זיהוי של סובסטרטים קינאז CK2 הרומן תוך שימוש בגישה הביוכימי רב-תכליתי
21 בפברואר 2019
המטרה של פרוטוקול זה היא תווית להעשיר, לזהות סובסטרטים של קינאז CK2 מתוך מדגם ביולוגיים מורכבים כגון תא lysate או homogenate הרקמה. שיטה זו ממנפת את ההיבטים הייחודיים של הביולוגיה CK2 למטרה זו.
פרוטוקול זה מאפשר תיוג ספציפי והעשרה וזיהוי של מצעי CK2 אנדוגניים מדגימה ביולוגית מורכבת כגון ליסס תא או רקמה. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל סוג תא או רקמה. ובכך להקל, המחקר של CK2 בהקשרים ביולוגיים שונים.
מדגים את ההליך יהיה ג'ון Chojnowski, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, באופן מכני lyse מדגם הרקמה או תאים מתורבתים כמתואר בפרוטוקול הטקסט כדי לאסוף סך של 900 microliters של מדגם. צנטריפוגה ב 17, 500 פעמים כבידה בארבע מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות.
לאחר מכן, להעביר 270 microliters של supernatant לכל אחד משלושה צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.7 מיליליטר חדש. הסר 40 מיקרוליטרים של העל-טבעי הנותרים שישמשו כבקרת קלט, והעבר אותו לצינור חדש. מניחים את כל הדגימות על קרח.
ראשית, סמן כל אחד משלושת צינורות הדגימה כפי שמוצג כאן. לצינור התגובה Kinase, להוסיף 2.7 microliters של CK2 ו 2.7 microliters של 2.5 מילימולאר GTPgammaS. מצליפים בצינור כדי לערבב, ומיד מניחים אותו על קרח.
לצינור GTPgammaS בלבד, הוסיפו 2.7 מיקרוליטרים של GTPgammaS 2.5 מילימולרים ו-2.7 מיקרוליטרים של מאגר ליזה. תצליף בצינור הזה כדי לערבב, ומיד תן לו קרח. לצינור PNBM בלבד להוסיף 5.4 microliters של מאגר ליזה.
מצליפים בצינור כדי לערבב, ומיד מניחים אותו על קרח. דגירה כל שלושת הצינורות באמבט מים ב 30 מעלות צלזיוס לדקה אחת. לאחר מכן, להוסיף 13.5 microliters של PNBM ב 12 מיליגרם למיליליטר לכל צינור.
להפוך את הצינורות כדי לערבב את הדגימות, ולהדגור את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. בזמן שהדגימות דגירה, סמן כל אחת מהעמודות כך שהדגימה תיטען, כפי שמוצג כאן. הכן את העמודות על-ידי היפוך כל עמודה מספר פעמים כדי להוסיף שימוש חוזר לשרף Sephadex G-25 במאגר האחסון.
צרף כל עמודה לעמוד מהדק, ותן לו לשבת באין מפריע במשך כחמש דקות כדי לאפשר את שהרשת להתיישב. לאחר מכן, מניחים צינור מתחת לפתיחה התחתונה של כל עמודה. הסר את הכובעים הן מהחלק העליון והן מהחלק התחתון של כל עמודה, כדי לאפשר למאגר האחסון להתנקז לצינורות בכוח הכבידה.
לאחר חיץ האחסון מתרוקן, להוסיף כ 2.7 מיליליטר של מאגר ליזה לכל עמודה כדי לצייד אותם, הקפד לאסוף ולזרוק את הזרימה דרך. חזור על תהליך זה של הוספת מאגר Lysis ומבטל את הזרימה דרך, שלוש פעמים. כדי להתחיל, טען כל דגימה בעמודה המתאימה לה.
לאסוף ולזרוק את הזרימה דרך. הוסף 420 מיקרוליטרים של מאגר ליזה לכל עמודה כדי לשטוף את הדגימות. תן למאגר Lysis לסנן דרך העמודה, ולאסוף ולמחוק את הזרימה דרך.
לאחר מכן, מניחים צינורות למיקום מתחת לכל עמודה לאיסוף לדוגמה. הוסף 500 מיקרוליטרים של מאגר Lysis לכל עמודה כדי לחמק מהדגימות. לאסוף את הזרימה דרך, אשר מכיל כעת אוכלוסייה מועשרת של מצעים CK2 thiophosphorylated ו alkylated בתגובת קינאז.
