Name: מדידה רגישה מאוד של חדירות הפקאוליות בעכברים עם פלואורואסעין איזוטיקריאט-פוליסוכרוז 70 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: למד שיטה רגישה מאוד למדידת חדירות פקאוליות בעכברים באמצעות סמן פלואורסצנטי. שיטה זו מאפשרת ניתורים חוזרים בנפח שתן מינימלי למחקרי נפרולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מודים לכריסטינה שוואנדט, בלנקה Duvnjak, ו ניקולא Kuhr עבור הסיוע הטכני היוצא דופן שלהם ד ר. דניס סון על עזרתו עם הסריקה הפלואורסצנטית. מחקר זה היה נתמך על ידי מענק של הגרמני Forschsgeמייסמייססביס2 (DFG) SFB 612 TP B18 כדי L.C.R. ו L.S. לפאנדר לא היה כל תפקיד בעיצוב הלמידה, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

החקירות נערכו בהתאם להנחיות המפורטות במדריך לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים (מכוני הבריאות הלאומיים של ארה"ב No. 85-23, תוקן 1996). כל ניסויי בעלי החיים בוצעו בהתאם לאישורים המוסדיים הרלוונטיים (ממשלת מדינת המדינה לנדסברג מספר 84-02.04.2012. A397).
1. הכנת מכשירים, פתרונות וציוד
<ol><li>מהווים מחדש FITC-polysucrose 70 עם 0.9% נתרן כלוריד סטרילי (הנאל) לריכוז הסופי של 10 מ"ג/mL (כלומר, 100 mg ב 10 מ ל של נאל).</li>
	<li>Dialyze FITC-פוליסוקרוז 70 פתרון כדי להסיר מולקולות FITC חינם לילה ב 4 ° צ' (משקל מולקולרי לגזור [MWCO] ב 10,000). השתמש 1 L של 0.9% הנאסה סטרילי ל 10 מ ל של FITC-פוליסוקרוז 70 תחת ערבוב קבוע. . הגנה מפני אור מחלקים את הדיליזד FITC-פוליסוכרוז 70 ומאחסנים אותו ב-20 ° c.</li>
	<li>עבור FITC-polysucrose 70 בולוס, להוסיף 4 μL של 10 מ"ג/mL FITC-polysucrose 70 פתרון ל 996 μL של 0.9% (הריכוז הסופי של FITC-polysucrose 70:40 μg/mL).</li>
	<li>עבור פתרון אינפוזיה באמצעות שיווי משקל, הוסף 20 μL של 10 מ"ג/mL FITC-poly, 70 הפתרון ל-9.98 mL של 0.9% מניב הנאלים סטרילי לריכוז הסופי של 20 μg/mL.</li>
	<li>עבור הפתרון הניסיוני, להוסיף תרופות או חומרים לפתרון אינפוזיה (למשל, עבור אנגיוטנסין II [אנג ii] [100 ng/kg/min] עבור 25 גרם עכבר, להוסיף 3 μl של אנג השני של פתרון 1 מ"מ).</li>
	<li>לניתוח, הכינו מכונת גילוח אחת, שתי מלחציים כירורגיים, זוג מספריים כירורגיים, שתי מלקחיים, שתי מלקחיים משובחים, זוג מספריים עדינים ומטליות. הכינו שרשורי משי 2 10 ס מ (4-0 עד 6-0) להליכי הארכה.</li>
	<li>למיקום של צנתר הורידים המרכזי, להכין מזרק 10 מ ל עם מחט G 21. מניחים את קצה המחט בצנתר באורך 30 ס מ (עם קוטר פנימי [ID] של 0.58 מ"מ). לחבר את קטטר 0.58 מ"מ ל קטטר 10 ס מ (עם מזהה של 0.28 מ"מ). חותכים את הקצה של המלוכסן קטן יותר כדי ליצור טיפ חד הציג לתוך הווריד העורק.</li>
	<li>הכינו את ההרדמה (כלומר, קטמין הרדמה בתוך הצפק, 100 מ"ג/ק"ג של משקל הגוף, ו xylazine, 5 מ"ג/ק"ג של משקל הגוף).</li>
	<li>הכינו 22 G אנגיוקטטר על ידי מחיקת המחט וסימון קטטר 1 ס מ מהקצה. מחממים את משטח החימום עד 37 ° c.</li>
	<li>הכן מכשיר ללחץ דם ושנה את קרום מדידת לחץ הדם במידת הצורך.</li>
</ol>2. שלב ההכנה
<ol><li>קטטר השתן הערה: סעיף 2.1 עוקב אחר הפרוטוקול כפי שמתואר על ידי רייס ואח '7. איור 1 ומשלים איור 1 להראות את המיקום של קטטר השתן בעכברים נקבה.<ol>
<li>לגרד את העכבר עם קטמין/xylazine (ראה שלב 1.8). תשתמש במבחן הבוהן. כדי לאשר הרדמה נכונה כדי לשמור על הרדמה, לחזור על ההרדמה (למשל, עם חצי המינון) לאחר 60 min. הרדמה נכונה הוא אישר אם הבוהן צביטה הבדיקה אינה תוצאה נסיגה רפלקס. הערה: עכברים FVB הנשי משמשים בפרוטוקול זה.</li>
		<li>הצב את העכבר בתוך שכיבה מקדימה על משטח חימום 37 ° c. הדקו את הבטן התחתונה ומצאו את השופכה האוסטיץ (למשל, תחת מיקרוסקופ).</li>
		<li>השתמש בחלק פלסטיק של הצנתר של 22 G אנגיוצנתר ולשמן אותו עם xylocaine gel. הציגו אותו בזהירות 3 מ"מ בתוך האואסטיום ומקבילים לציר המרוחק (איור 1A).</li>
