היכולת להשתמש GTP, כמו גם ATP עבור זרחון של חלבונים המצע.
מחיקת גנטי subunits קטליטי או תקניות של CK2 בעכברים גורמת lethality עובריים המציין כי זה משחק תפקיד מכריע במהלך פיתוח ו-7,organogenesis8. CK2 הוא overexpressed גם כמה סוגים של סרטן ומייצגת ובכך מבטיח מטרה טיפולית9,10,11. אכן, ספציפית מעכבי פעילות קינאז CK2 את היעד הם כעת תחת חקירה זו מטרה12,13,14. בעוד עיכוב של CK2 היא אפשרות מעשית, בהתחשב באופי pleiotropic שלה, חלופה אולי גישה יותר הגיוני יהיה היעד קריטית סובסטרטים CK2 העומדים בבסיס את התקדמות סרטן מסוימים. לכן, מקיף זיהוי ואפיון של חלבונים המצע CK2 יהיה של יתרון משמעותי עבור שחקרתי את function(s) ספציפיים של קינאז בתוך סוג הרקמה או גידול מסוים.
כאן, אנו מתארים שיטה ביוכימית רב-תכליתי לזיהוי CK2 סובסטרטים מתוך מדגם ביולוגיים מורכבים כגון תאים או רקמות lysate. פרוטוקול זה מנצל יחודיות כפול מצע משותף של CK2 על-ידי שימוש אנלוגי GTP GTPγS (5'-[γ-thio]triphosphate) guanosine שלא kinases אנדוגני אחרים יכולים להשתמש. דבר זה מאפשר ביעילות את קינאז "לסמן" שלה מצעים בתוך את הדוגמית הזו. עבור הבאים בידוד וזיהוי.

<table><tbody><tr><td>12 מ"ג/מ"ל PNBM</td><td>Abcam</td><td>ab138910</td><td>40.5 ומיקרו; L</td></tr><tr><td>2.5 מ"מ GTP&gamma; S</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8634-1MG</td><td>5.4 ומיקרו; L</td></tr><tr><td>אנטי-CK2 ואלפא; (E-7) נוגדן חד שבטי לעכבר</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-373894</td><td>1:1000 לנוגדנים</td></tr><tr><td>חד שבטיים של עכבר אנטי-GAPDH (6C5) סנטה</td><td>קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-32233</td><td>1:1000 לנוגדנים רב-שבטיים של ארנב אנטי-נוקלולין</td></tr><tr><td></td><td>Abcam</td><td>ab22758</td><td>1:1000 לכתמים מערביים</td></tr><tr><td>אנטי-תיופוספט אסטר [51-8] נוגדן</td> <td>חד שבטי ארנבAbcam</td><td>ab92570</td><td>משתנה (ריכוז סופי 2.8 ומיקרו; g עבור כל דגימה)</td></tr> <tr><td>צנטריפוגה מוגדרת מראש ל-4&ordm; C</td><td>ThermoScientific</td><td>Sorvall Legend Micro 21R Cat# 75-772-436&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete מיני מעכב פרוטאז ללא EDTA</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Lysis Buffer</td><td>ראה מתכון למטה ראה</td><td>מתכון למטה 30</td><td>מ"ל</td></tr><tr><td>נוגדן IgG ארנב רגיל (בקרת איזוטיפ)</td> <td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>2729S&nbsp;</td><td>משתנה (ריכוז סופי 2.8 ומיקרו; g לכל דגימה)</td></tr> <tr><td>PD MiniTrap Column</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9180-10</td><td>3 עמודות</td></tr><tr><td>חלבון A/G בתוספת חרוזי אגרוז</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>SC-2003</td><td>600 ומיקרו; L</td></tr><tr><td>הולואנזים אנושי רקומביננטי CK2</td> ניו <td>אינגלנד Biolabs</td><td>P6010S</td><td>2.7 ומיקרו; L</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Labnet: מיני Labroller</td><td>מיני Labroller מק"ט# H5500</td><td></td></tr><tr><td>T98G תאי גליובלסטומה אנושיים</td><td>ATCC</td><td>CRL-1690</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים מוגדר מראש ל-30&ordm; סדרת</td> האמבטיה C <td>Shel Lab</td><td>H20 דגם # SWB15</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי של סובסטרטים קינאז ck2 הרומן תוך שימוש בגישה הביוכימי רב-תכליתי

