Name: שמרים כתושבת לפיתוח Assays פונקציונלי ללמוד אנושי האדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 57 s
Description: חקור פרוטוקולים לבניית זני שמרים מדווחים לחקר פוטנציאל השעתוק של P53 אנושי והשפעת מוטציות הקשורות לסרטן. השיטה מאפשרת להעריך פעילות חלבון ואינטראקציות עם קופקטורים ב-Saccharomyces cerevisiae.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לאיחוד האירופי (כספי פדר poci/01/0145/פדר/007728 באמצעות מתכנתים המבצע מפעל להתחרות) וכספים לאומיים (fct/MEC, האופרה הלאומית של ciência e ומיניצ) באמצעות ה הסכם שותפות PT2020 UID/קי/50006/2019 והפרוייקטים (3599-PPCDT) לפטין/DTP-FTO/1981/2014-POCI-01-0145-פדר-016581. מלגות FCT: SFRH/BD/96189/2013 (S. גומז). עבודה זו נתמכת על ידי Compagnia S. פאולו, טורינו, איטליה (פרויקט 2017.0526) ומשרד הבריאות, (פרויקט 5x1000, 2015 ו 2016; המחקר הנוכחי 2016). אנו מודים עמוקות ד ר תרזה לופס-אריות מונטנגרו (אוניברסיטת טרנטו, מעבדות לימוד של מדעים ניסיוניים) לסיוע בהקלטת וידאו.