		<li>הפוך את החלק העליון של הצנתר הקטטר 180 ° על-ידי שמירה על הקצה בתוך האוסטאל ostium ושמירה על ציר השופכה (איור 1B).</li>
		<li>הצג את הקטטר 7 מ"מ עוד יותר לתוך העכבר כך שהוא ממוקם בתוך שלפוחית השתן (איור 1C). אל תכפה את הקטטר. מעבר להתנגדות תקן את המיקום של הקטטר מההתחלה אם ההתנגדות הוא הרגיש. שימו לב כי אם המיקום של קטטר השתן נכון, השתן עשוי להופיע כבר בתוך הקטטר.</li>
		<li>מניחים צינור 1.5 mL חום מעל החלק העליון של הקטטר לאסוף את השתן. החל 1 מ ל של 0.9% תת-עורי לשפר את ייצור השתן.</li>
	</ol></li>
	<li>קטטר ורידי מרכזי
	<ol>
<li>לגלח את הצוואר של העכבר ולמקם אותו שכיבה עם הראש לכיוון המנתח. הרחב את ראש העכבר באמצעות קלטת.</li>
		<li>לחטא את הצוואר עם 70% איזופנול. הפוך את חתך העור הקטן (5 מ"מ) מתחת לקו הלסת, באמצעות טוויצר וזוג מספריים. חותכים את העור כ 1 ס מ לכיוון עצם החזה עד אמצע עצם החזה.</li>
		<li>מנתחים בזהירות את העור בצד ימין של הצוואר, באמצעות זוג מספריים. לעשות חתך מלבני של העור בצד ימין של העכבר כדי לחשוף את הרקמה הרך של הצוואר. . תשתמש בזוג מספריים וטוויצר לתקן את מדפים העור עם שני מלחציים. הערה: וריד הצוואר רץ לאורך הצד השמאלי של בלוטת התריס או מכוסה מעט על ידי האונה הימנית של בלוטת התריס. לאחר שלב זה, להשתמש במיקרוסקופ לניתוח.</li>
		<li>בזהירות לחשוף את הווריד העורק על ידי הכנה קהה, באמצעות קצה של הטוויצר המשובח. הימנע מפגיעה בענפי הווריד. הערה: ייתכן שיהיה צורך להסיר רקמות באמצעות מספריים עדינים. להיזהר בעת שימוש במספריים להסיר את הרקמה כפי שהוא מגביר את הסיכון של דימום.</li>
		<li>מקום וסגור ליגטורה עם חוט משי (4-0 עד 6-0) בחלק המרוחק של הווריד הגלוי של העורק (לכיוון הראש של העכבר). לשים מתח על הקשירה על ידי תיקון חוט המשי עם קלטת כדי להבטיח מתח קל על וריד הצוואר. הכינו ליגטורה סביב החלק הטוב. ביותר של עורק הצוואר</li>
		<li>למלא את הקטטר עם פתרון אינפוזיה equilibration (ראה שלב 1.4) ולתקן את הקטטר עם הקלטת, כך הקטטר מיישר את וריד הצוואר. שליטה על בועות כדי למנוע תסחיף אוויר.</li>
		<li>הרם את וריד הצוואר עם מלקחיים עדינים באתר הכניסה (אתר הכניסה הוא 1 – 2 מ"מ מתחת לקשירה). יישר את הצינורות במקביל. לעורק הצוואר נקב את וריד הצוואר, כיוון לומן, והכנס בערך 2 – 4 מ"מ, מקבילים לציר עורק הצוואר. הימנע מתנועות מרעננות.</li>
		<li>. תסגור את הקשירה כדי לתקן את הצנתר שליטה על התכווצות הקשירה על ידי הצגת בזהירות דרך המיקרוסקופ. לשים מטלית לחה על האתר של הניתוח.</li>
	</ol></li>
	<li>מדידת לחץ דם
	<ol>
<li>מניחים את הזנב בתחתית הזנב של העכבר כאשר העכבר מניח בתוך שכיבה. הפעל את המידות וחזור עליהן 10x לכל נקודת זמן. לבנות ממוצע מן המידות.</li>
		<li>להתאים את המיקום של הזנב-חפתים אם מדידות לחץ דם לא נראה נכון ונתונים שווא מיוצרים.</li>
	</ol></li>
</ol>3. שלב השיווציה
<ol><li>שינוי צינור השתן לפני ששלב האקוויליציה מתחיל ומניחים אותו על הקרח.</li>
	<li>להציג מזרק 10 מ ל מלא בפתרון הפאזה FITC בשלב (ראה שלב 1.4) עם המחט 21 G ואת קטטר גדול (עם מזהה של 0.58 מ"מ) ומניחים אותו לתוך משאבת המזרק.</li>
	<li>מקפלים ספוגית ולשים אותו סביב קטטר כלי קטן (עם מזהה של 0.28 מ"מ) כי הוא הציג לתוך וריד הצוואר. . הנח את הצנתר בתוך הדגימה לבטל את זרימת הדם הרטרוגרדי. או את תסחיף האוויר לחבר המחט 27 G עם מזרק 1 מ"ל מלא עם בולוס FITC לסוף קטטר כלי קטן.</li>
	<li>פתח את התפס והחל את בולוס ה-FITC (100 μL). סגרו את המלחציים שוב וחברו את הצנתר הגדול יותר עם הקטטר הקטן יותר. הפעל את משאבת המזרק עם 0.008 mL/min (0.480 mL/h). המשך העירוי עבור 60 דקות.</li>
</ol>4. השלב הניסיוני
הערה: בשלב זה, את השפעת התרופות על הפרקטיביות הגלומפרוטיביות ניתן לחקור.