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

המחקר של קינאז-המצע יחסים חיונית כדי להשיג הבנה מלאה של הפונקציות של אנזימים אלה ומטרות במורד הזרם שלהם במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים. CK2 הוא קינאז סרין אבולוציונית שנשמרת/תראונין עם הרשימה המתארכת של מאות סובסטרטים מעורבים תהליכים תאיים מרובים. בשל תכונותיו pleiotropic, זיהוי ואפיון ערכה מקיפה של סובסטרטים CK2 כבר מאתגר במיוחד, נשאר משוכה במחקר של אנזים חשוב זה. כדי לטפל באתגר זה, אנו פיתחו אסטרטגיה ניסיוני רב תכליתי המאפשר את העשרה יישוב וזיהוי של בשם דיאלקטריים CK2. פרוטוקול זה מנצל יחודיות ייחודי מצע משותף כפול של CK2 ומאפשר thiophosphorylation ספציפיים של סובסטרטים שלו בתא או רקמות lysate. חלבונים אלו המצע לאחר מכן alkylated, immunoprecipitated, ו המזוהה באמצעות ספקטרומטר מסה טנדם/כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS/MS). השתמשנו בעבר גישה זו בהצלחה לזהות CK2 סובסטרטים מן השחלות דרוזופילה ולהרחיב כאן אנחנו היישום של פרוטוקול זה לתאים אנושיים גליובלסטומה, הממחישות את יכולת ההתאמה של שיטה זו לחקור התפקיד הביולוגי של קינאז דגם אורגניזמים שונים, מערכות ניסויות.

תרשים כללי של ההליך ניסיוני מסופק באיור1. הבסיס כבסיס של הטכניקה היא היכולת יוצאת דופן של CK2 להשתמש GTP להעברת קבוצה phosphoryl. תוספת של holoenzyme CK2 אקסוגני יחד עם GTP אנלוגי, GTPγS, אל תא lysate גורמת thiophosphorylation של סובסטרטים CK2 אנדוגני. הטיפול הבאים של lysate עם החומר מגיב p- nitrobenzyl מסילייט (PNBM) יוצר moiety אסתר thiophosphate על חלבונים אלה סובסטרט מסוים כי אז ניתן immunoprecipitated באמצעות נוגדן anti-thiophosphate אסתר בסופו ...

המטרה של פרוטוקול זה היא תווית להעשיר, לזהות סובסטרטים של קינאז CK2 מתוך מדגם ביולוגיים מורכבים כגון תא lysate או homogenate הרקמה. שיטה זו ממנפת את ההיבטים הייחודיים של הביולוגיה CK2 למטרה זו.