1. בנייה של ADE2 או LUC1 כתבת זנים שמרים המכיל מחדש מסוים (YAFM-re או ylfm-re)
<ol><li>פס yAFM icore או ylfm-icore להתאמץ12,14 (icore = אני, isce-i endonuclease תחת GAL1 יזם; CO = מונה לבחירה URA3; RE = כתבת KanMX4 הענקת התנגדות לקנאמיצין; שולחן 1) מ 15% מניות גליצרול שאוחסנו ב-80 ° c על צלחת בע (שולחן 2). תן לו לצמוח 2-3 ימים ב 30 ° c.</li>
	<li>קח מושבה אחת שמרים מן הלוח הטרי (לא יותר מ 3 שבועות בן) ומניחים אותו בבקבוקון קטן המכיל 5 מ ל YPDA (שולחן 2). דגירה ב 30 ° צ' לילה, רועד ב 150-200 סל ד.</li>
	<li>למחרת, כדי להסיר את כל העקבות של דקסטרוז, מצנלת את התאים עבור 2 דקות ב 3,000 x g ולמחוק את הסופרנטנט על ידי היפוך של הצינור. הערה: בצע את כל הcentrifugations בפרוטוקול זה בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>להשעות מחדש את הגלולה תא ב 30-50 מ ל של טרום מחומם (מדיה מלאה) המכיל את גלקטוז (שולחן 2) ו הדגירה עבור 4 h ב 30 ° c, לרעוד ב 150-200 סל"ד (הכרחי עבור אינדוקציה של I-scei).</li>
	<li>צנטריפוגה את התאים עבור 2 דקות ב 3,000 x g ולמחוק את supernatant על ידי היפוך של הצינור.</li>
	<li>להשעות מחדש את הגלולה בתא ב 30-50 מ ל של מים סטריליים. חזור על שלב 1.5.</li>
	<li>השהה מחדש את הגלולה ב -10 מ ל של מים סטריליים. חזור על שלב 1.5.</li>
	<li>להשעות מחדש את הגלולה תא 5 מ ל של LiAcTE סטרילי (שולחן 3), פתרון יונית מעדיף ספיגת ה-DNA. חזור על שלב 1.5.</li>
	<li>להשעות מחדש את הגלולה תא ב 250 μL של LiAcTE סטרילי ולהעביר את התאים לצינור 1.5 mL. חזור על שלב 1.5 והשהה מחדש את הגלולה הסלולרית ב 300-500 μL של LiAcTE סטרילי.</li>
	<li>במהלך השטף, הטמפרטורה 10 מ"ג/mL של הספק ה-DNA של זרע של דג סלמון עבור 10 דקות ב 100 ° צ' ולהירגע מיד על הקרח כדי לשמור עליו כמו דנ א אחד נטוש.</li>
	<li>ב שפופרת נפרד 1.5 mL, להוסיף 500 picomoles הרצוי של מחלת השמש הרצויה (שולחן 3), 5 μl של ה-DNA של הנושאת זרע של סלמון מבושלים, 300 μl של השעיית liacte מבושל (שולחן 3), ו50 μl של הבולם התא של שמרים (משלב 1.9).</li>
	<li>מערבולת את הצינורות עבור 10 s כדי לערבב ו דגירה עבור 30 דקות ב 30 ° צ', רועד ב 150-200 סל ד. מניחים את צינורות 1.5 mL בצד לטובת לרעוד.</li>
	<li>החום הלם התאים שמרים עבור 15 דקות ב 42 ° c בבלוק חימום, ולאחר מכן צנטריפוגה את התאים עבור 20 s ב 10,000 x g. הסר את הסופרנטאנט והשהה מחדש את התאים ב-1 מ ל של מים סטריליים.</li>
	<li>התפשטות 100 μL של השעיית התא על הצלחת באגר YPDA ומודטה (הפוך) ליום אחד ב 30 ° c. כדי להבטיח היטב הופרדו מושבות מתקבלים, גם להפיץ 100 μL של 1:10 דילול.</li>
	<li>למחרת, צלחת עותק משוכפל באמצעות לוטרינרים סטרילי על צלחת אגר ס מ המכיל דקסטרוז ו 5-זה (שולחן 2). לשקול צלחת העתק השני על צלחת חדשה אם הרבה תאים מועברים (כלומר, כמה הצמיחה של URA3 תאים).</li>
	<li>שלושה ימים לאחר מכן, לוחית העתק על שאינם סלקטיבית YPDA ו-YPDA המכיל G418 (אנטיביוטיקה הגליקסייד דומה לקאנאמיצין) אגר צלחות (שולחן 2), סימון כל צלחת כדי להקל על ההשוואה הבאים שלהם. מודאת הצלחות לילה. ב -30 מעלות צלזיוס</li>
	<li>למחרת, לזהות את זני העיתונאי המועמדים ממושבות כי הם G418 רגישים אבל לגדול על צלחות YPDA (למשל, yLFM-או yAFM-RE מושבות). פס המושבות מזוהה (3-6 מושבות) על צלחת YPDA חדש כדי לקבל מושבה אחת לבודד ולתת להם לגדול עבור יומיים ב 30 ° c.</li>
	<li>תיקון מושבות שמרים יחיד על צלחת YPDA כדי לבודד את המושבות עבור ניתוחים נוספים. לאחר 24 שעות ב 30 ° c, מבחן אותם על ידי ציפוי משוכפל על צלחת באגר YPGA (שולחן 2) למנוע את הצמיחה של מוטציות קטנות (כלומר, המוטנטים לקויה הנשימה). באותו זמן, לוחית העתק על צלחת חדשה של YPDA אגר.</li>
	<li>בדוק את התיקונים הנכונים (כלומר, צמיחה על YPDA ו-YPDA אגר צלחות; 1-3 מושבות) משלב 1.18 לנוכחות של התיקון הנכון של מחלת האוגיונואוןעל ידי המושבה PCR. להרכיב תערובת התגובה על ידי הוספת 5 μl של מאגר ה-PCR 10x (1.5 mM mgcl2), 2 μl של 10 picomoles/μl התחל (שולחן 3), 4 μl של 2.5 mM dntps, 0.25 μl של 5 U/μl מסוג, ומים לנפח הסופי של 50 μ הכפל את תערובת התגובה עבור מספר מושבות שמרים צריך להיות מוקרן ו סדרת מחלקים 50 μl לתוך כל צינור PCR. באמצעות פיפטה, להוסיף כמות קטנה מאוד של תאים שמרים מהצלחת הלוח YPDA לתוך ערבוב אחד התגובה PCR.</li>
	<li>בצע את תגובת ה-PCR באמצעות התוכנית הבאה: 94 ° צ' למשך 8 דקות ואחריו 35 מחזורי הדנטורציה עבור 1 דקות ב-94 ° c, מעגלי התחל עבור 1 דקות בשעה 55 ° c וסיומת 2 דקות ב-72 ° c.</li>
	<li>לאחר השלמת התגובה, טען סדרת מחלקים של תגובת ה-PCR (כעשירית הנפח) על ג'ל agarose כדי לבדוק את הגודל הנכון (~ 500 bp).</li>
	<li>רצף את מוצר ה-PCR לאחר הטיהור עם ערכת מסחרית כדי לאשר את האינטגרציה של הרצף RE הרצוי באמצעות אותו התחל של שלב 1.19.</li>
	<li>לאחר האימות של הרצף הנכון, לעשות 15% גליצרול מלאי של תרבות yAFM-RE או yLFM-RE הזנים (ב YPDA) ולאחסן אותו ב--80 ° c.</li>
</ol>2. הערכה של יכולת הפעלת חלבון P53 באמצעות האיכות האיכותית ADE2 שמרים המבוססת על צבע
<ol><li>חזור על שלבים 1.1 ו-1.2 באמצעות המתח yAFM-RE (טבלה 1).</li>