<ol><li>לשנות את צינור השתן (נקודת זמן 0 דקות) אחר 1.5 mL אחר צינור חום. לשים דגימה סביב קטטר כלי קטן ולסגור מהדק כפי שמצוין בשלב 3.3.</li>
	<li>נתקו את הקטטר הגדול. מצנתר כלי-הקיבול הקטן לשנות את הזרקים לפתרונות הפאזה הניסיונית (ראה שלב 1.5). תנו למשאבת האינפוזיה לפעול כך שהקטטר הגדול יתמלא בתמיסה האקוויליציה.</li>
	<li>חברו מחדש את הקטטרים תוך הימנעות מתסחיף אוויר ופתח מחדש את המלחציים. הפעל את משאבת המזרק ב 0.008 mL/min.</li>
	<li>המשך להפעיל את משאבת המזרק עבור 60 דקות ולאסוף את השתן בתוך צינור השתן לאחר מכן (שתן 60 דקות). . הניחו את צינור השתן על הקרח</li>
	<li>להקריב את העכבר על ידי פריקה צוואר הרחם במהלך ההרדמה. לפני הסילוק העכבר הוא נצפתה 5 דקות כדי להבטיח שהוא מת.</li>
</ol>5. ניתוח שתן
<ol><li>
מדידה פלואורסצנטית
	<ol>
<li>להפשיר את בריכת השתן ולדלל אותו 1:10 עם מלוחים באגירה פוספט (PBS). הערה: בריכת השתן היא בריכה של שתן שנאסף מעכברים בריאים באוסף של 12-24 שעות על השתן בכלוב מטבולית.</li>
		<li>הכן סטנדרטים למדידה הקרינה הפלואורסצנטית. לקחת 10 חום 1.5 mL ולתייג אותם ריק (1:10 בריכת שתן מדולל) ואת הבאים FITC-polysucrose 70 ריכוזי (0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80, ו-160 μg/mL).</li>
		<li>Pipet 246 μL של בריכת שתן מדולל לתוך צינור חום 1.5 mL ולהוסיף 4 μL של FITC-polysucrose 70 מלאי ריכוז (ראה שלב 1.1) כדי לקבל ריכוז סופי של 160 μg/mL FITC-polysucrose 70. Pipet 100 μL של בריכת השתן מדולל לתוך כל הצינורות האחרים.</li>
		<li>לדלל 1:2 על ידי pipetting 100 μL של 160 μg/mL FITC-פוליסוקרוז 70 לתוך שפופרת μg/mL ב80 ולהמשיך עם ריכוזים אחרים. להבטיח תערובת נכונה של ריכוזי מדולל (למשל, על ידי הרכבת השפופרת לפני שתמשיך).</li>
		<li>לדלל את דגימת שתן העכבר (0 דקות, 60 דקות) 1:10 עם בריכת השתן מדולל.</li>
		<li>פיפטה 5 μL של כל תקן FITC-polysucrose 70 הריכוז של דגימות שתן העכבר כמו טריליטים בצלחת שחור 384-באר. צנטריפוגה את הצלחת ב 1,000 x g עבור 15 s כדי למנוע בועות.</li>
		<li>לנתח את הצלחת 384-טוב בקורא צלחת. לבצע עירור ב 496 ננומטר ולמדוד את הזריחה ב 525 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מדידת קריאטינין
	<ol>
<li>בצע את הוראות היצרן. בקצרה, הכנת תקני קריאטינין על ידי דילול 10 μL של הפתרון הסטנדרטי 100 mM קריאטינין עם 990 μL של מאגר שיטת קריאטינין כדי להכין פתרון 1 מ"מ סטנדרטי.</li>
		<li>הוסף 0, 2, 4, 6, 8, ו 10 μL של פתרון סטנדרטי קריאטינין 1 מ"מ לתוך צלחת 96-באר כדי ליצור 0, 2, 4, 6, 8, ו 10 nmol/טוב סטנדרטים, בהתאמה. הוסף מאגר שיטת קריאטינין לכל באר כדי להביא את אמצעי האחסון ל 50 μL.</li>
		<li>להכין את תערובות התגובה על ידי הוספת 42 – 44 μL של מאגר שיטת קריאטינין, 2 μL של שילוב של יצורים, 2 μL של יצורים, 2 μL של מיקס אנזים קריאטינין, ו 2 μL של לווין קריאטינין. עבור ריק, להשתמש 44 μL של מאגר שיטת קריאטינין, 2 μL של יצורים, 2 μL של מיקס אנזימים של קריאטינין, ו 1 – 2 μL של לווין קריאטינין.</li>
		<li>הוסף 50 μL של שילוב התגובה המתאים לכל טוב בצלחת 96-באר ו דגירה אותו עבור 60 דקות על שייקר אופקי ב 37 ° c. להגן על צלחת מפני אור במהלך הדגירה. למדוד את ספיגת ב 570 ננומטר על קורא צלחת.</li>
		<li>חישוב ריכוזי קריאטינין על ידי הפחתת הערך הריק מכל הקריאות. התוצאה תהיה הננו מיקרואולס/microomליטר היחידה. להכפיל את הריכוז של קריאטינין על ידי המשקל המולקולרי של קריאטינין (113.12 ng/nmol) כדי לקבל את היחידה ננוגרם/מיקרוליטר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. ניתוח נתונים
<ol><li>לחשב את FITC-polysucrose 70 בריכוז שתן מהעיקול הרגיל.</li>
	<li>הפניה ל-FITC-polysucrose 70 ריכוזי השתן לריכוזי קריאטינין בדגימת השתן הייצוגית.</li>
	<li>להפנות את השתן 60 דקות דגימות לשתן 0 דקות דגימות של פקדים ועכברים מטופלים.</li>
</ol>

