שיטת החלוקה של מיקרו-אלקטרודה להקלטת פוטנציאל ממברנה מעורק מוחי אמצעי של קאננולוב
July 2nd, 2019
המטרה העיקרית של מאמר זה היא לספק פרטים כיצד להקליט פוטנציאל ממברנה (Vm) מעורק המוח האמצעי באמצעות שיטת החלוקה של המיקרואלקטרודה. העורק האמצעי של המוח הבינוני הוא בינוני כדי לצבור טון מיוגני, והקיר כלי מופד באמצעות מיקרואלקטרודות עמידות גבוהה.
פרוטוקול זה יכול לשמש כדי למדוד את פוטנציאל הממברנה של כלי דם נורמליים וחלליים כדי להעריך סוכנים תרופתיים לווסת את פוטנציאל הממברנה, הטון כלי הדם, וזרימת הדם. פוטנציאל הממברנה שנוצר מטכניקה זו קרוב לטווח הפיזיולוגי שכן השרירים החלקים בכלי הדם בתוך כלי נמצאים בסנכרון. לפני תחילת ההליך, מניחים מגבר אלקטרומטר דיפרנציאלי דו-ערוצי קרוב לתא כלי השיט במיקום הרצוי.
השתמש בכבל BNC-BNC כדי לחבר את הפלט של ערוץ המגבר A או B לקלט הערוץ של הדיגיטייזר. הר את הגשוש במיקרומניפולטור, וסובב את המיקרומניפולטור לכיוון המיקרוסקופ והמיוגרף על שולחן ללא רטט. מניחים את הידיות והמתגים בחזית המגבר במיקומים המתאימים לניסוי, כמתואר במדריך.
לאחר מכן חבר את קרקע האמבטיה לקרקע המעגלית של המגבר עם אלקטרודה מתאימה, וודא שהכלוב מקורקע למארז המגבר. כדי להכין את microelectrodes זכוכית borosilicate, להשתמש מושך סטנדרטי כדי להשיג קצר, הדרגתי, שמונה עד 10 מילימטר להתחדד עם קוטר פחות ממיקרומטר אחד, לולאה פעמיים עבור התנגדויות גבוהות יותר וטיפים קטנים יותר. השתמש מזרק מיקרופייבר כדי למלא את microelectrode עם שלושה טוחנות אשלגן כלורי, לאט לסגת הבוכנה במהלך ההזרקה כדי לאפשר מקום לנוזל למלא ולמנוע היווצרות של בועות בתוך microelectrode.
מניחים את המיקרו-אלקטרוד הטעון במלואו על מחזיק המיקרו-אלקטרורוד, ודחפו בזהירות אך בחוזקה את שוק האלקטרודה לתוך המחזיק דרך החור המשועמם. הסר כל נוזל עודף עם רקמת מעבדה, וחבר את מכלול מחזיק האלקטרודה לבדיקה המגבר. לבצע בדיקת אלקטרודה כדי למדוד את עמידות האלקטרודה.
לאחר מכן פתח את תוכנת ההקלטה, הקצה שם לקובץ ושמור את הקובץ לניתוח עתידי. לאחר מכן, לשטוף את תא מיוגרף עם מים מזוקקים מספר פעמים לפני טעינת התא עם חמישה מיליליטר של תמיסת מלח פיזיולוגית נורמלית, או PSS. באמצעות מזרק 5 או 10 מיליליטר, למלא הן קנולה זכוכית צינורות המצורפת עם PSS נורמלי מסונן מבלי להציג את כל בועות אוויר, ולהשתמש מטסים קהה לעשות חצי קשר בשני תפרים ניילון monofilament 10-0.