	<li>יום לאחר מכן, לדלל את התרבות התא (1:10) ב 30-50 מ ל של טרום מחומם מראש ולהמשיך המאריטה ב 30 ° צ' על ידי טלטול עד OD600nm מגיע 0.8-1.0 (~ 2 h).</li>
	<li>חזור על שלבים 1.5-1.10.</li>
	<li>בצינור 1.5 mL נפרד, להוסיף 300-500 ng של שמרים P53 (או שליטה) הביטוי וקטור (שולחן 4), 5 μl של המוביל הזרע סלמון מבושלים ה-DNA, 300 μl של הבולם הסטרילי של LiAcTE, ו50 μl של השעיית תא שמרים.</li>
	<li>חזור על שלבים 1.12 ו 1.13 אבל להשעות מחדש את הגלולה התא ב 300 μL של מים סטריליים.</li>
	<li>התפשטות 100 μL של השעיית התא על סלקטיבי סינתטי (עבור P53 ביטוי או שליטה וקטור) לוחות המכילים דקסטרוז כמקור פחמן כמות גבוהה של אדנין (שולחן 2), ואז דגירה (הפוך) ב 30 ° c עבור 2-3 ימים.</li>
	<li>מושבות שמרים בעלי פס יחיד (2-6 פסים לצלחת) על צלחת סלקטיבית חדשה ולתת להם לצמוח לילה ב 30 ° c.</li>
	<li>ביום שלאחר מכן, באמצעות צלחת העתק סטרילי ולוטרינרים על לוחות סלקטיבי חדשים המאפשרים הערכה של הצבע פנוטיפ (כלומר, צלחות המכילות דקסטרוז as מקור פחמן, אך הגבלת כמות של אדנין; טבלה 2). הפוך את הצלחות ב 30 ° c עבור 3 ימים. באופן אופציונלי, כדי להעריך את רגישות הטמפרטורה של חלבון P53, דגירה בשלוש טמפרטורות שונות עבור 3 ימים: 24 ° צ', 30 ° c, ו 37 ° c. הערה: הרצף יכול להיות בציפוי משוכפל פעמים רבות.</li>
	<li>כדי להעריך את יכולת ההפעלה P53 חלבון, לבדוק את הצבע מבוסס הפנוטיפ של מושבות שמרים ולהשוות את P53 החלבון ביחס P53 wild-סוג וריקים פנוטיפים וקטוריים.</li>
</ol>3. הערכה של היכולת להפעלת חלבון P53 באמצעות האור הכמותי מבוסס שיטת LUC1 שמרים
<ol><li>שינוי צורה של תאים שמרים עם P53 (או בקרה) וקטורי ביטוי (טבלה 4) תוך שימוש בשיטה המבוססת על liac המתוארת בפרוטוקול 2. השתמש במתח של yLFM-RE (טבלה 1).</li>
	<li>תיקון transformants יחיד על צלחת סלקטיבית חדשה עם כמות גבוהה של אדנומין המכיל גלוקוז כמו מקור הפחמן ולתת להם לגדול ב 30 ° c לילה. עבור כל סוג שינוי, לעשות 5-7 טלאים שונים.</li>
	<li>לאחר הצמיחה לילה, להשעות כמות קטנה של תאים שמרים באמצעות קיסם סטרילי או פיילט עצה מן הצלחת ב בינונית סלקטיבית סינתטי המכיל דקסטרוז או רפפינז כמו מקור הפחמן (200 μL הסופי של שקוף 96 טוב צלחת, עם סיבוב או בתחתית שטוחה). אם הניסוי דורש inducible P53 ביטוי, להוסיף גלקטוז למדיום רפפינוז לווסת את רמת האינדוקציה (שולחן 2). הערה: השעיות התא הללו אמורות להיות בעלת OD600nm של כ-0.4 וללא יותר מ-1.</li>
	<li>מדוד את ספיגת כל טוב ב OD600nm לאחר inducible P53 ביטוי (4-8 h ב 30 ° צ' עם 150-200 rpm רועד) באמצעות קורא לוחית multilabel. ודא שהשעיות התאים הן הומוגניות על-ידי ערבוב כל היטב באמצעות פיפטה רב-ערוצית.</li>
	<li>העבר 10-20 μL של השעיית התא מתוך שקוף 96 הצלחת הבאר לתוך 384 לבן (או 96) צלחת היטב לערבב עם נפח שווה (10-20 μL) של מאגר לפירוק. דגירה עבור 10-15 דקות ב RT על שייקר (150-200 rpm) כדי להשיג חדירות של התא למצע לוציפראז.</li>
	<li>הוסף 10-20 μL של גחלילית לוציפראז ולמדוד את יחידות האור (LU) על ידי קורא לוחית רב תוויות.</li>
	<li>כדי לקבוע את יכולת ההפעלה של חלבון P53, לנרמל את ה-LUs של כל הבאר ל-OD600nm (יחידת אור יחסית, rlu). חישוב ממוצע RLU וסטיית התקן מ-3-4 טלאים של מושבות שמרים.</li>
	<li>להשוות את נתוני הP53 החלבון ביחס P53 פראי סוג וקטור ריק, או על ידי חיסור הערכים שהתקבלו עם וקטור ריק או על ידי חלוקה לפי הערכים שהתקבלו עם וקטור ריק (כלומר, קיפול המחשוב של אינדוקציה). הערה: ניתן להעריך גם את פעילות P53 ההפעלה באמצעות הערכה ניסיונית זהה בנוכחות של חלבונים בעלי P53 אינטראקציה (כלומר, MDM2 ו-MDMX) ו/או כולל טיפול תרופתי.</li>
</ol>4. הערכה של עיכוב הצמיחה של חלבון P53 באמצעות השמרים פנומיטילי
<ol><li>שינוי צורה של תאים שמרים עם P53/MDM2/MDMX (או פקד) ביטוי וקטורים (טבלה 4) באמצעות השיטה המבוססת על liac המתוארת בסעיף 2. השתמש זן CG379 (טבלה 1) ולהפיץ transformants שמרים על לוחות סלקטיבי מינימלי (טבלה 2).</li>
	<li>לגדול תאים שהפכו בינוני סלקטיבי מינימלי (שולחן 2) כ 1 OD כ600nm.</li>
	<li>לדלל תאים שמרים כדי 0.05 OD600nm במדיום אינדוקציה סלקטיבית (שולחן 2), ובמידת הצורך, להוסיף מולקולה קטנה שנבחרה לריכוז המתאים (או ממס בלבד) כדי לבדוק את יעילותה בהפעלה מחדש של מוטציה P53 או מעכב MDM2- /MDMXT-P53 אינטראקציות.</li>
	<li>התאים מודדים ב 30 ° c תחת טלטול מסלולית רציפה (200 rpm) עבור כ 42 h (הזמן הנדרש על ידי שמרים בקרה שלילית להגיע באמצע יומן השלב, על 0.45 OD600nm).</li>
	<li>ספוט 100 μL של תרביות תאים שמרים על לוחות סלקטיביים מינימליים (שולחן 2).</li>
	<li>מודטה למשך יומיים ב -30 ° c.</li>
	<li>למדוד את הצמיחה שמרים על ידי ספירת מספר המושבות שהתקבלו 100 μL התרבות טיפות (המושבה ויוצרים יחידה, ספירת CFU). לדוגמה, לחשב את ההשפעה של מוטציה הפעלה מחדש של תרכובות בהתחשב הצמיחה של פראי-סוג P53 ביטוי שמרים כמו ההשפעה המקסימלית האפשרית (להגדיר כדי 100%), בעוד הצמיחה של תאים המבטא מוטציה P53 (אבל חשוף לבקרת ממס) מייצג רמת אפס של ההפעלה מראש.</li>
</ol>