<ol><li>Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+estimated+glomerular+filtration+rate+and+albuminuria+with+all-cause+and+cardiovascular+mortality+in+general+population+cohorts%3A+a+collaborative+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis.</a> Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).</li>
<li>Mori, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+of+Total+Nephron+Albumin+Filtration+and+Reabsorption+in+Diabetic+Nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Increase of Total Nephron Albumin Filtration and Reabsorption in Diabetic Nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 278-289 (2017).</li>
<li>Amsellem, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cubilin+is+essential+for+albumin+reabsorption+in+the+renal+proximal+tubule%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 21 (11), 1859-1867 (2010).</li>
<li>Axelsson, J., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+dynamic+changes+in+glomerular+permeability+to+macromolecules+during+systemic+angiotensin+II+%28ANG+II%29+infusion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid, dynamic changes in glomerular permeability to macromolecules during systemic angiotensin II (ANG II) infusion in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (6), F790-F799 (2012).</li>
<li>Grande, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unaltered+size+selectivity+of+the+glomerular+filtration+barrier+in+caveolin-1+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Unaltered size selectivity of the glomerular filtration barrier in caveolin-1 knockout mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (2), F257-F262 (2009).</li>
<li>Jeansson, M., Haraldsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+size+and+charge+selectivity+in+the+mouse+after+exposure+to+glucosaminoglycan-degrading+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Glomerular size and charge selectivity in the mouse after exposure to glucosaminoglycan-degrading enzymes.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 14 (7), 1756-1765 (2003).</li>
<li>Reis, L. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+features+of+the+urethra+and+urinary+bladder+catheterization+in+female+mice+and+rats.+An+essential+translational+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cirurgica+Brasileira%22%5BJournal%5D)">Anatomical features of the urethra and urinary bladder catheterization in female mice and rats. An essential translational tool.</a> Acta Cirurgica Brasileira. 26, 106-110 (2011).</li>
<li>Konigshausen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+increases+glomerular+permeability+by+beta-arrestin+mediated+nephrin+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis.</a> Scientific Reports. 6, 39513(2016).</li>
<li>Venturoli, D., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ficoll+and+dextran+vs.+globular+proteins+as+probes+for+testing+glomerular+permselectivity%3A+effects+of+molecular+size%2C+shape%2C+charge%2C+and+deformability%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ficoll and dextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular permselectivity: effects of molecular size, shape, charge, and deformability.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (4), F605-F613 (2005).</li>
<li>Bohrer, M. P., Deen, W. M., Robertson, C. R., Troy, J. L., Brenner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+molecular+configuration+on+the+passage+of+macromolecules+across+the+glomerular+capillary+wall%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Influence of molecular configuration on the passage of macromolecules across the glomerular capillary wall.</a> The Journal of General Physiology. 74 (5), 583-593 (1979).</li>
<li>Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+hyperpermeability+after+acute+unilateral+ureteral+obstruction%3A+Effects+of+Tempol%2C+NOS-%2C+RhoA-+and+Rac-1-inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: Effects of Tempol, NOS-, RhoA- and Rac-1-inhibition.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. , (2018).</li>
<li>Dolinina, J., Sverrisson, K., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+synthase+inhibition+causes+acute+increases+in+glomerular+permeability+in+vivo%2C+dependent+upon+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide synthase inhibition causes acute increases in glomerular permeability in vivo, dependent upon reactive oxygen species.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), F984-F990 (2016).</li>
<li>Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+reactive+oxygen+species+%28ROS%29-dependent+effects+of+IL-1beta%2C+TNF-alpha%2C+and+IL-6+on+the+glomerular+filtration+barrier+%28GFB%29+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Acute reactive oxygen species (ROS)-dependent effects of IL-1beta, TNF-alpha, and IL-6 on the glomerular filtration barrier (GFB) in vivo.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 309 (9), F800-F806 (2015).</li>
<li>Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic%2C+size-selective+effects+of+protamine+sulfate+and+hyaluronidase+on+the+rat+glomerular+filtration+barrier+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Dynamic, size-selective effects of protamine sulfate and hyaluronidase on the rat glomerular filtration barrier in vivo.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 307 (10), F1136-F1143 (2014).</li>
<li>Sverrisson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+fetal+hemoglobin+induces+increases+in+glomerular+permeability%3A+inhibition+with+alpha1-microglobulin+and+tempol%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Extracellular fetal hemoglobin induces increases in glomerular permeability: inhibition with alpha1-microglobulin and tempol.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 306 (4), F442-F448 (2014).</li>
<li>Axelsson, J., Mahmutovic, I., Rippe, A., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+size+selectivity+of+the+glomerular+filtration+barrier+in+rats+following+laparotomy+and+muscle+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Loss of size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats following laparotomy and muscle trauma.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (3), F577-F582 (2009).</li>
<li>Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+sustained+increases+in+glomerular+permeability+following+ANP+infusion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transient and sustained increases in glomerular permeability following ANP infusion in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (1), F24-F30 (2011).</li>
<li>Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+hyperglycemia+induces+rapid%2C+reversible+increases+in+glomerular+permeability+in+nondiabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Acute hyperglycemia induces rapid, reversible increases in glomerular permeability in nondiabetic rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 298 (6), F1306-F1312 (2010).</li>
<li>Axelsson, J., Rippe, A., Venturoli, D., Sward, P., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+early+endotoxemia+and+dextran-induced+anaphylaxis+on+the+size+selectivity+of+the+glomerular+filtration+barrier+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of early endotoxemia and dextran-induced anaphylaxis on the size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 296 (2), F242-F248 (2009).</li>
<li>Andersson, M., Nilsson, U., Hjalmarsson, C., Haraldsson, B., Nystrom, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mild+renal+ischemia-reperfusion+reduces+charge+and+size+selectivity+of+the+glomerular+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mild renal ischemia-reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (6), F1802-F1809 (2007).</li>
<li>Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+hyperpermeability+after+acute+unilateral+ureteral+obstruction%3A+effects+of+Tempol%2C+NOS%2C+RhoA%2C+and+Rac-1+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: effects of Tempol, NOS, RhoA, and Rac-1 inhibition.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (3), F445-F453 (2018).</li>
<li>Rosengren, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transvascular+protein+transport+in+mice+lacking+endothelial+caveolae%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transvascular protein transport in mice lacking endothelial caveolae.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (3), H1371-H1377 (2006).</li>
<li>Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+simultaneous+measurement+of+mouse+systolic+arterial+blood+pressure+by+radiotelemetry+and+tail-cuff+methods%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), H2408-H2415 (2004).</li>
<li>Eisner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+contribution+of+tubular+secretion+to+creatinine+clearance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice.</a> Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

