מתקדמים במבחנה Culturing טכנולוגיה ללמוד את Microbiota בטן האדם

מטרת פרוטוקול זה היא לתרבות מיקרוביוטה במעיים במבחנה. זה יאפשר ללמוד את הדינמיקה של מיקרוביוטה מבלי לשקול את תרומתו של מרכיב מודרני. באמצעות מערכת במבחנה רב-שלבית זו, אנו סופרים את קהילת המיקרוביוטה שתתפתח בלומין ועל הריר של אזורים מרובים של המעי הגס ניתן להתחיל בו זמנית.

הדגמה חזותית של שיטה זו מועילה בשל המורכבות של מערכת זו במבחנה. התחל על ידי מילוי המעי הגס העולה עם 500 מיליליטר של מדיום מוגדר, המעי הגס הרוחבי עם 800 מיליליטר של מדיום מוגדר, ואת המעי הגס היורד עם 600 מיליליטר של מדיום מוגדר. הוסף agricarriers mucin לאזורי המעי הגס בכמות פרופורציונלית לנפח של הכור, ולהשתמש צינור מדגם מזרק כדי להסיר כל מדיום מוגדר עודף מכל כור.

השתמש בבדיקות ה- pH כדי להתאים את ה- pH בכל כור. ולהדליק את סומק החנקן במשך 20 דקות. לאחר מכן, להפשיר את homogenate צואה על פי הנחיות היצרן לפני טעינת מזרק 60 מיליליטר עם מדגם הומוגנטי צואה.

לאחר מכן, לחסן כל כור המעי הגס דרך יציאת המדגם עם כמות הומוגנית שווה 5% של כל נפח הכור לתרבות לילה עם בקרת pH. למחרת בבוקר, לנקות את המנעול luer על הנמל מדגם של כל bioreactor עם אלכוהול. כאשר היציאות התייבשו, חבר את המזרק 30 מיליליטר, פינה מכל האוויר, לאחת היציאות מדגם.

מוציאים את הבוכנה שלוש עד חמש פעמים כדי להבטיח ערבוב יסודי של רכיבי כלי השיט לפני שאפת 15 מיליליטר של supernate של התרבות מן bioreactor. ואז להעביר את דגימת הזוהר לתוך צינור פלקון סטרילי ולהחמין על קרח. לניתוח דנ"א, לאסוף אחד עד שלושה מיליליטר של נוזל זוהר באמצעות מזרק חמישה מיליליטר.

לאסוף את הטופס supernate את הביו-חומרים האחרים באותו אופן. כדי להניח בצד חומר מדגם לניתוח חומצות שומן בשרשרת קצרה, צנטריפוגה 15 מיליליטר של המדגם הזוהר של עניין, ומזרק לסנן את supernate באמצעות מסנן נקבוביות מיקרומטר 0.2 עבור מינוס 80 מעלות צלזיוס אחסון. כדי להניח בצד חומר מדגם לניתוח DNA, צנטריפוגה מיליליטר אחד של נוזל זוהר ולאחסן את גלולה במינוס 80 מעלות צלזיוס.

לקציר דגימת ריר, הסר את נשאי המוצין המוכנים מאחסון של ארבע מעלות צלזיוס והדליק את סומק החנקן. פתח במהירות את מכסה הכור והחלף 50% מהנשאים בכל כור במכסים חדשים. לאחר שכל המובילים הוחלפו, חותמים במהירות את המכסה ושומרים על סומק החנקן למשך 20 דקות נוספות.

ואז aliquot 0.25 כדי 0.5 גרם של אגר נושאת mucin לתוך צינורות בודדים שני מיליליטר עבור אחסון מינוס 80 מעלות צלזיוס עד מיצוי DNA. שלוש פעמים ביום המערכת עוברת מחזורים באופן אוטומטי. זה מתחיל עם 140 מיליליטר של מדיום מוגדר שהועבר לתוך bioreactor הקיבה ואחריו דגירה של שעה אחת עם בקרת pH.

בסוף הדגירה, תכולת הקיבה מועברת למעי הדק יחד עם 60 מיליליטר של מיץ לבלב. ב bioreactor המעי הדק, ה- pH מותאם באופן אוטומטי ל 6.7 עד 6.9, ואת התוכן דגירה במשך 90 דקות. במהלך הדגירה הזו, סומק החנקן עבור כל מערכת מופעל במשך סך של 10 דקות.

בסוף הדגירה הזו, התוכן מהמעי הדק מועבר אל המעי הגס העולה, מן המעי הגס העולה אל המעי הגס הרוחבי, מן המעי הגס הרוחבי אל המעי הגס היורד, ומהעי הגס היורד אל הפסולת. בניתוח קואורדינטות ראשיות מייצג זה, הקהילה השתנתה באופן פחת בין ימים 1 ל-7. עם זאת, מהיום ה-11 שלאחר החיסון ועד סוף הניסוי, הדגימות כבשו אזור קטן של מרחב ניתוח הקואורדינטות העיקרי עבור שני מדגמים כדי לדגום ציוני מרחק המבוססים על יחידה אירונומית מבצעית, נוכחות להיעדרות ושפע.

המדידה של שלוש חומצות שומן בולטות קצרות שרשראות מגלה כי חומצה Propionic, חומצה Butanoic, וחומצה אצטית להשתנות מתחילת הניסוי עד היום 15 לאחר חיסון. לאחר יום 15, כמויות חומצות אלה המיוצרים בכל אזור המעי הגס נשארו קבועים עם שינויים מינימליים בלבד עד סוף הניסוי. ניתוח של הקהילה היציבה לשלב הזוהר והלוע של כל אזור המעי הגס מדגים כי הקהילות המתפתחות באזורי המעי הגס הבודדים של מערכת המוח החוץ-חוץ-פסיק דומות להרכב הצואה inoculum.

השוואת מגוון האלפא של מערכת ההקדמה מגלה רמה דומה של גיוון כמו זו של inoculum עבור כל האזורים למעט דגימות הזוהר מהאזור העולה. הוכחת כי מערכת תרבות במבחנה מסוגלת לייצר קהילה דומה לאנוקולום הצואה הן מבחינת הרכב והן מבחינת גיוון. כדי לייצר קהילת מיקרוביוטה יציבה במעיים באמצעות פרוטוקול זה, חיוני להבטיח כי הפתרונות מוכנים במדויק, כי תנאים אנאירוביים ופרמטרים pH נשמרים לאורך כל הניסוי.

בעקבות הליך זה, ניתן לנתח דגימות עבור הרכב הקהילה באמצעות רצף DNA הדור הבא ואחריו ניתוח ביואינפורמטי עבור פונקציונליות באמצעות מטבולומיקה.