המחברים לא מצהירים. על ניגוד אינטרסים

שמרים מבוססי בחני הוכיחו שימושי כדי לחקור היבטים שונים של פונקציות חלבון P53. בחני אלה רגישים במיוחד להערכת פוטנציאל ההפעלה הפעלת כלפי משתנים של אתרי יעד RE, כולל הערכה של פולימריות פונקציונלי. השימוש כתבים צבע, כמו גם המזעור של התוצאה לוציפראז תוצאות בעלות חסכונית ומדרגי יחסית. כמו כן, מבחן עיכוב הצמיחה היא פוטנציאלית לשימוש בהקרנה הספרייה הכימית, אוטומציה של הכדאיות של שמרים תאים באמצעות מדידה של ספיגת. בעוד חדירות מוגבלות בשל קיר התא ופעולה של מובילי ABC נחשב מגבלה באמצעות שמרים להקרנה סמים, שינויים גנטיים כדי לשפר את...

תמלול הוא תהליך מורכב מאוד הכרוך בפעילות דינמית, מרחבית וטמפורלית של גורמי שעתוק (TFs) וקופנים לגיוס ואפנון של RNA פולימות על אזורי כרומטין בתגובה לגירויים ספציפיים1 . רוב TFs, כולל מדכא הגידול האנושי P53, לזהות רכיבים ספציפיים משחק ציס בצורה של רצפי DNA הנקרא רכיבי תגובה (REs), אשר מורכב של יחיד (או מספר) מוטיבים ייחודיים ~ 6-10 נוקלאוטידים ארוך. בתוך מוטיבים אלה, עמדות בודדות עשויות להראות דרגות שונות של השונות2, מסוכמים בדרך כלל על ידי מטריצות משקל מיקום (pwm) או לוגו3,4.
שמרים S. cerevisiae ס היא מערכת המודל המתאים ללמוד היבטים שונים של חלבונים אנושיים דרך compleמנטציה, ביטוי חוץ רחמי, ומוסר פונקציונלי, גם כאשר גן שמרים אורתוולוגי אינו נוכח5, מיכל בן 6 , 7. בשל השימור האבולוציוני של רכיבי בסיס של מערכת הטרנססקריפט8, מספר רב של מערכות האדם (כאשר הביעו הבעה בתאי שמרים) יכולים לווסת את הביטוי של גן עיתונאי על ידי משחק באמצעות יזמים שעברו הנדסה ל הכיל REs מתאים. מערכת מודל התמלול המוצגת כאן עבור P53 אנושי מתאפיינת בשלושה משתנים מרכזיים שהאפקטים יכולים להיות מאופנן: 1) מודאליות של הביטוי והסוג של P53, 2) רצף RE השליטה P53 תלויי שעתוק, ו 3) סוג של גן עיתונאי (איור 1A).
בנוגע למודאליות של הביטוי P53, ס' cerevisiae ס מאפשר בחירה של inducible, מחדש, או קונסטיטוטיביות9,10,11. בפרט, inducible GAL1 יזם מאפשר בסיס (באמצעות רפפינז כמקור פחמן) או משתנה (על ידי שינוי כמות של גלקטוז במדיה) ביטוי של TF ב שמרים. למעשה, הביטוי tunable דק מייצג פיתוח קריטי ללמידה לא רק P53 עצמה אלא גם P53 משפחה אחרים חלבונים12,13.
בנוגע לסוג ה-REs השולט בביטוי התלוי בP53, ס' cerevisiae ס מאפשר בנייה של זנים כתבת שונים בעל הבדלים ייחודיים ב RE של עניין ברקע איזוגניים אחרת. מטרה זו היא להגיע באמצעות הסתגלות של גישה מגוונת במיוחד הגנום לעריכה שפותחה ב -S. cerevisiae ס, הנקרא delitto perfetto12,14,15,16.
יתר על כן, גנים עיתונאי שונים (כלומר, URA3, HIS3, ו- ADE2) ניתן להשתמש באיכות הפעולה והערכה כמותית של הפעילות של tfs האדם ב -S. cerevisiae ס, כל אחד עם תכונות ספציפיות שיכול ל להתאים לצרכים הניסיוניים17,18,19,20,21. הביטוי של הגנים האלה העיתונאי מדבר על ה, היסטידין, ובהתאמה. הכתב הURA3 אינו מאפשר את צמיחת התאים בנוכחות של 5 וכדומה, ולכן ניתן לבחור בו בצורה נגדית. מערכת ADE2 עיתונאי יש את היתרון כי, מלבד הבחירה התזונתית, זה מאפשר זיהוי של תאים שמרים לבטא פראי סוג (כלומר, פונקציונלי על ADE2 ביטוי) או מוטציה (כלומר,לא פונקציונלי על ADE2 ) P53 מצבע המושבה.
לדוגמה, תאים שמרים המבטאים את הגן ADE2 ליצור בגודל בדרך כלל מושבות לבנות על הצלחות המכילות כמויות מגבילות של אדנין (2.5-5.0 mg/L), בעוד אלה כי לא מתאים או לא לתעתזה מופיע על צלחת זהה אדום קטן (או ורוד) מושבות. הדבר נובע מהצטברות של ביניים במסלול הביוסינתטי של אדנין (כלומר, P-ריבוסידלסטינו-סראזול, שנקרא בעבר באופן כולל ובאוויר), המומר ליצירת פיגמנט אדום. הצבע האיכותני המבוססת על ADE2 הוא גן הכתבים מאז הוחלף על ידי הגחלילית הכמותית (LUC1)12,22. לאחרונה, העיתונאי ADE2 כבר בשילוב עם העיתונאי lacz ב קל לציון, חצי כמותי, שיטת עיתונאי כפול כי ניתן לנצל לסווג משנה P53 מוטציות לפי רמת השיורית של פונקציונליות . עשריםואחד
כתבים פלורסנט כגון egfp (חלבון פלורסנט ירוק משופר) או dsred (Discosoma sp. אדום חלבון הניאון) יש גם שימש הערכה כמותית של פעילות ההפעלה הקשורים לכל מוטציות ההיגיון האפשרי ב TP53 ברצף24. לבסוף, הסיכוי של שילוב היזמים tunable עבור ביטוי P53 אלל עם זנים שמרים איזוגניים שונים עבור RE ו/או הגן עיתונאי הובילו לפיתוח של מטריצת נתונים היוצרת סיווג מעודן של סרטן הקשורים ו germline . מוטציה P53 אלטלס25,26,27
הגישות המתוארות לעיל משמשות למדידת הפעילות הטרנסקריפטוניים של החלבון הP53. עם זאת, הביטוי של פראי מסוג P53 ב שמרים S. cerevisiae ס28 ו שיזוסכמיומיב פומל29 יכול לגרום לפיגור הצמיחה, אשר נקשר עם מעצר מחזור התא28,30 או . מוות תאים31 בשני המקרים, עיכוב הצמיחה שמרים מופעלת על ידי ביטוי P53 גבוהה, כבר מתואם עם אפנון פוטנציאל ההמרה של גנים שמרים אנדוגניים מעורב צמיחת תאים. תמיכה השערה זו, אובדן הפונקציה מוטציה P53 R273H לא להפריע צמיחת תאים שמרים כאשר מתבטאת ברמות דומות כמו פראי P5332. לעומת זאת, הביטוי בשמרים של המוטציות הרעילים P53 V122A (הידוע בפעילות הטרנססקריפט גבוהה יותר לעומת פראי-סוג P53) גרם לאפקט מעכבות גדילה חזק יותר מאשר פראי סוג P5332.
בנוסף, זה הוכיח כי האדם MDM2 היה מסוגל לעכב את הפעילות האנושית P53 הטרנס בשמרים, קידום אוביקווינציה שלה והשפלה הבאים33. בהתאם, היכולת של MDM2 אנושי ו mdmx לעכב את P53 המושרה עיכוב הצמיחה שמרים הפגינו32,34. במחקר נוסף, מתאם בין פעילות P53 טרנססקריפט ורמות ביטוי אקטין הוקמה, עם זיהוי של P53 RE במעלה הזרם על הגן ACT1 ב שמרים32. בעקביות, ביטוי אקטין היה משופר על ידי פראי P53 ואפילו יותר כך על ידי P53 V122A, אבל לא על ידי מוטציה P53 R273H. לעומת זאת, ביטוי אקטין ידי P53 ירד בנוכחות שיתוף של P53 מעכבי MDM2, mdmx, או pifithrin-α (מדכא קטן מולקולה של הפעילות P53 הטראנס), עקבי עם התוצאות המבוססות על שמרים-גידול שמרי. חשוב מכך, תוצאות אלה הקימו מתאם בין P53 המושרה עיכוב הצמיחה ומידת הפעילות שלה שמרים, אשר נוצל גם כדי לזהות וללמוד מולקולות קטנות מודלדירוג P53 פונקציות28,34 , 35.