השיטה המוצגת מאפשרת לחוקר לבדוק חדירות הפקפיות בעכברים באופן רגיש מאוד באמצעות מכשיר מעקב. עם שיטה זו, עליות לטווח קצר בחדירות הפקפיות ניתן לאבחן באמצעות כמויות קטנות בלבד של שתן. הצעדים הקריטיים ביותר עבור מאסטרינג בהצלחה טכניקה זו הם 1) לפתח מומחיות ידנית בניתוח העכבר, במיוחד בצינורית של וריד מרכזי, 2) הצבת קטטר השתן מבלי לפגוע רירית, ו 3) מומחיות ידנית בטיפול 384-ובכן צלחות עם כמויות קטנות של דגימות.
כאשר הצבת צנתר הורידים המרכזי, חיוני כי הקטטר לא לחדור את הווריד העורק. כדי למנוע חדירה, אנ...

פגמים פונקציונליים או מבניים בתוך המכשול סינון פקייתי להגדיל את חדירות הפקתית לאלבומין, וכתוצאה מכך הזיהוי של אלבומין בשתן (אלבומין). אלבומין מנבא תוצאות לב וכלי דם והוא סמן חשוב לפציעה בלתי מסומנת1. אפילו רמות נמוכות של אלבומין, שוכב בטווח הנורמלי, משויכים לסיכון לב וכלי דם מוגבר1.
בתנאים פיסיולוגיים, אלבומין מסונן דרך הגלובולוס וכמעט לחלוטין נספג מחדש במערכת הכרישים2,3. בעכברים, הגילוי של אלבומין בשתן מבוצע בדרך כלל על ידי שיטת חיסוני מקושרת של האנזים (אליסה) מתוך 24 שעות של איסוף שתן. אם שתן של 24 שעות בתוך אוסף שתן או שתן ספוט משמש, הבדלים קטנים ריכוזי אלבומין עלול להחמיץ עקב בעיות רגישות. רוב החוקרים, לכן, להשתמש במודלים בעלי חיים שבו אלבומין הנגרמת על ידי פגיעת כליות חזקה עקב רעלים, סמים, ניתוח כליות.
לפיכך, מציאת שיטה רגישה לגילוי שינויים קטנים וארעיים בחדירות הפקפיות, חשובה מאוד לתחום. Rippe ואח ' הציגו מודל חולדה כדי לבחון חדירות פקפיות על ידי החלת מעקב התווית fluorescently כלומר FITC-polysucrose 70 (כלומר, FITC-Ficoll 70), בגודל של אלבומין4. יישום המעקב מאפשר בדיקה של שינויים לטווח קצר בחדירות הפקליות (בתוך דקות) והוא רגיש מאוד4. שני מחקרים השתמשו בשיטת המעקב. בעכברים5,6 למרות היתרונות שלה, שיטה זו, למרבה הצער, יש חסרונות: זה מבחינה טכנית מאוד מורכב, רדיואקטיבי, פולשנית. ניתוח נוסף של השתן מתבצע רק על ידי שימוש בסינון ג'ל או הוצאת מידות5,6.
בתוך הנייר הזה, אנו מציגים חלופה חלופית, רגיש, לא רדיואקטיבי, ומהירה שיטה למדוד חדירות הפקפיות בעכברים באמצעות פלואורוסקופים התווית FITC-polysucrose 70. על ידי החדרת קטטר ההמרה, השתן אוסף הוא פחות פולשנית מאשר ניקוב שלפוחית השתן, דלקת כריתת גרון, ויישום קטטר suprapubic, ומאפשר איסוף שתן לפחות כל 30 דקות. ניתוח שתן מבוצע מכמויות קטנות (5μL) באמצעות קורא לוחית פלורסנט. ריכוזי המעקב בשתן מנורמלות לריכוזי קריאטינין בשתן באמצעות שיטת קריאטינין אנזימטית.
לכן, שיטה זו הרומן מציע כלי רגיש כדי ללמוד פציעה מוקדמת פקפיות עם חדירות מוגברת.