לאחר מכן, באמצעות מעצורי ניתוח תחת מיקרוסקופ ניתוח, מניחים את קשרי התפר הסגורים חלקית על שתי הנולאס מעט הרחק מהטיפים. לבידוד עורק מוחי באמצע, השתמש במספריים ומדפים באביב כדי לזהות ול לנתח קטע לא משופץ של עורק המוח האמצעי, בקוטר פנימי של 100 עד 200 מיקרומטר, של מוח החולדה. השתמש מדפים עדין כדי לעלות על העורק המוחי האמצעי על cannulas זכוכית, ולהדק את התפרים כדי לאבטח את העורק אל cannula.
סגור את צינורית דיסטל כך שלא תהיה זרימה בתוך העורק, ולחבר את פיפטה הזרימה למאגר של PSS. דמיינו את עורק המוח האמצעי המעוות באמצעות מצלמת התקן מרוכב בטעינה המותקנת על מיקרוסקופ הפוך ותופת הדמיה. הגדר את האורך האקסיאלי של MCA לאורך משוער כך שהוא לא נראה נוקשה ולא רפוי.
לצייד את פתרון האמבטיה עם 95%חמצן ו 5% פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס. לטבול את הקרקע של המגבר ב PSS של ההייאוגרף. להאיר את תא כלי הקיבול, ולדמיין את קצה microelectrode בת פתרון האמבטיה דרך המיקרוסקופ.
באמצעות micromanipulator, להזיז את קצה microelectrode קרוב לקיר החיצוני של כלי הדם, ולהתחיל את ההקלטה. להזיז לאט את קצה microelectrode לכיוון כלי השיט, מכוון למרכז הספינה. כאשר הקצה מגיע בסמיכות לכלי השיט, לקדם את האלקטרודה קדימה בתנועה מהירה אחת כדי לשפד את קרום השריר.
לאחר חדירת הממברנה, ניתן לראות שינויים בפוטנציאל הממברנה. אל תיגע במיקרומניפולטור ברגע שהמברנה תשולף. לאחר שהשינויים הפוטנציאליים בממברנה נרשמו, השתמש בתפעלן כדי להסיר את המיקרו-אלקטרונירוד בתנועה מהירה אחת, והפסק את ההקלטה לפני שמירת קבצי הנתונים.
אימפלמנט נחשב מוצלח כאשר יש הסטה מהירה לערכים שליליים, פוטנציאל הממברנה יציב למשך 30 שניות לפחות, והמתח חוזר בפתאומיות לאפס מילי-וולט עם הסרת האלקטרודה. לאחר שידול מוצלח וייצוב פוטנציאלי קרום, תרופות מעניינות ניתן לחדור לתוך האמבטיה ושינויים בפוטנציאל הממברנה ניתן לתעד. בניסוי מייצג זה, תרכובת עם אשלגן כלורי depolarized את הממברנה על ידי כשישה מיליוולטים, בעוד תרכובת עם מפעיל תלוי סידן של מוליכות גדולה מופעל אשלגן ערוצי אשלגן היפרפולרתי את הממברנה על ידי כמעט ארבעה מילי-וולט.
הדבר החשוב ביותר שיש לזכור הוא למשוך מיקרואלקטרוניקרודים עמידים מאוד שיש להם קצר, הדרגתי להתחדד עם קוטר פחות ממיקרומטר אחד.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מאמר זה מפרט פרוטוקול להקלטת פוטנציאל קרום (V m) מתוך העורק המוחי האמצעי באמצעות שיטת תקיעת מיקרואלקטרודה. הטכניקה מאפשרת מדידת פוטנציאלי קרום הן בכלי דם תקינים והן בכלי דם חולים.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- אלקטרופיזיולוגיה
- ביולוגיה של כלי דם
- פרמקולוגיה
רקע
- העורק המוחי האמצעי הוא קריטי לזרימת הדם במוח.
- הבנת פוטנציאל הקרום חיונית להערכת טונוס כלי הדם.
- שיטה זו יכולה להעריך סוכנים פרמקולוגיים המשפיעים על זרימת הדם.
- פוטנציאלי קרום קרובים לטווחים פיזיולוגיים בשל סינציטיום השריר החלק של כלי הדם.