<table><tbody><tr><td>L-חומצה אספרטית</td><td>SIGMA</td><td>11189</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR ערכת טיהור</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>L-פנילאלנין</td><td>SIGMA</td><td>78019</td><td></td></tr><tr><td>פפטון</td><td>BD בקטו</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>שמרים ex+A2:C26tract</td><td>BD Bacto</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Difco שמרים בסיס חנקן עם חומצות אמינו ואמוניום סולפט</td><td>BDTM</td><td>233520</td><td></td></tr><tr><td>ליתיום אצטט דיהידרט</td><td>SIGMA</td><td>517992</td><td></td></tr><tr><td>אגר בקטריולוגי סוג A</td><td>Biokar Diagnostics</td><td>A1010 HA</td><td></td></tr><tr><td>G418 מלח דיסולפט</td><td>SIGMA</td><td>A1720</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום גופרתי</td><td>SIGMA</td><td>A2939</td><td></td></tr><tr><td>L-ארגינין מונוהידרו-כלוריד</td><td>SIGMA</td><td>A5131</td><td></td></tr><tr><td>מלח אדנין המיסולפט</td><td>SIGMA</td><td>A9126</td><td></td></tr><tr><td>מאגר ליזה פסיבי 5x</td><td>PROMEGA</td><td>E1941</td><td></td></tr><tr><td>מערכת בדיקת לוציפראז Bright-Glo&nbsp;</td><td>PROMEGA</td><td>E2620</td><td></td></tr><tr><td>5-FOA</td><td>Zymo Research</td><td>F9001</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-גלקטוז</td><td>SIGMA</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>L-חומצה גלוטמית</td><td>SIGMA</td><td>G1251</td><td></td></tr><tr><td>דקסטרוז&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidine</td><td>SIGMA</td><td>H8125</td><td></td></tr><tr><td>L-איזולאוצין</td><td>SIGMA</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>L-ליזין</td><td>SIGMA</td><td>L1262</td><td></td></tr><tr><td>L-לאוצין</td><td>SIGMA</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>L-מתיונין</td><td>SIGMA</td><td>M2893</td><td></td></tr><tr><td>PEG</td><td>SIGMA</td><td>P3640</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-רפינוז פנטהידראט</td><td>SIGMA</td><td>R0250</td><td></td></tr><tr><td>L-סרין</td><td>SIGMA</td><td>S4500</td><td></td></tr><tr><td>L-טריפטופן</td><td>SIGMA</td><td>T0271</td><td></td></tr><tr><td>L-תראונין</td><td>SIGMA</td><td>T8625</td><td></td></tr><tr><td>אורסיל</td><td>SIGMA</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>L-ולין</td><td>SIGMA</td><td>V0500</td><td></td></tr></tbody></table>