<table><tbody><tr><td>מוטיק SMZ168 BL</td> מיקרוסקופ <td>SMZ168BL מוטי</td><td></td><td>לניתוח עכברים</td></tr><tr><td>KL1500LCD</td><td>מיקרוסקופיה פולץ' ולורנץ</td><td>150500</td><td>אור לניתוח עכברים</td></tr><tr><td>מיקרופדרשר</td><td>בראון, Aesculap</td><td>FD100R</td><td>מספריים עדינים</td></tr><tr><td>Durotip Feine Scheren</td><td>Braun, Aesculap</td><td>BC210R</td><td>לחיתוך צוואר</td></tr><tr><td>אנטומיש פינזט</td><td>בראון, Aesculap</td><td>BD215R</td><td>לניתוח&nbsp;</td></tr><tr><td>Pr&auml; parierklemme</td><td>Aesculap</td><td>BJ008R</td><td>לניתוח&nbsp;</td></tr><tr><td>Seraflex</td><td>Serag Wiessner</td><td>חוט משי</td><td>IC108000</td></tr><tr><td>קטמין 10%</td> <td>Medistar</td><td></td><td>הרדמה</td></tr><tr><td>Rompun (Xylazin) 2%</td> <td>Bayer</td><td></td><td>הרדמה</td></tr><tr><td>עדינה נשא פוליאתן ID 0.28 מ"מ OD 0.61 מ"מ</td><td>Portex</td><td>800/100/100</td><td>קטטר</td></tr><tr><td>קדח עדין צינור פוליאתן ID 0.58 מ"מ OD 0.96 מ"מ</td><td>Portex</td><td>800/100/200</td><td>קטטר</td></tr><tr><td>מכשיר הרווארד 11 פלוס</td><td>הרווארד מכשיר</td><td>70-2209</td><td>משאבת מזרק</td></tr><tr><td>BD Insyte Autoguard</td><td>BD</td><td>381823</td><td>&nbsp; קטטר שתן</td></tr><tr><td>גלאי מולטימוד DTX 880</td><td>בקמן קולטר</td><td></td><td>קורא צלחות</td></tr><tr><td>384 באר מיקרוטיטרפלייט</td><td>Nunc</td><td>262260</td><td>384 באר פלט</td></tr><tr><td>ערכת בדיקת קריאטינין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK080</td><td>למדידת ריכוז קריאטינין</td></tr><tr><td>96 באר צלחת</td><td>Nunc</td><td>260836</td><td>לבדיקת קריאטינין&nbsp;</td></tr><tr><td>פוליסוקרוז 70 TBD עם תווית FITC</td><td>ייעוץ</td><td>FP70</td><td>FITC-ficoll</td></tr><tr><td>Angiotensin II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9525</td><td>המשמש לבדיקת חדירות גלומרולרית</td></tr><tr><td>BP-98A</td><td>Softron</td><td></td><td>למדידת לחץ דם</td></tr><tr><td>OTS 40.3040</td><td>Medite</td><td>01-4005-00</td><td>צלחת חימום לניתוח עכברים</td></tr><tr><td>Instillagel 6 מ"ל</td><td>Farco-Pharma GmbH</td><td></td><td>לצנתר שתן</td></tr><tr><td>Exacta</td><td>Aesculap</td><td>GT415</td><td>מכונת גילוח</td></tr></tbody></table>

