Name: פרוביוטיקה מחקרים בעכברים Neonatal באמצעות Gavage (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: למדו את פרוטוקול ההזנה בגאבג' לתינוקות עכברים לחקר מיקרוביום המעיים. שיטה זו מאפשרת מתן פרוביוטיקה מדויק ואיסוף דגימות סטריליות לניתוח השפעות החיידקים על התפתחות המערכת החיסונית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תודה לצוות יחידת הטיפול חיה ו הוטרינרים UBC עבור הדרכה ועזרה העכבר עובד במכון מחקר לפנה ס לילדים החולים. הודות אוניברסיטת בריטיש קולומביה במחלקה לרפואה ניסויית למימון המחקר.

<ol><li>Reid, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotics+and+prebiotics+%E2%80%93+Progress+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22International+Dairy+Journal%22%5BJournal%5D)">Probiotics and prebiotics – Progress and challenges.</a> International Dairy Journal. 18 (10-11), 969-975 (2008).</li>
<li>Lin, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+probiotics+reduce+the+incidence+and+severity+of+necrotizing+enterocolitis+in+very+low+birth+weight+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Oral probiotics reduce the incidence and severity of necrotizing enterocolitis in very low birth weight infants.</a> Pediatrics. 115 (1), 1-4 (2005).</li>
<li>Panigrahi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+randomized+synbiotic+trial+to+prevent+sepsis+among+infants+in+rural+India%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A randomized synbiotic trial to prevent sepsis among infants in rural India.</a> Nature. 548 (7668), 407-412 (2017).</li>
<li>Amenyogbe, N., Kollmann, T. R., Ben-Othman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early-Life+Host%E2%80%93Microbiome+Interphase%3A+The+Key+Frontier+for+Immune+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Early-Life Host–Microbiome Interphase: The Key Frontier for Immune Development.</a> Frontiers in Pediatrics. 5, 111(2017).</li>
<li>Ofek Shlomai, N., Deshpande, G., Rao, S., Patole, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotics+for+Preterm+Neonates%3A+What+Will+It+Take+to+Change+Clinical+Practice%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neonatology%22%5BJournal%5D)">Probiotics for Preterm Neonates: What Will It Take to Change Clinical Practice?</a> Neonatology. 105 (1), 64-70 (2014).</li>
<li>Elazab, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+administration+in+early+life%2C+atopy%2C+and+asthma%3A+a+meta-analysis+of+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Probiotic administration in early life, atopy, and asthma: a meta-analysis of clinical trials.</a> Pediatrics. 132 (3), e666-e676 (2013).</li>
<li>Arrieta, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+infancy+microbial+and+metabolic+alterations+affect+risk+of+childhood+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Early infancy microbial and metabolic alterations affect risk of childhood asthma.</a> Science Translational Medicine. 7 (307), 307ra152(2015).</li>
<li>Arrieta, M. C., Walter, J., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Microbiota-Associated+Mice%3A+A+Model+with+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Human Microbiota-Associated Mice: A Model with Challenges.</a> Cell Host and Microbe. 19 (5), 575-578 (2016).</li>
<li>Qi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effect+of+BCG+vaccination+and+enriched+environment+promote+neurogenesis+and+spatial+cognition+via+a+shift+in+meningeal+macrophage+M2+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Combined effect of BCG vaccination and enriched environment promote neurogenesis and spatial cognition via a shift in meningeal macrophage M2 polarization.</a> Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 32(2017).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+BCG+vaccination+of+mice+improves+neurogenesis+and+behavior+in+early+life%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Neonatal BCG vaccination of mice improves neurogenesis and behavior in early life.</a> Brain Research Bulletin. 120, 25-33 (2016).</li>
<li>Deshmukh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbiota+regulates+neutrophil+homeostasis+and+host+resistance+to+Escherichia+coli+K1+sepsis+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The microbiota regulates neutrophil homeostasis and host resistance to Escherichia coli K1 sepsis in neonatal mice.</a> Nature Medicine. 20 (5), 524-530 (2014).</li>
<li>Butchbach, M. E. R., Edwards, J. D., Schussler, K. R., Burghes, A. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+oral+delivery+of+drug+compounds+to+the+neonatal+SMNDelta7+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for oral delivery of drug compounds to the neonatal SMNDelta7 mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 161 (2), 285-290 (2007).</li>