שמרים כתושבת לפיתוח assays פונקציונלי ללמוד אנושי האדם

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

הממצא הידוע P53 חלבון מוכר יכול לשמש כגורם שעתוק (TF) ב -S. cerevisiae ס שמרים הורשו לפיתוח בחני פונקציונלי שונים ללמוד את ההשפעות של 1) מחייב האתר [i.e., אלמנט התגובה (RE)] משתני רצף על P53 הפעלה ספציפיות או 2) TP53 מוטציות, שיתוף מבוטא קופטים, או מולקולות קטנות על פעילות הפעלה P53. יישומי מחקר בסיסיים וטרנסלבותית שונים פותחו. הגישות הללו מנצלות שני יתרונות עיקריים של מודל השמרים. מצד אחד, הקלות של עריכת הגנום מאפשרת בנייה מהירה של מערכות עיתונאי איכותיות או כמותיים על ידי ניצול זנים איזוגניים הנבדלים רק ברמה של P53 מסוימים-RE כדי לחקור את הרצף-ספציפיות של P53 תלוי הפעלה מעבר. מצד שני, הזמינות של מערכות מוסדרים עבור ביטוי חוץ רחמי P53 מאפשר הערכה של הפעלה במגוון רחב של ביטוי חלבון. סקר בדוח זה משמשים באופן נרחב מערכות המבוססות על גנים עיתונאי צבע, לluciferase, ואת הצמיחה של שמרים כדי להמחיש את הצעדים מתודולוגיים העיקריים שלהם כדי להעריך באופן אנוש את כוח החיזוי שלהם. יתר על כן, רב-תכליתיות קיצונית של גישות אלה ניתן לנצל בקלות כדי ללמוד TFs שונים כולל P63 ו P73, שהם חברים אחרים של TP53 משפחת גנים.

בניית מ ADE2 או LUC1 כתבת זנים שמרים
הגישה הטיפולית12,14,15,16 כבר הותאם כדי לאפשר את הבנייה של P53 העיתונאי זנים שמרים (איור 1b). השיטה מעסיקה לפחות 30 נוקלאוטי...

הציגו כאן הם ארבעה פרוטוקולים כדי לבנות ולנצל שמרים סכביסים כתבת הכתב כדי לחקור את הפוטנציאל האנושי P53 transactivation הפעלה, השפעות של מוטציות הקשורות לסרטן השונים שלה, שיתוף הביע אינטראקציה חלבונים, ו ההשפעות של מולקולות קטנות ספציפיות.