מדידה רגישה מאוד של חדירות הפקאוליות בעכברים עם פלואורואסעין איזוטיקריאט-פוליסוכרוז 70

Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

אובדן אלבומין בשתן (אלבומין) צופה תוצאות לב וכלי דם. בתנאים פיזיולוגיים, כמויות קטנות של אלבומין מסוננים על ידי הפקעית ונספג מחדש במערכת הכרישים עד למגבלת הספיגה. לפיכך, מגדילה מוקדמת של סינון האלבומין הפתולוגי עלול להיות חסר על ידי ניתוח אלבומין. לכן, השימוש במשדרים כדי לבדוק את הפרסלקטיביות מופיע כיתרון. מעקב אחר התווית fluorescocyanate (FITC)-פוליסוקרוז (כלומר, FITC-Ficoll) ניתן להשתמש כדי ללמוד את המנתקטיביות. מולקולות FITC-polyסוכות מסוננים בחופשיות על ידי הפקעית, אך לא נספג מחדש במערכת הכרישים. בעכברים וחולדות, FITC-polysucrose נחקר במודלים של חדירות הפקפיות באמצעות הליכים מורכבים מבחינה טכנית (כלומר, מדידות רדיואקטיביות, כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים [הכדאיות], סינון ג'ל). יש לנו שינוי והקלה בפרוטוקול FITC-polysucrose מבוססי מעקב כדי לבדוק עליות מוקדם וקטן בחדירות הפקליות כדי FITC-polysucrose 70 (גודל אלבומין) בעכברים. שיטה זו מאפשרת ניתוחי שתן חוזרים עם אמצעי השתן הקטנים (5 μL). פרוטוקול זה מכיל מידע על כיצד מעקב FITC-polysucrose 70 מוחל באופן הפנים והשתן נאסף באמצעות קטטר השתן פשוטה. שתן מנותח באמצעות קורא צלחת פלואורסצנטית מנורמל לסמן ריכוז שתן (קריאטינין), ובכך להימנע הליכים מורכבים מבחינה טכנית.

כפי שמתואר באיור 2, השיטה לבדיקת חדירות הפקפיות בעכברים מובנית בשלושה שלבים. השלב הראשון נקרא שלב ההכנה, שבו קטטר השתן ואת קטטר הורידים המרכזי ממוקמים. השלב השני נקרא שלב השיווציה, החל בהזרקה בעירוי של FITC-polysucrose 70 ואחריו אינפוזיה רציפה של FITC-polyסוכות 70 עבור 60 דקות. השלב האחרון נקרא. השלב הניסיוני בשלב זה, העירוי של FITC-polysucrose 70 ממשיך, תרופות או חומרים אחרים ניתן לבחון להשפיע על חדירות הפקפיות. השתן נאסף בסוף כל שלב.
<p class="jove_cont...

בעכברים המשתמשים במעקב. רגיש ולא רדיואקטיבי שיטה זו מאפשרת ניתוחי שתן חוזרים ונשנים עם כמויות שתן קטנות.

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האנפרולוגיה על התפקיד של חדרות גלומרולרית במחלת כליות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי עליות קטנות וחולפות של חבירה גלומרולרית מזוהים באמצעות מעקב עופרת פלואורסצנטי שכותרתו. לאחר ההרדמה, מניחים קטטר שתן בעכבר הנשי.מקם את העכבר בהפוגה הגבית. הדק את הבטן התחתונה ולמצוא את אוסטיום השופכה. להשיג את החלק הפלסטי של קטטר של אנגיוקטטר 22 G ולשמן אותו עם ג'ל קסילוקאין.השתמש באצבע המורה השמאלית כדי למקם מתח זהיר על הבטן התחתונה ולהציג את הקטטר שלושה מילימטרים לתוך אוסטיום השופכה תוך מקביל לציר השופכה הדיסטלי. להפוך את החלק העליון של אנגיוקטר 180 מעלות על ידי שמירה על הקצה בתוך אוסטיום השופכה ושמירה על הציר של השופכה. לאחר מכן, להציג את קטטר שבעה מילימטר עוד יותר לתוך העכבר, כך שהוא ממוקם בתוך שלפוחית השתן.מניחים צינור חום 1.5 מיליליטר מעל החלק העליון של אנגיוקטר כדי לאסוף את השתן. החל מיליליטר אחד של 0.9% נתרן כלורי תת עורית כדי לשפר את ייצור השתן. לגלח את הצוואר של העכבר ולמקום אותו בהפוגה עם הראש לכיוון המנתח.היפר להאריך את ראש העכבר עם קלטת. לחטא את הצוואר עם 70% isopropanol. באמצעות פינצטה וזוג מספריים לעשות חתך בעור חמישה מילימטר מתחת לקו הלסת.חותכים את העור כ סנטימטר אחד לכיוון עצם החזה עד אמצע עצם החזה הוא הגיע. תשתמש בזוג מספריים. בזהיר

highly-sensitive-measurement-glomerular-permeability-mice-with

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

טכניקת ניצול הרזולוציה הגבוהה intavital מיקרוסקופיה 2 פוטונים ישירות לדמיין ולכמת סינון gloemrular במשטח glomeruli. שיטה זו מאפשרת קביעה ישירה של מאפייני חדירות של מולקולות במצבים נורמלים ובחולים.