התגובה GTPgammaS בלבד יכיל מצעים thiophosphorylated ו alkylated על ידי כל CK2 אנדוגני נוכח. תגובת PNMB בלבד תכיל חלבונים אלקילואטים ברקע. הסר 80 מיקרוליטרים מכל אלוטיון כדגימה לבקרת קלט אלוטיון.
לאחר מכן, לפצל כל מדגם לשני צינורות שכל אחד מכיל 200 microliters. סמן כל אחד מהצינורות כאנטי-תיופוספט אסתר או אימונוגלובולין G, כפי שמוצג כאן. הוסף 2.8 מיקרוגרם של נוגדן אסתר אנטי-תיופוספט לכל אחד מצינורות אסתר אנטי-תיופוספט.
הוסף 2.8 מיקרוגרם של נוגדן בקרת Isotype לכל אחד מצינורות IGG. ואז למקם את הצינורות על מסובב בארבע מעלות צלזיוס במשך שעתיים. במהלך 15 הדקות האחרונות של הדגירה לדוגמה, השתמש בסכין גילוח נקי כדי לחתוך את הקצה של קצה פיפטה P200 כדי להגדיל את גודל המד.
מיד לפני השימוש, בקצרה מערבולת צינור האחסון המכיל את חרוזים agarose. באמצעות קצה פיפטה לחתוך, להעביר 100 microliters של תרחיף חרוזים לכל immunoprecipitation לצינור microcentrifuge חדש 1.7 מיליליטר. חשוב למערבולת את חרוזים לפני כל העברה כדי למנוע חרוזים להתיישב.
צנטריפוגה הצינורות ב 17, 500 פעמים כוח הכבידה בארבע מעלות צלזיוס לדקה אחת. הסר והשליך את העל-טבעי. תוסיפו מחדש את חרוזים על ידי הוספת 200 מיקרוליטרים של מאגר ליזה ומערבולת לזמן קצר כדי לערבב.
חזור על תהליך זה של צנטריפוגה ושטיפת חרוזים שלוש פעמים. לאחר הכביסה הסופית, מניחים את חרוזים על קרח עד מוכן להמשיך. כאשר הדגימות סיימו דגירה, צנטריפוגה אותם ב 17, 500 פעמים כבידה בארבע מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות.
לאחר מכן, להעביר 200 microliters של כל מדגם לצינורות המכילים את חרוזים שטף. מניחים את הצינורות על מסובב בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן, צנטריפוגה הצינורות ב 17, 500 פעמים כבידה בארבע מעלות צלזיוס לדקה אחת.
הסר 40 מיקרוליטרים מכל על-טבעי כדי לחסוך כבקרת דלדול. הסר והשליך את שאר העל-טבעי, נזהר שלא להפריע לקדושים. לשטוף את הדגימות על ידי הוספת 200 microliters של מאגר ליזה לכל מערבולת בקצרה.
צנטריפוגה ב 17, 500 פעמים כבידה בארבע מעלות צלזיוס לדקה אחת, השלכת העל טבעי. חזור על תהליך שטיפה וצנטריפוגה זה שלוש פעמים דואג לא להפריע חרוזים. לאחר מכן, להוסיף 50 microliters של מאגר מדגם 2X לכל מדגם המכיל חרוזים.
עבור כל הדוגמאות האחרות, הכוללות את בקרת הקלט, פקדי קלט האלוטיון ופקדי הדלדול, הוסף 8 מיקרוליטרים של מאגר מדגם 6X. פיפטה כל צינור למעלה ולמטה לערבב למעט צינורות המכילים חרוזים, לחמם את כל הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות לפני שתמשיך עם SDS-PAGE. כדי להעריך אם האימונופרציפציה הצליחה, הפעל 25 עד 30 מיקרוליטרים של כל דגימה שחמקה מעולםים בג'ל פוליאקרילמיד נפרד של 12.5%.
הכתם כל ג'ל בכחול קומאסי כדי לדמיין חלבונים מועשרים מהשלבים השונים של פרוטוקול הניסוי. באמצעות סכיני גילוח חדשים ונקיים, יש למלמל בזהירות את כל הרצועות הייחודיות הקיימות בתגובת הקינאז נגד תיופוספט אסתר IP ליין, תוך שים לב למשקולות המולקולריות המשוערות שלהם. יש להשתמש בסכין גילוח חדש עבור כל רצועה ייחודית.