<li>Hickey, L., Garland, S. M., Jacobs, S. E., O’Donnell, C. P. F., Tabrizi, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-colonization+of+infants+with+probiotic+organisms+in+a+neonatal+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hospital+Infection%22%5BJournal%5D)">Cross-colonization of infants with probiotic organisms in a neonatal unit.</a> Journal of Hospital Infection. 88 (4), 226-229 (2014).</li>
<li>Costeloe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+randomised+controlled+trial+of+the+probiotic+Bifidobacterium+breve+BBG-001+in+preterm+babies+to+prevent+sepsis%2C+necrotising+enterocolitis+and+death%3A+the+Probiotics+in+Preterm+infantS+%28PiPS%29+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Technology+Assessment%22%5BJournal%5D)">A randomised controlled trial of the probiotic Bifidobacterium breve BBG-001 in preterm babies to prevent sepsis, necrotising enterocolitis and death: the Probiotics in Preterm infantS (PiPS) trial.</a> Health Technology Assessment. 20 (66), 1-94 (2016).</li>
<li>Kitajima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+administration+of+Bifidobacterium+breve+to+preterm+infants%3A+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Disease+In+Childhood.+Fetal+and+Neonatal+Edition%22%5BJournal%5D)">Early administration of Bifidobacterium breve to preterm infants: randomised controlled trial.</a> Archives of Disease In Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 76 (2), F101-F107 (1997).</li>
<li>Millar, M. R., Bacon, C., Smith, S. L., Walker, V., Hall, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteral+feeding+of+premature+infants+with+Lactobacillus+GG%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Disease+In+Childhood%22%5BJournal%5D)">Enteral feeding of premature infants with Lactobacillus GG.</a> Archives of Disease In Childhood. 69 ((5 Spec No)), 483-487 (1993).</li>
<li>Preidis, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotics+stimulate+enterocyte+migration+and+microbial+diversity+in+the+neonatal+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Probiotics stimulate enterocyte migration and microbial diversity in the neonatal mouse intestine.</a> The FASEB Journal. 26 (5), 1960-1969 (2012).</li>
<li>Kirjavainen, P. V., El-Nezami, H. S., Salminen, S. J., Ahokas, J. T., Wright, P. F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+orally+administered+viable+probiotic+and+dairy+lactobacilli+on+mouse+lymphocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+%26+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The effect of orally administered viable probiotic and dairy lactobacilli on mouse lymphocyte proliferation.</a> FEMS Immunology & Medical Microbiology. 26 (2), 131-135 (1999).</li>
<li>Gill, H. S., Rutherfurd, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+and+dose%E2%80%93response+studies+on+the+effects+of+the+immunoenhancing+lactic+acid+bacterium+Lactobacillus+rhamnosus+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Viability and dose–response studies on the effects of the immunoenhancing lactic acid bacterium Lactobacillus rhamnosus in mice.</a> British Journal of Nutrition. 86 (2), 285-289 (2001).</li>
<li>Yu, Z., Morrison, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+extraction+of+PCR-quality+community+DNA+from+digesta+and+fecal+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Improved extraction of PCR-quality community DNA from digesta and fecal samples.</a> BioTechniques. 36 (5), 808-812 (2004).</li>
<li>Holland, J. L., Louie, L., Simor, A. E., Louie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+detection+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+directly+from+stools%3A+evaluation+of+commercial+extraction+methods+for+purifying+fecal+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">PCR detection of Escherichia coli O157:H7 directly from stools: evaluation of commercial extraction methods for purifying fecal DNA.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (11), 4108-4113 (2000).</li>
<li>Müller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+powerful+DNA+extraction+method+and+PCR+for+detection+of+microsporidia+in+clinical+stool+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">A powerful DNA extraction method and PCR for detection of microsporidia in clinical stool specimens.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 6 (2), 243-246 (1999).</li>