כימות חדירות גלומרולרי של מקרומולקולות פלורסנט באמצעות מיקרוסקופ 2-פוטון בחולדות Wistar מינכן

שכבת פני שטח glycocalyx / אנדותל האנדותל היא למד באופן אידיאלי באמצעות מיקרוסקופ intravital. מיקרוסקופיה Intravital טכני מאתגרת באיבר מרגש כגון ריאות. אנחנו מדגימים איך brightfield סימולטני ומיקרוסקופיה ניאון ניתן להשתמש כדי להעריך את עובי שכבת פני שטח האנדותל שבנע...

במדידת vivo של שכבת פני שטח האנדותל ריאתי המאוסה

מדידה של קצב סינון גלומרולרי (GFR) היא תקן הזהב להערכת תפקוד כליות. כאן אנו מתארים שיטת תפוקה גבוהה המאפשרת קביעת GFR בעכברים מודעים באמצעות זריקה אחת בולוס, קביעת isothiocyanate ההעמסה (FITC)-אינולין בפלזמה וחישוב GFR ידי מודל דעיכה מעריכית שני שלבים.

שיטת תפוקה גבוהה למדידה של קצב סינון הגלומרולרי בעכברים בהכרה

קביעת קצב הסינון הגלומרולרי (GFR) היא תקן הזהב להערכת תפקוד הכליות הכללי. עם זאת, הליכים מסורתיים למדידת פרמטר זה הם מסורבלים ודורשים השקעה גדולה של זמן. כאן אנו מתארים שיטה מהירה וזעיר פולשנית לקביעת GFR דרך העור.

הערכת Transcutaneous של תפקוד כלייתי במכרסמי Conscious

פרוטוקול זה מתאר של הכליה מלא עבודה מעלה כי צריך להתבצע במודלים של העכבר של מחלת glomerular. השיטות מאפשרים ניתוח פונקציונלי, מבניים מכניסטית מפורט של הפונקציה glomerular, אשר ניתן להחיל על כל הדגמים העכבר של המחלה glomerular.

הערכה של תפקוד כליות במודלים של העכבר של מחלת Glomerular

כאן נתאר פרוטוקול כדי למדוד את קצב הסינון glomerular (GFR), בהכרה, לנוע בחופשיות עכברים באמצעות צג GFR דרך העור.

Transdermal מדידה של קצב הסינון Glomerular בעכברים

כאן אנו מציגים פרוטוקול המשתמש במיקרוסקופיה של 2 פוטונים בחולדות Wistar Fromter במינכן עם גלומרולי פני השטח כדי לכמת את ההשפעות של חסימת שופכה ממושכת על הדינמיקה והתפקוד של גלומרולרי.

שימוש במיקרוסקופיה של 2-פוטונים כדי לכמת את ההשפעות של חסימת שופכה חד-צדדית כרונית על תהליכים גלומרולריים

קצב סינון גלומרולרי (GFR) הוא הסמן האידיאלי להערכת תפקוד הכליות. עם זאת, שיטת המדידה הסטנדרטית באמצעות הזרקת אינולין עם ניתוח דם ושתן סדרתי אינה מעשית. מאמר זה מתאר שיטה מעשית למדידת GFR באופן טרנסדרמלי בחזירונים.

מדידה טרנסדרמלית של קצב סינון גלומרולרי בחזירונים מאווררים מכנית

במחקר הנוכחי, דקסטרן פלואורסצאין-איזותיוציאנט-מסומן (FITC) מנוהל לעכברים דרך הפה כדי להעריך את חדירות המעי הן in vivo והן בדגימות פלזמה וצואה. מכיוון שתפקוד מחסום המעי מושפע בתהליכי מחלה רבים, ניתן להשתמש בבדיקה ישירה וכמותית זו בתחומי מחקר מגוונים.

הערכה של שלמות מחסום המעי בעכברים באמצעות דקסטרן עם תווית פלואורסצאין-איזותיוציאנט

מחקר זה מציג מערך קל לשימוש, שלם ופשוט של שיטות לתייג ולנתח גלומרולי מכליות עכבר שעברו ניקוי מעוקב. נתונים כגון מספר גלומרולוס ונפח ניתן להשיג בקלות ובאמינות באמצעות fluorescein isothiocyanate (FITC)-Dextran, מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור (LSFM), או מיקרוסקופ קונפוקלי נפוץ ותוכנה כגון Imaris.

שיטה יעילה ומהירה לתיוג וניתוח גלומרולי עכבר

למד שיטה רגישה מאוד למדידת חדירות פקאוליות בעכברים באמצעות סמן פלואורסצנטי. שיטה זו מאפשרת ניתורים חוזרים בנפח שתן מינימלי למחקרי נפרולוגיה.

מדידה רגישה מאוד של חדירות הפקאוליות בעכברים עם פלואורואסעין איזוטיקריאט-פוליסוכרוז 70

גלה סרטונים נוספים