מטרת המחקר
- לספק פרוטוקול מפורט למדידת פוטנציאל קרום.
- להעריך את ההשפעות של סוכנים פרמקולוגיים על טונוס כלי הדם.
- לשפר את ההבנה של ויסות זרימת הדם בבריאות ובמחלה.
שיטות ששימשו
- שימוש במגבר אלקטרומטר דיפרנציאלי עם שני ערוצים.
- חיבור המגבר לממיר דיגיטלי באמצעות כבל BNC-BNC.
- הרכבת החוד במניפולטור מיקרו למיקום מדויק.
- כוונון הגדרות המגבר על פי המדריך הניסויי.
תוצאות עיקריות
- מדידה מוצלחת של פוטנציאל קרום בעורק המוחי האמצעי.
- הוכחת יישומיות הטכניקה הן על כלי דם תקינים והן על כלי דם חולים.
- אימות הרלוונטיות הפיזיולוגית של פוטנציאלי הקרום שהוקלטו.
- תובנות לגבי ויסות טונוס כלי הדם על ידי סוכנים פרמקולוגיים.
מסקנות
- שיטת תקיעת המיקרואלקטרודה יעילה לחקר פיזיולוגיה של כלי הדם.
- פרוטוקול זה יכול לסייע בהערכת סוכנים טיפוליים המכוונים לתנאים וסקולריים.
- מחקר נוסף יכול להרחיב את ההשלכות של פוטנציאל הקרום על בריאות כלי הדם.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Accurate measurement of vascular smooth muscle membrane potential enables mechanistic de-risking of ion channel modulators in preclinical cardiovascular and cerebrovascular programs. This method supports target validation by linking electrophysiological readouts to vascular tone and blood flow regulation, providing predictive confidence for lead optimization. It bridges discovery biology with translational assessment of pharmacological agents affecting cerebral perfusion.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses on ion channel and electrogenic pump function in vascular smooth muscle.
- Operational Value: Enables functional target validation by correlating membrane potential changes with vascular tone modulation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that depolarize or hyperpolarize membrane potential in resistance arteries.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems (cannulated middle cerebral artery) for compound screening with stable membrane potential baselines.
- Quantitative Output: Generates reproducible membrane potential measurements in millivolts, enabling dose-response analysis of pharmacological agents.
- Screening Reproducibility: Standardizes impalement technique across vessels to ensure consistent electrophysiological readouts for hit validation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to diseased vessel models to assess ion channel dysfunction in hypertension, stroke, or vascular inflammation.
- Translational Continuity: Connects electrophysiological mechanism to functional outcomes like cerebral blood flow regulation.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria based on membrane potential shifts induced by test compounds.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement to functional validation in resistance arteries, supporting lead identification and preclinical efficacy assessment.
- Discovery Biology: Tests mechanistic hypotheses about ion channel contribution to resting membrane potential in vascular smooth muscle.
- Screening: Delivers assay-ready preparations with stable impalement recordings for compound library screening.
- Analytics: Provides quantitative membrane potential readouts (mV) that enable comparison of compound effects on vascular excitability.
- Translational Research: Links electrophysiological modulation to downstream functional assays of vascular tone and perfusion.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiology platform for multiple vascular beds and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in vascular pharmacology by directly measuring electrophysiological consequences of target modulation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible membrane potential data across laboratories and vascular preparations.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying off-target electrophysiological effects early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of compounds with favorable vascular safety profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microelectrode preparation, vascular dissection, and electrophysiology recording.
- Depends on low-noise electrometers, digitizers, micromanipulators, and vibration-free imaging setups.
- Necessitates standardization of impalement success criteria (e.g., 30-second stability, return to zero) across users.
- Adaptation to other resistance arteries (e.g., mesenteric, coronary) may require vessel-specific cannulation and tone equilibration.
- Limited by technical success rate of impalement and susceptibility to movement artifacts during recording.