הבסיס של טכניקה זו היא טכניקה זו היא היכולת יוצאת דופן של CK2 להשתמש GTP עבור העברת קבוצת זרחן. תוספת של הולואנזים CK2 אקסוגני יחד עם אנלוגי GTP, GTPgammaS, לליזאט תא, תוצאות תיופוספרילציה של מצעים אנדוגני CK2. הטיפול הבא של ליסט עם p-Nitrobenzyl mesylate reagent alkylating מייצר מויטי אסתר תיופוספט על חלבוני מצע ספציפיים אלה, כי אז יכול להיות immunoprecipitated באמצעות נוגדן אסתר אנטי תיופוספט ובסופו של דבר מזוהה על ידי ספקטרומטריית מסה.
בתוצאות החיוביות הייצוגיות המוצגות כאן, CK2 תלוי, thiophosphorylation ו אלקליות הבאים היו מוצלחים. כצפוי, אות אסתר אנטי-תיופוספט משופר על ידי כתמים מערביים נצפה רק בנתיב המכיל את תגובת קינאז מלאה, ולא ב GTPgammaS בלבד ו PNMB רק דגימות מטופלות. ג'ל מוכתם כחול קומאסי של חלבונים immunoprecipitated ו רמז, גם להפגין תוצאה חיובית.
כמו להקות ייחודיות מרובות ניכרים רק בנתיב IP אסתר אנטי-תיופוספט, שבו ליסט היה דגירה עם CK2 אקסוגני GTPgammaS. לאחר מכן, הלהקה המסומנת הוצאה מהג'ל והוגשתה לזיהוי חלבונים על ידי ספקטרומטריית מסה. בעקבות הליך זה, יש לאמת מצעים CK2 putative שזוהו על ידי ספקטרומטריית מסה באמצעות גישה נוספת, כגון על ידי זרחון תלוי CK2 בהתעקשות תקן במבחנה קינאז.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מאפשר סימון ספציפי, ולאחריו העשרה וזיהוי, של סובסטראטים אנדוגניים של CK2 מדגימות ביולוגיות מורכבות, כגון ליזאטים של תאים או רקמות. ניתן להחיל את השיטה על כל סוג תא או רקמה, ובכך להקל על חקר CK2 בהקשרים ביולוגיים שונים.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום המדע
- ביוכימיה
- ביולוגיה של התא
- כימיה של חלבונים
רקע
- CK2 הוא קינאז מסוג serine/threonine המעורב בתהליכים תאיים שונים.
- הבנת הסובסטראטים של CK2 חיונית להבהרת תפקידיו הביולוגיים.
- פרוטוקול זה משפר את היכולת לחקור את CK2 בהקשרים ביולוגיים שונים.
- סימון אנדוגני מספק תובנות לגבי הסובסטראטים הטבעיים של CK2.
מטרת המחקר
- לסימון והעשרה של סובסטראטים של CK2 מדגימות ביולוגיות.
- לזיהוי הסובסטראטים הספציפיים של CK2 בסוגי תאים שונים.
- להקל על המחקר בנוגע לתפקידו של CK2 בתפקודים תאיים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- ליזיס מכני של דגימות רקמה או תאים בתרבית.
- צנטריפוגציה ב-17,500 ×g בטמפרטורה של 4 °C.
- העשרה עוקבת של סובסטראטים של CK2 מהליזאט.
- זיהוי הסובסטראטים באמצעות טכניקות ביוכימיות.
תוצאות עיקריות
- סימון מוצלח של substrates של CK2 מדגימות מורכבות.
- זיהוי של substrates שונים בסוגי תאים שונים.
- הדגמה של יעילות הפרוטוקול בהקשרים ביולוגיים מגוונים.
- תובנות לגבי התפקידים הפונקציונליים של CK2 בתהליכים תאיים.
מסקנות
- פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה לחקר סובסטראטים של CK2.
- ניתן להתאימו למגוון דגימות ביולוגיות והקשרים שונים.
- הממצאים מחזקים את הבנתנו לגבי החשיבות הביולוגית של CK2.
שאלות נשאלות שכיחות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
זיהוי סובסטראטים של קינאז הוא קריטי לתיקוף המטרה (target validation) ולהורדת סיכונים מכניסטיים בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות. גישה ביוכימית זו מאפשרת העשרה וזיהוי ספציפיים של סובסטראטים של CK2, ובכך תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים במערכות הרלוונטיות למחלה. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי על ידי אספקת נתונים כמותיים וניתנים לשחזור על פעילות הקינאז בהקשרים ביולוגיים מגוונים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות מיפוי של רשתות סובסטרט CK2 במודלים של מחלות אנושיות.