זיהוי של סובסטרטים קינאז CK2 הרומן תוך שימוש בגישה הביוכימי רב-תכליתי

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

פרוטוקול זה מאפשר תיוג ספציפי והעשרה וזיהוי של מצעי CK2 אנדוגניים מדגימה ביולוגית מורכבת כגון ליסס תא או רקמה. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל סוג תא או רקמה. ובכך להקל, המחקר של CK2 בהקשרים ביולוגיים שונים.מדגים את ההליך יהיה ג'ון Chojnowski, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, באופן מכני lyse מדגם הרקמה או תאים מתורבתים כמתואר בפרוטוקול הטקסט כדי לאסוף סך של 900 microliters של מדגם. צנטריפוגה ב 17, 500 פעמים כבידה בארבע מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות.לאחר מכן, להעביר 270 microliters של supernatant לכל אחד משלושה צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.7 מיליליטר חדש. הסר 40 מיקרוליטרים של העל-טבעי הנותרים שישמשו כבקרת קלט, והעבר אותו לצינור חדש. מניחים את כל הדגימות על קרח.ראשית, סמן כל אחד משלושת צינורות הדגימה כפי שמוצג כאן. לצינור התגובה Kinase, להוסיף 2.7 microliters של CK2 ו 2.7 microliters של 2.5 מילימולאר GTPgammaS. מצליפים בצינור כדי לערבב, ומיד מניחים אותו על קרח.לצינור GTPgammaS בלבד, הוסיפו 2.7 מיקרוליטרים של GTPgammaS 2.5 מילימולרים ו-2.7 מיקרוליטרים של מאגר ליזה. תצליף בצינור הזה כדי לערבב, ומיד תן לו קרח. לצינור PNBM בלבד להוסיף 5.4 microliters של מאגר ליזה.מצליפים בצינור כדי לערבב, ומיד מניחים אותו על קרח. דגירה כל שלושת הצינורות באמבט מים ב 30 מעלות צלזיוס לדקה אחת. לאחר מכן, להוסיף 13.5 microliters של PNBM ב 12 מיליגרם למיליליטר לכל צינור.להפוך את הצינורות כדי לערבב את הדגימות, ולהדגור את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. בזמן שהדגימות דגירה, סמן כל אחת מהעמודות כך שהדגימה תיטען, כפי שמוצג כאן. הכן את העמודות על-ידי היפוך כל עמודה מספר פעמים כדי להוסיף שימוש חוזר לשרף Sephadex G-25 במאגר האחסון.צרף כל עמודה לעמוד מהדק, ותן לו לשבת באין מפריע במשך כחמש דקות כדי לאפשר את שהרשת להתיישב. לאחר מכן, מניחים צינור מתחת לפתיחה התחתונה של כל עמודה. הסר את הכובעים הן מהחלק העליון והן מהחלק התחתון של כל עמודה, כדי לאפשר למאגר האחסון להתנקז לצינורות בכוח הכבידה.לאחר חיץ האחסון מתרוקן, להוסיף כ 2.7 מיליליטר של מאגר ליזה לכל עמודה כדי לצייד אותם, הקפד לאסוף ולזרוק את הזרימה דרך. חזור על תהליך זה של הוספת מאגר Lysis ומבטל את הזרימה דרך, שלוש פעמים. כדי להתחיל, טען כל דגימה בעמודה המתאימה לה.לאסוף ולזרוק את הזרימה דרך. הוסף 420 מיקרוליטרים של מאגר ליזה לכל עמודה כדי לשטוף את הדגימות. תן למאגר Lysis לסנן דרך העמודה, ולאסוף ולמחוק את הזרימה דרך.לאחר מכן, מניחים צינורות למיקום מתחת לכל עמודה לאיסוף לדוגמה. הוסף 500 מיקרוליטרים של מאגר Lysis לכל עמודה כדי לחמק מהדגימות. לאסוף את הזרימה דרך, אשר מכיל כעת אוכלוסייה מועשרת של מצעים CK2 thiophosphorylated ו alkylated בתגובת קינאז.התגובה GTPgammaS בלבד יכיל מצעים thiophosphorylated ו alkylated על ידי כל CK2 אנדוגני נוכח. תגובת PNMB בלבד תכיל חלבונים אלקילואטים ברקע. הסר 80 מיקרוליטרים מכל אלוטיון כדגימה לבקרת קלט אלוטיון.לאחר מכן, לפצל כל מדגם לשני צינורות שכל אחד מכיל 200 microliters. סמן כל אחד מהצינורות כאנטי-תיופוספט אסתר או אימונוגלובולין G, כפי שמוצג כאן. הוסף 2.8 מיקרוגרם של נוגדן אסתר אנטי-תיופוספט לכל אחד מצינורות אסתר אנטי-תיופוספט.הוסף 2.8 מיקרוגרם של נוגדן בקרת Isotype לכל אחד מצינורות IGG. ואז למקם את הצינורות על מסובב בארבע מעלות צלזיוס במשך שעתיים. במהלך 15 הדקות האחרונות של הדגירה לדוגמה, השתמש בסכין גילוח נקי כדי לחתוך את הקצה של קצה פיפטה P200 כדי להגדיל את גודל המד.