תצפית בזמן אמת של התגובה Exchange גדיל DNA מתווכת על-ידי Rad51
13 בפברואר 2019
קרינה פלואורסצנטית תהודה אנרגיה המבוסס על העברת בזמן אמת התבוננות במערכות ה-dna לנטישה של exchange התגובה מתווכת על-ידי Rad51 פותחו. באמצעות פרוטוקולים המובאת כאן, אנחנו מסוגלים לזהות את היווצרות התגובה intermediates, המרה שלהם לתוך מוצרים, במהלך ניתוח גם את קינטיקה אנזימטי של התגובה.
שיטה זו יכולה לעזור לפענח את השלבים בחילופי גדילי DNA וחושפת את תפקידי המולקולה של חלבונים שונים המעורבים בשילוב במהלך התיקון. בעזרת טכניקה זו אנו יכולים לפקח על חילופי גדילי DNA בזמן אמת ללא כל הפרעה לתגובה ולהשתמש באולם הניתוח כדי לקבוע את הקינטיקה של כל שלב תגובה. עם כמה התאמות קלות, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד את הפעילויות של חלבונים רקומבנציה מטוהרים שמקורם מינים אחרים, כגון יונקים וצמחים.
הדגמת ההליך תהיה קנטארו איטו, פוסט דוק מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, הכן את מאגר התגובה A בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, להוסיף 36 ננומול 16FA-oligonucleotide למאגר עבור בדיקת זיווג DNA.
הדגירה את התערובת ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. מוסיפים חלבון RAD-51 בריכוז סופי של 1.5 מיקרו שומות לתערובת ומאדרים אותו ב-37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. מוסיפים חלבון SWI5-SFR1 בריכוז סופי של 0.15 מיקרו שומות לתערובת, ומדגרים אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות נוספות.
מעבירים 1.5 מיליליטר של התערובת ב 1.0 על ידי 1.0 cuvette קוורץ המכיל ערבוב מגנטי. מכניסים את ה cuvette לתוך ספקטרופלואורומטר ולהמשיך להתאים את בקר הטמפרטורה ואת stirrer מגנטי. רשום את השינוי ב פליטת פלואורסצנטיות FAM ב 525 ננומטר עם העירור ב 493 ננומטר במרווחים של שנייה אחת במשך 100 שניות.
לבסוף, עם מזרק, להזריק ROX שכותרתו דנ"א כפול תקוע בריכוז הסופי של 36 ננו שומות לתוך cuvette. רשום את השינוי ב פליטת פלואורסצנטיות במרווחים של שנייה אחת במשך 30 דקות. כדי להשוות את ספקטרום הפלואורסצנטיות בין המצעים לבין המוצרים הסופיים, הכנס כל קובט המכיל את 16 ה- FA-oligonucleotides עם או בלי RAD-51 לספקטרופלואורומטר ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
לאחר מכן, להקליט את פליטת פלואורסצנטיות FAM ב 500 כדי 600 ננו מטרים על העירור ב 493 ננומטר. כדי לבדוק את ההשפעה של RAD-51 על ספקטרום הפלואורסצנטיות, להוסיף RAD-51 בריכוז סופי של 1.5 שומות מיקרו. ו דגירה את התערובת ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
לבסוף, להקליט את ספקטרום פלואורסצנטי מ 500 כדי 600 ננומטר על העירור ב 493 ננומטר. היעילות המרבית של FRET מתקבלת על ידי מדידת הירידה המרבית בעוצמת הפלואורסצנטיות כאשר כל מצע הדנ"א החד-גדילי מומר לדנ"א דו-גדילי בבדיקת הזוגות. או על ידי מדידת העלייה המרבית בעוצמה כאשר כל מצע הדנ"א הדו-גדילי מומר לדנ"א חד-גדילי בבדיקת התזוזה.
בשני המקרים, תוספת של חלבון RAD-51 לא השפיעה על פליטת פלואורסצנטיות של FAM, או על יעילותה המהבהב על ידי סלעים. ההשפעות של התגובות הספונטניות בין DNAs מצע הלבנת התמונה הבאים הם קטנים. כפי שמוצג על ידי השינויים הזניפים בהפחתת FAM ללא RAD-51, בהשוואה לשינויים המהותיים שנראו עם RAD-51.