<li>Pitcher, D. G., Saunders, N. A., Owen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+extraction+of+bacterial+genomic+DNA+with+guanidium+thiocyanate%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate.</a> Letters in Applied Microbiology. 8 (4), 151-156 (1989).</li>
<li>Bollet, C., Gevaudan, M. J., de Lamballerie, X., Zandotti, C., de Micco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+isolation+of+chromosomal+DNA+from+gram+positive+or+acid-fast+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A simple method for the isolation of chromosomal DNA from gram positive or acid-fast bacteria.</a> Nucleic Acids Research. 19 (8), 1955(1991).</li>
<li>Thomas, C. M., Versalovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotics-host+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Probiotics-host communication.</a> Gut Microbes. 1 (3), 148-163 (2010).</li>
<li>Tancredi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+prevents+infections+in+newborns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Probiotic prevents infections in newborns.</a> Nature. 548 (7668), 404-405 (2017).</li>
<li>Bernardo, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+Probiotics+in+the+Prophylaxis+of+Necrotizing+Enterocolitis+in+Preterm+Neonates%3A+A+Systematic+Review+and+Meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Jornal+de+Pediatria%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of Probiotics in the Prophylaxis of Necrotizing Enterocolitis in Preterm Neonates: A Systematic Review and Meta-analysis.</a> Jornal de Pediatria. 89 (1), 18-24 (2013).</li>
<li>Aceti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotics+for+prevention+of+necrotizing+enterocolitis+in+preterm+infants%3A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Italian+Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Probiotics for prevention of necrotizing enterocolitis in preterm infants: systematic review and meta-analysis.</a> Italian Journal of Pediatrics. 41 (1), 89(2015).</li>
</ol>

אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

ההליך של IE gavage פותחה בבטחה לתת מינון מסוים של פרוביוטיקה עכברים neonatal. כמויות קטנות של נוזל מועברות של מערכת העיכול העליונה באמצעות מחט האכלה כדי למנוע שאיפה תוך הקפדה על המסירה של המינון ביטחון. המעיים של העכברים שנאספו לשם קולוניזציה ניתוח שני ורשום שישה ימים gavage. ההליך להפקת DNA שונה כדי להבטיח תשואה גבוהה של האורגניזם גראם חיוביים פרוביוטיקה. ניתוח qPCR של ה-DNA חילצה יומיים פוסט האחרון gavage הראה גבוהים יחסית התיישבות LP בעכברים gavaged בכל יומיים לעומת עכברים gavaged כל יום בין בארבי כוכ 2-8. היה שם גם ירידה בכמות LP במשך שישה ימים, מציג זה פרוביוטיקה להיות אורגניזם ארעי במעיים של העכבר. התוצאות של ניסויים אלה נקבעו תנאים לערוך מחקר עם הקפדה גבוהה בקבוצת גיל זו.
כדי לבחון את ההשפעות ארוכות הטווח של פרוביוטיקה בעכברים neonatal, זה היה מנוהל לעכברים neonatal 2 עוד לא יודעיםעליהם כלום; מועד התחלה דומה הצבע המשפט האנושי. האכלה הלוע התחתון של עכברים neonatal בעבר מתואר בספרות, בוצעה רק לאחר12,עוד לא יודעיםעליהם כלום 5-817 כאשר הסיכון של השאיפה הוא נמוך יותר בשל מכניקה הבליעה מפותח. עם זאת, האכלה הלוע התחתון אינה מתאימה עבור עכברים 2 עוד לא יודעיםעליהם כלום כפי שיעור גבוה יותר של שאיפה נצפו במחקר פיילוט (נתונים לא מוצג). הטבע צמיגה של פרוביוטיקה, פתרון prebiotic הוסיף את הסיכון של השאיפה. בעקבות ההליך gavaging ' ב- IE ' למזער את הסיכון של השאיפה בעכברים 2 עוד לא יודעיםעליהם כלום תוך אספקת לנפח הרצוי באופן ישיר מערכת העיכול העליונה. ההצלחה של הפרוצדורה אומתה תחילה באמצעות צבע מאכל חדורים פרוביוטיקה gavage. מאכל פועל כסמן הגלוי דרך העור של הכלבלב. אין השפעות שליליות נצפו עכברים gavaged עם צבע מאכל, מומלץ לאמת את ההליך gavaging באופן זה לפני התחלת ניסויים בקנה מידה גדול. פתרון מהיר gavage פוסט ראית רפלקס בקול מתנשף יכול לשמש גם מהווים אינדיקציה נוספת gavage מוצלח. ברגע העכבר מושם על השמיכה חימום פוסט-gavage, רפלקס בקול מתנשף יהיה להתפוגג ואתם עלייה בשכיחות נשימה יתקיימו בתוך 20 שניות. המשך רפלקס בקול מתנשף במשך יותר מ-30 שניות מציין gavage נכשל. Gavage מוצלחת תלויה גם המתאים החדרת המחט האכלה עם הנורה יושב מעל הפתח של הטבעת הלב של הקיבה. זה ניתן להקל על-ידי הבטחת כי הסימונים על המחט מדידת האורך בין הסרעפת קצה החוטם, לא לעבור החוטם של העכבר במהלך gavage. פעולה זו מקטינה את הסיכוי לפגיעה העכבר. התדירות של gavage יכול יש השפעה משמעותית על תוצאות הניסוי. Gavaging בתדירות גבוהה גם יכול ליצור יותר לחץ על הגורים והאם בשל ההפרעות מתמדת של הכלוב ואת הקן. ז gavage האופטימלי ביותר הוא כאשר gavages לפחות בתדירות גבוהה ומעל משך קצר יותר של זמן מבלי לאבד את האפקט הצפוי במערכת. כדי להבטיח את הבטיחות ואת עקרות של ההליך gavage את המחט חייב להיות מחוטא ע י כביסה ושימוש autoclaving שביניהם. כביסה בקפדנות על שימוש חיצוני קרצוף מבפנים על-ידי אילוץ מים דרך המחט באמצעות מזרק לפני autoclaving הכרחי כמו כל שאריות של חלקיקים יכול משובצים המחט במהלך autoclaving ואני יכול להתערב עם ההליך gavaging.