שמרים כתושבת לפיתוח Assays פונקציונלי ללמוד אנושי האדם

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

שלום, שמי ברטולומו בוסקו, ואני דוקטורנט במעבדה לרשת שעתוקים במרכז לביולוגיה אינטגרטיבית של אוניברסיטת טרנטו באיטליה. כפי שאתם יודעים, שעתוק הוא תהליך מורכב ביותר המערב ארגון מרחבי ותת-זמני של גורם שעתוק וגורם קופקטור. רובם, כולל P53 האנושי, מזהים אלמנטים ספציפיים של cis-פעולה, הנקראים אלמנטים של תגובה, והכריכה על ריצוף DNA זה נדרשת לאפנן של שעתוק של גנים היעד.בעבודה זו, ברצוננו להראות לך את הפרוטוקול ללמוד רצף P53 ספציפי פונקציות transactivation באמצעות שמרים כמערכת מודל כמו חלבון בגן כתב צבע או luciferase או על כימות של צמיחת תאים כדי להדגיש את הצעדים הניסיוניים העיקריים ואת הרבגוניות של גישות אלה. פרוטוקול אחד, בנייה של זני שמרים כתב המכילים אלמנט תגובה P53 ספציפי במעלה הזרם של אדנין-2 או הגן לוציפראז גחלציים. כדי לבנות זן כתב, תחילה בצע את השלבים 1.1 עד 1.15 כדי להפוך תאי שמרים עם אוליגונוקלאוטידים מיקוד אזור האמרגן הרצוי.הטרנספורמציה מבוססת על הפרוטוקול הסטנדרטי המבוסס על ליתיום אצטט. לאחר טרנספורמנטים מופיעים על לוחות 5-FOA, בדרך כלל לאחר שלושה ימים של דגירה ב 30 מעלות, העתק צלחת אותם על לוחות YPDA לא סלקטיביים וגם על לוחות YPDA המכילים G418, סימון כל צלחת כדי להקל על ההשוואה הבאה שלהם. דגירה הצלחות לילה ב 30 מעלות.למחרת, לזהות את זני הכתב המועמדים מהמושבות כי הם G418 רגיש אבל גדל על לוחיות YPDA. פס המושבות שזוהו על צלחת YPDA חדשה כדי להשיג מבודד מושבה אחת, ולתת להם לגדול במשך יומיים ב 30 מעלות. בדוק את השילוב הנכון של רכיב התגובה הרצוי P53, ביצוע תגובת PCR עם תנאים שהוזכרו בשלב 1.20.לטעון aliquot של המוצר PCR על ג'ל אגרוז כדי לבדוק את אורך אמפולייקון הנכון לפני רצף סנגר. פרוטוקול שני, אנו מציגים דוגמה כיצד להעריך את יכולת ההמרה של חלבון P53 באמצעות מים איכותיים מבוססי צבע אדנין-2 שמרים. המר תאי שמרים עם וקטורים של ביטוי P53 בהתאם לאותו פרוטוקול מבוסס ליתיום אצטט המתואר בסעיף הראשון.פסים מושבות שנאי שמרים יחיד, עד שש לכל צלחת, על צלחת סלקטיבית חדשה, ולתת להם לגדול לילה ב 30 מעלות. יום לאחר מכן, באמצעות קטיפה סטרילית, העתק צלחת פסים על לוחות סלקטיביים חדשים המאפשרים הערכה של פנוטיפ צבע, כלומר לוחות סלקטיביים המכילים כמות מגבילה של אדנין.דגירה ב30 מעלות במשך שלושה ימים. ניתן לשכפל את אותם פסים מספר פעמים. פרוטוקול 3, אנו מציגים כעת דוגמה להערכת יכולת ההמרה של חלבון P53 באמצעות מוצג שמרי LUC1 המבוסס על אור כמותי.ראשית, לשנות את תאי שמרים עם וקטורים ביטוי P53 בעקבות, שוב, פרוטוקול מבוסס ליתיום אצטט המתואר בסעיף 2. תדבקו טרנספורמנטים בודדים על צלחות סלקטיביות חדשות המכילות גלוקוז כמקור פחמן, ותנו להם לגדול ב-30 מעלות במהלך הלילה. עבור כל סוג שינוי צורה, צור חמישה עד שבעה תיקונים שונים.לאחר הצמיחה בן הלילה, יש להשתמש מחדש בכמות קטנה של תאים באמצעות קיסם סטרילי או קצה פיפטה במדיום סלקטיבי סינתטי המכיל ראפינוז כמקור פחמן. מתלי תאים אלה צריכים להיות בעלי צפיפות אופטית של 600 ננומטר סביב 0.4 ו ניתן לפצל אותם לצלחות מרובות של 96 באר לדגירה בטמפרטורות שונות, טיפולים, או לחשוף תאים לכמות משתנה של גלקטוז כדי להפעיל ביטוי P53. כדי למדוד את פעילות כתב גחלילית, להעביר 10 עד 20 microliters של ההשעיה התא מן הלוח שקוף 96 באר לתוך צלחת לבן 384 באר, ומערבבים את התאים עם נפח שווה של מאגר תזה, דגירה במשך 10, 15 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר.הוסף 10, 20 מיקרוליטרים של מצע גחלילית לוציפראז. ולמדוד יחידות אור באמצעות קורא לוחות רב-שכבתי. למדוד גם את הצפיפות האופטית של התרבויות בצלחת 96 היטב.פרוטוקול ארבע, אנו מציגים כעת דוגמה כיצד לנצל את העיכוב של הצמיחה של שמרים המושרה על ידי P53. הפוך תאי שמרים עם וקטורים ביטוי P53, או cotransform אותם עם וקטורים ביטוי כדי לדכא את P53 יחד ואחד מקובקטורים שלה, כגון MDM2, הבא, שוב, פרוטוקול מבוסס ליתיום אצטט המתואר בסעיף אחד. הגדל תאים טרנספורמטיביים במדיום סלקטיבי לצפיפות אופטית אחת בקירוב.ולדלל אותם ל 0.05, ולהוסיף מולקולה שנבחרה לריכוז המתאים. דגירה תאים ב 30 מעלות על שייקר במשך 42 שעות. לאחר מכן, זרע 100 microliters של תרבות תאי שמרים בצלחות בינוניות סלקטיביות מינימליות.דגירה במשך יומיים ב30 מעלות. שילוב RE הנכון במקום קלטת ICORE ניתן לבדוק על ידי PCR המושבה, החל מכמות זעירה של תאים מן שיבוטים שמרים מועמדים באמצעות פריימרים המתוארים בטבלה שלוש כדי להגביר את לוקוס ממוקד. מוצרי PCR, להקה של כ 500 נוקלאוטידים, לאחר מכן ניתן לבדוק על ידי רצף סנגר כדי לאשר את הרצף של המיקום הגנומי ערוך לנוכחות של רצף אלמנט התגובה P53 הנכון.זן הכתב מוכן לשימוש בהסתה תפקודית. כדי להעריך את יכולת ההמרה של חלבון P53, בדוק את הצבע של מושבות שמרים. לדוגמה, אנו מציגים השוואה בין P53 מסוג פראי לבין המוטנטים R175H ו- R282W באמצעות שני כתבים שונים, P21-5-prime ו- PUMA, ושתי טמפרטורות שונות, 30 מעלות ו - 37 מעלות.מעניין, בעוד R175H הוא אלל P53 אובדן פונקציה, מושבות אדומות בכל התנאים, R282W מראה רגישות לטמפרטורה עם פעילות transactivation שיורית ב 30 מעלות, וכתוצאה מכך מושבות לבנות, אבל אובדן פעילות ב 37 מעלות, וכתוצאה מכך מושבות אדום או ורוד. ערכת נתונים מורחבת מוצגת איור 2 B.Wild-type P53 בארבעה אללים מוטנטים נבדקו לצורך ביצוע עסקאות באמצעות 10 זנים שונים של כתב רכיבי תגובה P53, שלוש טמפרטורות ורמות ביטוי מכוננות. התוצאות מסוכמות בקוד צבע שמזכיר את פנוטיפ הצבע של מושבת השמרים.אלל המוטנטים P53 K139E שומר על פעילות חלקית והוא רגיש לקור. לדוגמה, מושבות הן אדומות בזן הכתב GADD45 ב 24 ו 30 מעלות, אבל הם לבנים ב 37 מעלות. כאן, אנו מציגים דוגמה של תוצאות שהושגו עם שיטה זו, השוואת מפרט transactivation של שמרים P53 אדם C.elegans.התוצאות בגרף עמודות מבוטאות כיחידות אור יחסי ממוצעות עם שגיאת תקן של ארבעה שכפולים. חמישה רכיבי תגובה שונים של P53 הושוו. שלוש רמות שונות של ביטוי חלבון P53 נבדקו על ידי שינוי הריכוז של גלקטוז במדיום.שני אורתולוגי P53 מראים מפרטי טרנסאקטיביות שונים במידה ניכרת. הדבר בא לידי ביטוי בתוצאות עם רכיבי תגובה של ced13 ו- V1 בעלי אותו רצף, למעט נוכחות או היעדרות של רווח נוקלאוטיד 28. האדם P53 מציג ביצועים גבוהים בהרבה עם אתר כריכת V1, בעוד C.elegans P53 מראה את ההפך.התוצאות אינן תלויות ברמה של ביטוי P53 תחת האמרגן גלקטוז-בלתי ניתן לעיכול. למדוד את צמיחת שמרים על ידי ספירת מספר המושבות שהושגו 100 טיפות תרבות microliters. לחשב את ההשפעה הפעלה מחדש מוטנטים של תרכובות בהתחשב בצמיחה של P53 מסוג פראי להביע שמרים כמו ההשפעה המקסימלית האפשרית, להגדיר 100%בעוד הצמיחה של תאים המבטאים מוטציה P53 מייצגים אפס רמה של הפעלה מחדש.בדוגמה זו, Nutlin-3a מקל על עיכוב של P53 מסוג פראי שנגרם על ידי דיכוי חוץ של MDM2, בעוד PhiKan083 מחדש חלקית את המוטנט P53 Y220C. בשני המקרים, התוצאה היא הפחתה תלוית P53 של צמיחת שמרים. שמרים תאים בסיסיים הוכיחו שימושי לחקור ערכים, היבטים של פונקציות חלבון P53.הפרוטוקול המתואר בעבודה זו רגיש במיוחד להערכת פוטנציאל ההשתנות של מוטנט מסוג פראי או סרטן הקשור P53 לגרסאות של אתרי יעד. כמו כן, ניתן להשתמש בגישה כדי לזהות מולקולות קטנות המשפיעות על פונקציות P53 וללמוד אינטראקציה P53 עם קופקטור. השימוש של כתבי צבע, מזעור של luciferase, כמו גם את מבחן עיכוב הצמיחה לגרום בדיקות חסכוניות ומדרגיות פוטנציאל נוח הקרנת הספרייה הכימית.לבסוף, המערכת המתוארת בעבודה זו ניתן לאמץ בקלות עם המחקר של גורמי שעתוק ספציפיים לרצף אחרים.