מיד לפני השימוש, בקצרה מערבולת צינור האחסון המכיל את חרוזים agarose. באמצעות קצה פיפטה לחתוך, להעביר 100 microliters של תרחיף חרוזים לכל immunoprecipitation לצינור microcentrifuge חדש 1.7 מיליליטר. חשוב למערבולת את חרוזים לפני כל העברה כדי למנוע חרוזים להתיישב.צנטריפוגה הצינורות ב 17, 500 פעמים כוח הכבידה בארבע מעלות צלזיוס לדקה אחת. הסר והשליך את העל-טבעי. תוסיפו מחדש את חרוזים על ידי הוספת 200 מיקרוליטרים של מאגר ליזה ומערבולת לזמן קצר כדי לערבב.חזור על תהליך זה של צנטריפוגה ושטיפת חרוזים שלוש פעמים. לאחר הכביסה הסופית, מניחים את חרוזים על קרח עד מוכן להמשיך. כאשר הדגימות סיימו דגירה, צנטריפוגה אותם ב 17, 500 פעמים כבידה בארבע מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות.לאחר מכן, להעביר 200 microliters של כל מדגם לצינורות המכילים את חרוזים שטף. מניחים את הצינורות על מסובב בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן, צנטריפוגה הצינורות ב 17, 500 פעמים כבידה בארבע מעלות צלזיוס לדקה אחת.הסר 40 מיקרוליטרים מכל על-טבעי כדי לחסוך כבקרת דלדול. הסר והשליך את שאר העל-טבעי, נזהר שלא להפריע לקדושים. לשטוף את הדגימות על ידי הוספת 200 microliters של מאגר ליזה לכל מערבולת בקצרה.צנטריפוגה ב 17, 500 פעמים כבידה בארבע מעלות צלזיוס לדקה אחת, השלכת העל טבעי. חזור על תהליך שטיפה וצנטריפוגה זה שלוש פעמים דואג לא להפריע חרוזים. לאחר מכן, להוסיף 50 microliters של מאגר מדגם 2X לכל מדגם המכיל חרוזים.עבור כל הדוגמאות האחרות, הכוללות את בקרת הקלט, פקדי קלט האלוטיון ופקדי הדלדול, הוסף 8 מיקרוליטרים של מאגר מדגם 6X. פיפטה כל צינור למעלה ולמטה לערבב למעט צינורות המכילים חרוזים, לחמם את כל הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות לפני שתמשיך עם SDS-PAGE. כדי להעריך אם האימונופרציפציה הצליחה, הפעל 25 עד 30 מיקרוליטרים של כל דגימה שחמקה מעולםים בג'ל פוליאקרילמיד נפרד של 12.5%.הכתם כל ג'ל בכחול קומאסי כדי לדמיין חלבונים מועשרים מהשלבים השונים של פרוטוקול הניסוי. באמצעות סכיני גילוח חדשים ונקיים, יש למלמל בזהירות את כל הרצועות הייחודיות הקיימות בתגובת הקינאז נגד תיופוספט אסתר IP ליין, תוך שים לב למשקולות המולקולריות המשוערות שלהם. יש להשתמש בסכין גילוח חדש עבור כל רצועה ייחודית.הבסיס של טכניקה זו היא טכניקה זו היא היכולת יוצאת דופן של CK2 להשתמש GTP עבור העברת קבוצת זרחן. תוספת של הולואנזים CK2 אקסוגני יחד עם אנלוגי GTP, GTPgammaS, לליזאט תא, תוצאות תיופוספרילציה של מצעים אנדוגני CK2. הטיפול הבא של ליסט עם p-Nitrobenzyl mesylate reagent alkylating מייצר מויטי אסתר תיופוספט על חלבוני מצע ספציפיים אלה, כי אז יכול להיות immunoprecipitated באמצעות נוגדן אסתר אנטי תיופוספט ובסופו של דבר מזוהה על ידי ספקטרומטריית מסה.בתוצאות החיוביות הייצוגיות המוצגות כאן, CK2 תלוי, thiophosphorylation ו אלקליות הבאים היו מוצלחים. כצפוי, אות אסתר אנטי-תיופוספט משופר על ידי כתמים מערביים נצפה רק בנתיב המכיל את תגובת קינאז מלאה, ולא ב GTPgammaS בלבד ו PNMB רק דגימות מטופלות. ג'ל מוכתם כחול קומאסי של חלבונים immunoprecipitated ו רמז, גם להפגין תוצאה חיובית.כמו להקות ייחודיות מרובות ניכרים רק בנתיב IP אסתר אנטי-תיופוספט, שבו ליסט היה דגירה עם CK2 אקסוגני GTPgammaS. לאחר מכן, הלהקה המסומנת הוצאה מהג'ל והוגשתה לזיהוי חלבונים על ידי ספקטרומטריית מסה. בעקבות הליך זה, יש לאמת מצעים CK2 putative שזוהו על ידי ספקטרומטריית מסה באמצעות גישה נוספת, כגון על ידי זרחון תלוי CK2 בהתעקשות תקן במבחנה קינאז.