הוספת קומפלקס SWI5-SFR1 מעוררת מאוד את פעילות השיוך של RAD-51. תגובת הזוג מדומה באמצעות מודל תלת-שלבי, המורכב מהיווצרות הביניים הראשון בעל שלושת הגדילים, מעבר לתוך הביניים השני ושחרור הדנ"א החד-גדילי והיווצרות הדופלקס ההטרו. השוואה בין מודל שלושת השלבים למודל דו-שלבי מצביעה על כך שמודל שלושת השלבים מתאים יותר להדמיית זיווג דנ"א, ללא או עם קומפלקס SWI5-SFR1.
קבוע שיווי המשקל המחושב של כל שלב תגובה, עם או בלי SWI5-SFR1, מראה כי קומפלקס SWI5-SFR1 אינו מגרה את היווצרות הביניים הראשון בעל שלושת הגדילים, אך מגרה מאוד את המעבר בין שני מתווכים בעלי שלושה גדילים, ואת שחרורו של דנ"א SS. זה חיוני כדי לוודא כי כל אצווה של חלבון מטוהר הוא ללא גרעין וזיהום הליקלאז.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה לצפייה בזמן אמת בתגובות של חילופי גדילי DNA המתווכות על ידי Rad51, תוך שימוש בהעברה של אנרגיית רזוננס פלואורסצנטית (FRET). הטכניקה מאפשרת זיהוי של תוצרי ביניים של התגובה וניתוח של קינטיקה אנזימטית מבלי להפריע לתגובה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביוכימיה
- ביולוגיה מולקולרית
- גנטיקה
רקע
- חילוף גדילי DNA הוא תהליך מכריע בתיקון DNA.
- Rad51 ממלא תפקיד משמעותי ברקומינציה הומולוגית.
- הבנת הקינטיקה של תגובה זו יכולה לספק תובנות לגבי מנגנוני תיקון DNA.
- טכניקות של ניטור בזמן אמת משפרות את חקר התהליכים הביוכימיים המורכבים הללו.
מטרת המחקר
- פיתוח מערכת לצפייה בחילוף גדילי DNA בזמן אמת.
- ניתוח תפקידיהם של חלבונים שונים בתגובה.
- קביעת הקינטיקה של כל שלב בתהליך חילוף גדילי ה-DNA.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת באפר תגובה ואוליגנוקלאוטידים עבור בדיקות צימוד DNA.
- אינקובציה של חלבוני RAD-51 ו-SWI5-SFR1 עם סובסטרטים של DNA.
- שימוש בספקטרופלואורומטר למעקב אחר שינויים בפלואורסצנציה.
- ניתוח תוצרי הביניים ותוצרי התגובה באמצעות מדידות פליטת פלואורסצנציה.
תוצאות עיקריות
- הוספה של SWI5-SFR1 מעוררת באופן משמעותי את פעילות ההזדווגות של RAD-51.
- מודל תלת-שלבי מתאים טוב יותר לסימולציית הזדווגות ה-DNA בהשוואה למודל דו-שלבי.
- המחקר מספק נתונים כמותיים על קינטיקה של חילופי גדילי DNA.
- מדידות פלואורסצנציה העידו על השפעות מינימליות מתגובות ספונטניות.
מסקנות
- השיטה שפותחה מאפשרת ניתוח קינטי מפורט של חלפת גדילי DNA.
- SWI5-SFR1 משפר את היעילות של RAD-51 בצימוד DNA.
- ניתן להתאים טכניקה זו לחקר חלבוני רקומבינציה ממינים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
תצפית בזמן אמת על חילוף גדילי DNA המתווך על ידי Rad51 מספקת מסגרת כמותית להערכת תפקוד של חלבוני רקומבינציה, ובכך תומכת בתיקוף של מטרות במסלולי תיקון DNA. בדיקה מבוססת FRET מאפשרת הפחתת סיכונים קינטית עבור היפותזות מכניסטיות באמצעות זיהוי תוצרי ביניים חולפים, ובכך מסייעת בזיהוי של מולקולות מובילות (leads) למודולטורים של רקומבינציה הומולוגית. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי קישור פעילות החלבון לתוצאות תפקודיות של תיקון DNA.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של חילופי גדילים המתווכים על ידי Rad51 כדי לתקף מטרות טיפוליות במסלולי תיקון DNA.