- ערך תפעולי: מספק תהליך עבודה הניתן לשחזור לצורך תיקוף תפקודי של מטרות באמצעות סימון אנדוגני מליזטים מורכבים.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח באמצעות זיהוי סובסטרטים הקשורים למסלולים אונקוגניים ב-glioblastoma ובהקשרים אחרים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: יוצר מערכות ביולוגיות מתוקפות העשירות בסובסטראטים של CK2 שעברו תיספורילציה (thiophosphorylated), מה שמאפשר סריקה מהימנה של תרכובות.
- ערך תפעולי: מספק פלטים כמותיים וסטנדרטיים באמצעות LC-MS/MS התומכים בחזרתיות ובמדרגיות של הבדיקה.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: ניתנת להתאמה לכל סוג תא או רקמה, מה שמאפשר יישום חוצה-פרויקטים בתהליכי הפחתת סיכונים של מטרות (target de-risking).
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- ערך מדעי: מקשר בין הפעילות של CK2 לסובסטראטים הרלוונטיים למחלה ב глиובלסטומה אנושית, ובכך תומך בהתאמה של סמנים ביולוגיים תרגומיים.
- ערך תפעולי: מבטיח רצף משלב הגילוי ועד לאימות פרה-קליני על ידי אספקת זיהוי עקבי של סובסטראטים במודלים שונים.
- הפחתת סיכונים: מפחיתה עמימות מכניסטית במסלולים המונעים על ידי CK2, ובכך מסייעת בקבלת החלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) בשלב הפרה-קליני.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
השיטה נשמת בתוך רצף הגילוי, החל מזיהוי המטרה ועד לאופטימיזציה של מוביל, ובמיוחד עבור קינזים בעלי תפקודים פליאוטרופיים כמו CK2.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים באמצעות סימון ספציפי של סובסטראטים אנדוגניים של CK2.
- סריקה: מאפשרת מוכנות לבדיקה על ידי ייצור מאגרי סובסטראטים מועשרים וכמותיים לצורך פרופילינג של מעכבים.
- אנליטיקה: מייצרת תוצאות LC-MS/MS המאפשרות השוואה של פעילות CK2 תחת תנאים ניסיוניים משתנים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין פעילות קינאז לסובסטראטים של מחלות במודלים של סרטן בבני אדם, ובכך תומכת ברלוונטיות של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמה לשימוש חוזר למיפוי סובסטראטים של קינאז עבור מטרות ותחומי מחלה מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה על ידי הפחתת תוצאות חיוביות שגויות בהקצאות של קינאזה-סובסטרט.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות באמצעות שלבי ליזיס, העשרה ואימונופרספיטציה סטנדרטיים.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים מוקדמת של מטרות קינאזה לפני אופטימיזציה יקרה של המולקולה המובילה.
- השפעה על פורטפוליו: מספק מידע לתעדוף מותאם סיכונים על ידי זיהוי סובסטרטים עם קשר חזק למחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביוכימיה של קינאזים, שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) ופרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות.
- תלוי בגישה לאנזים CK2, ל-GTPgammaS, ל-PNBM, לנוגדנים נגד אסטר תיאו-פוספט ולתשתית LC-MS/MS.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית לטיפול בדגימות, לעקביות בליזיס ולניתוח נתונים בין קבוצות מחקר בסיסיות (discovery) וקבוצות מחקר יישומיות (translational).
- ניתן להתאמה למערכות מודל שונות, אך מומלץ לבצע אישור של סובסטרטים באמצעות בדיקות קינאז אורתוגונליות.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך בכמות מספקת של ליזאט ואופטימיזציה של זמני הדגרה עבור סובסטרטים בריכוז נמוך.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:35
Preparation of the Tissue Samples
1:20
Kinase Assay: Thiophosphorylation and Alkylation
2:34
Preparation of the Desalting Columns
3:40
Removal of PNBM
4:42
Immunoprecipitation: Part I
5:32
Protein A/G Agarose Bead Preparation
6:39
Immunoprecipitation: Part II
8:19
Analysis/Validation of Results
9:06
Results: Analysis and Identification of Novel CK2 Kinase Substrates
10:48
Conclusion