identification-novel-ck2-kinase-substrates-using-versatile

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

קינאז leucine חזור ריץ' 2 הוא קינאז multidomain גדול, מוטציות שהן הגורם הגנטי השכיח ביותר של מחלת פרקינסון. ניתוח של פעילות קינאז של החלבון הזה הוכיחה להיות כלי חיוני בהבנת הביולוגיה תפקוד של חלבון זה. במאמר...

Assaying פעילות קינאז של LRRK2 במבחנה</em

באמצעות מערכי חלבון המכיל כמעט את כל ס proteome cerevisiae הוא חקר לחקירה משוחדת מהירה של אלפי אינטראקציות חלבון-חלבון במקביל. שיטה זו יכולה להיות מנוצלת למולקולת חלבון קטן, שינוי posttranslational, ומבחנים אחרים בתפוקה גבוהה.

חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות

זרחון חלבונים הוא מאפיין מרכזי של האופן שבו תאים מפרשים ומגיבים למידע בסביבה החוץ-תאית שלהם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול סינון בתפוקה גבוהה באמצעות קינאזות מטוהרות מתאי יונקים כדי לזהות במהירות קינאזות המזרחנות סובסטרט (ים) מעניין.

זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה

מתואר מבחן תפוקה גבוהה לבדיקת אנזימים. ערכת בדיקה מוכנה לשימוש מרובה זו מורכבת ממצעי Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) שנבחרו מראש ומצעי Chromogenic B iomass (ICB) מורכביםI בלתי מסיסים. אנזימי המטרה הם אנדו-אנזימים ופרוטאזות מפרקים רב-סוכרים.

הקרנת תפוקה גבוהה של אנזימים פחמימות-משפיל שימוש רומן מסיסים chromogenic המצע Assay ערכות

ליפאזות (פוספו)ליפאזות חזויות רבות מאופיינות בצורה גרועה מבחינת הספציפיות של הסובסטרט והתפקודים הפיזיולוגיים שלהן. כאן אנו מספקים פרוטוקול לייעול פעילות האנזימים, חיפוש אחר סובסטרטים טבעיים ומציעים פונקציות פיזיולוגיות לאנזימים אלה.

הגדרת מצע ספציפי עבור מועמדי lipase ו פוספוליפאז

קינאזות חלבון מתפתחות מאוד אנזימים איתות פיגומים קריטיים עבור התמרה אות בין תאיים בין תאיים. אנו מציגים פרוטוקול למדידת פעילות קינאז באמצעות שימוש ב- triposphate אדנוזין רדיולאבל ([γ- 32 P] ATP), שיטה אמינה לסיוע בהבהרת רגולציה של אותות סלולריים.

Assaying חלבון פעילות עם Kinase Radiolabeled

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כמותי וניתן להרחבה לבצע מסכי מולקולה קטנים ממוקד עבור הרגולטורים קינאז של המעבר pluripotent נאיבי מתוחכם.

שיטה פשוטה לזהות קינאזות כי לווסת עובריים גזע עובריים גזע על ידי תפוקה גבוהה מעכב הקרנה

קינאז תלוי-cyclin 1 (Cdk1) מופעל בשלב G2 של מחזור התא, מסדיר משעולים הסלולר רבים. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול להצפנה assay קינאז במבחנה עם Cdk1, אשר מאפשר זיהוי אתרי זירחון ספציפי Cdk1 להקמת מטרות תאיות של קינאז חשוב.

זיהוי של קינאז תלוי-Cyclin 1 אתרי זירחון ספציפיים על-ידי קינאז במבחנה Assay

אנו מאופיינים חלבון קינאז חדש באמצעות גישות ביוכימיים חזקים: ניתוח כתמי אבן מערבית עם נוגדן ספציפי ייעודי על קווי תאים שונים ורקמות, אינטראקציות על ידי ניסויים coimmunoprecipitation, הפעילות של קינאז שזוהו על ידי המערב כתם באמצעות נוגדן ספציפי פוספהו ועל ידי γ [32P] ATP תיוג.

אפיון ברמה המולקולרית באמצעות גישות ביוכימיות איתנות של חלבון קינאז חדש

פרוטוקול מפורט ליצירת מיקרומערכים של חלבון אנושי מורכב באמצעות הקרנת מעכבי הסרט מוצג.

הקרנת מעכבי קינאז במיקרוערכים של חלבון אנושי מורכב בעצמו

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש במצעים המוצגים על פני השטח של שמרים לבדיקות שינוי אנזימטיות. הפלטפורמה הודגמה באמצעות ניתוח פעילות הדפוספורילציה של טירוזין פוספטאז SHP-2 כנגד אחד המצעים שלו כבדיקת שינוי אנזימטי מייצגת.

שינוי אנזימטי והערכת ציטומטריית זרימה של חלבונים המוצגים על פני השטח של שמרים

למד לזהות סובסטרטים אנדוגניים של קינאז CK2 מתוך ליזטים תאיים או רקמות באמצעות תיופוספורילציה ואלקילציה. שיטה זו מאפשרת עשירה ספציפית וזיהוי חלבוני מטרה לחקר תפקידי CK2 בתא.

זיהוי של סובסטרטים קינאז CK2 הרומן תוך שימוש בגישה הביוכימי רב-תכליתי

גלה סרטונים נוספים