- ערך תפעולי: מפענח את ההיווצרות והבשלות של תוואיי ביניים של DNA בעלי שלושה גדילים, ובכך מבהיר את מנגנון הפעולה של חלבוני עזר כגון Swi5-Sfr1.
- ערך ניבוי: תומך במודל קינטי בעל שלושה שלבים המשפר את רמת הביטחון בניבויים של מעורבות המטרה (target engagement) ומודולציה של המסלול.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר קריאות פלואורסצנציה כמותיות למדידת קינטיקה של החלפת גדילים תחת תנאי חלבון משתנים.
- ערך תפעולי: מקים פורמט בדיקה הומוגני מבוסס-תמיסה התואם לגילוי ספקטרופלואורומטרי לסריקת תרכובות.
- מוכנות הבדיקה: מאפשר ניטור בזמן אמת ללא הפרעה לתגובה, ובכך תומך בניתוחי תגובה למינון וניתוחי מהלך זמן לצורך תיקוף פגיעות (hits).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך תרגומי: מקל על השוואה בין מינים שונים של פעילות חלבוני רקומבינציה, ובכך תומך בהסקת מסקנות ממערכות מודל להומולוגים אנושיים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבחין בין השפעות של חלבוני עזר על שלבי תגובה ספציפיים, ובכך מפחית עמימות ביישור סממנים ביולוגיים (biomarkers) המבוססים על מנגנון.
- המשכיות פרה-קלינית: מספק שיטה סטנדרטית להערכת השימור התפקודי של רגולטורי Rad51 בין מינים שונים, ובכך מסייע בבחירת מטרות טיפוליות.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לאופטימיזציה של המולקולה המובילה, כאשר אפיון קינטי של חלבוני תיקון DNA מספק מידע לקבלת החלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) לפני השקעה בשלב הפרה-קליני.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי כימות האופן שבו Swi5-Sfr1 מעורר הבשלה של ביניים ושחרור ssDNA בחילוף גדילים המתווך על ידי Rad51.
- סינון: מספק אותי FRET הדירים בזמן אמת, המאפשרים השוואה של השפעות מעכבים או מפעילים על קינטיקת התגובה.
- אנליטיקה: מספק קבועים של קצבי תגובה וקבועי שיווי משקל ברזולוציית שלבים, המאפשרים השוואה כמותית של ווריאנטים של חלבונים או תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מאפשר הערכה של שימור אבולוציוני על ידי יישום הבדיקה על חלבוני רקומבינציה מיונקים ומצמחים.
- שימוש חוזר ארגוני: מכונן פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לאפיון פעילות רקומבינאז, ובכך מפחית פיתוח כפול של בדיקות בין פרויקטים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי זיהוי תוצרי ביניים חולפים והגדרת שלבים המגבילים את קצב התגובה.
- ערך תפעולי: מספק נתונים קינטיים סטנדרטיים הניתנים לשחזור באמצעות ניטור פלואורסצנציה בזמן אמת בפורמט מבוסס קובטה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) באמצעות כימות האופן שבו חלבוני עזר מווסתים שלבים ספציפיים של חילוף גדילים, ובכך מפחית את אי-הוודאות המכניסטית.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תיעדוף של מטרות לתיקון DNA המותאם לסיכונים, בהתבסס על פרופילים קינטיים כמותיים ונתוני שימור אבולוציוני.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיהור חלבונים, ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית וניתוח נתונים קינטיים.
- תלוי בגישה לספקטרופלואורומטר בעל בקרת טמפרטורה, ערבול מגנטי ויכולת הזרקה באמצעות מזרק.
- מחייב הכנה סטנדרטית של החלבון כדי להוציא מזהמים של נוקלאז והליקאז שעלולים להטעות את פרשנות התגובה.
- דורש אופטימיזציה של סימון ריכוז האוליגונוקלאוטידים עבור כל מין מטרה על מנת להבטיח אותי FRET ניתנים לזיהוי.
- מוגבל למערכות in vitro; אינו לוכד השפעות של כרומטין או הקשר גרעיני הקיימות in vivo.