yeast-as-a-chassis-for-developing-functional-assays-to-study-human-p53

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

מחקרים גנטיים שמרים יכול להיות מועסק לחקור את הפונקציות מולקולרית תאית של הגנים האנושיים במטבוליזם DNA התאי. מתוארות שיטות לאפיון הגנטי של...

מחקרים גנטיים של חלבונים תיקון דנ&quot;א אנושי באמצעות שמרים כמודל למערכת

כתב יד זה מתאר שלושה פרוטוקולים משלימים להערכת הרעילות של polyglutamine (polyQ)-הרחבה חלבונים...

מבחני גידול כדי להעריך את רעילות Polyglutamine על שמרים

מאמר זה מתמקד בזיהוי של מערכי נתונים אינטראקציה גבוה בין המארח בטוח וחלבוני הפתוגן באמצעות שילוב של שתי שיטות מאונך: שמרים שני היברידיים ואחרי assay אינטראקציה תפוקה גבוהה בתאי יונקים הנקרא HT-GPCA.

גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן

מודלים של חלבוני שמרים הם כלים רבי ערך להערכת הרעילות והצבירה של חלבונים המעורבים במחלה. כאן, אנו מציגים שיטות לסינון ספריות וריאנטים של Hsp104 עבור מדכאי רעילות. ניתן להתאים פרוטוקול זה כדי לסנן כל ספריית חלבונים לאיתור מדכאי רעילות של כל חלבון רעיל בשמרים.

בידוד דוגמניות Proteinopathy שמרי שימוש potentiated Hsp104 גרסאות

חלבונים מתקשרים זה עם זה ואינטראקציות אלה קובעות במידה רבה את תפקודיהם. ניתן לזהות שותפים לאינטראקציה עם חלבונים בתפוקה גבוהה in vivo באמצעות בדיקת כושר שמרים המבוססת על בדיקת השלמת שבר חלבון דיהידרופולאט רדוקטאז (DHFR-PCA).

הקרנת הגנום כל חלבונים אינטראקציה ידי חלבון-בר השלמה Assay (PCA) בתאים חיים

אנו מציגים כאן תיאור אחיד של טכניקות שיכולות לשמש לפיתוח, לשנות, לנהל, ולבדוק ביטוי חלבון Heterologous של boulardii Saccharomyces שמרים פרוביוטיים.

טרנספורמציה של שמרים פרוביוטיים ושחזור שלהם מרקמות העיכול החיסון בעקבות Gavage אוראלי עכברים

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה תפוקה גבוהה על המסך באופן פונקציונלי עבור חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס.

הקרנה תפוקה גבוהה של חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס

מאמר זה מציג שיטה מבוססת על הזיווג כדי להקל על הקרנת ביטוי ניצני שמרים באמצעות ספריה פלסמיד ערוכים.

ביטוי ההזדווגות מבוססי ספריית הקרנה שמרים

פרוטוקול זה מתווה נהלים ניסיוני לאפיון הגנום כולו לשינויים ברמות של היסטון post-translational שינויים (PTM) המתרחשים בהקשר ביטוי של חלבונים הקשורים ALS מחלת פרקינסון ב מודלים האפייה . לאחר ההפרדה מרחביות-דף, רמות PTM היסטון בודדים מזוהים עם נוגדנים ספציפיים שינוי באמצעות סופג המערבי.

אפיון שינויים Post-translational שינוי היסטון במודלים ניווניות Proteinopathy שמרים

מודל פיזיולוגי in vivo של α-סינוקלאין נדרש כדי לחקור ולהבין את הפתוגנזה של מחלת פרקינסון. אנו מתארים שיטה לניטור ציטוטוקסיות והיווצרות אגרגטים של α-סינוקלאין באמצעות מודל שמרים אנושי.

שיטה לחקר רעילות וצבירה של α-סינוקלאין באמצעות מודל שמרים אנושי

חקור פרוטוקולים לבניית זני שמרים מדווחים לחקר פוטנציאל השעתוק של P53 אנושי והשפעת מוטציות הקשורות לסרטן. השיטה מאפשרת להעריך פעילות חלבון ואינטראקציות עם קופקטורים ב-Saccharomyces cerevisiae.

שמרים כתושבת לפיתוח Assays פונקציונלי ללמוד אנושי האדם

גלה סרטונים נוספים