קולוניזציה LP גבוה יותר נצפתה ב הגורים היו gavaged כל יום בהשוואה הגורים gavaged כל יום. זה יכול להיות בגלל הלחץ מופחת על הגורים gavaged בכל יום נוספים ואפשרות של פרוביוטיקה מקבל חומרים מזינים יותר דרך החלב יחסית יותר על ידי הגורים. התלות במינון של פרוביוטיקה לטיפול נחקרה בעבר העכבר מודלים18,19 , ולכן חשוב הממשל של המינון הנכון. הפתרון פרוביוטיקה מוכן הוא מצופה לפני כל gavage כדי ספירה מדויקת של CFU מנוהל. אם האורגניזם פרוביוטיקה אנאירובית, חשוב לראות אם יש הבדל CFU כאשר תרבותי aerobically או anaerobically. מאחר LP אובליגטוריים עיצוב גבות, זה היה תרבותי באמצעות שתי השיטות, אין הבדל CFU נצפתה.
פוסט gavage מעיים LP עומס הניתוח בוצע באמצעות דגימות DNA qPCR, באיכות גבוהה. כדי לצמצם זיהום LP DNA בין הטיפול את קבוצות שליטה, שונה האכלה מחטים, ארונות אבטחה ציוד כירורגי שימשו כדי להבטיח דגימות באיכות הגבוהה ביותר. מדידת מדויק פרוביוטיקה במעי נדרש שיטת מיצוי DNA ממוטבת. השיטה היעילה ביותר להפקת DNA של צואה כרוך במספר חרוז להכות צעדים20,21,22. שיטה זו הייתה מאומצת על החילוץ של חיידקים במעיים באמצעות מכות חרוז והנצפית ייצוג מופחתת (< 10 עותקים2 התאושש) של LP ב הפקת דנ א כל המעי. כמו LP הוא אורגניזם גראם חיוביים עם כמות משמעותית של פפטידוגליקן בקיר התא, הפרוטוקול היה מותאם עם שלב ההמסה פפטידוגליקן באמצעות ליזוזים23,24 שנוספו למאגר פירוק אנזימטי. זה עלה הייצוג של LP במדגם מעיים אותו-גדול מכפולה. הטיפול ליזוזים מבטיח פירוק השכבה החיצונית בעוד החרוז להכות שלב מקלה את פירוק של האורגניזם. אופטימיזציה של כמות הרקמה, את סוג חרוז גארנט ואת משך הזמן של הפרעה באמצעות החרוזים הוא הכרחי עבור קבלת מוצרים DNA אופטימלית לערוך ניתוח ה-PCR.
ההשפעה החיובית של פרוביוטיקה מנוהל כמו טיפול מונע או טיפול ב neonates מראש טווח, המונח הוא שמעידים האחרונות מחקרים25,26,27,28. הקמת מודל ראוי העכבר neonatal פרוביוטיקה היא מוצדקת כדי לפרוק את ההשפעה המגנה של פרוביוטיקה. פרוטוקול זה שמפורטות כאן מייצג מדריך עבור חוקרים לא מוכר עם העכבר neonatal עבודה בעזרת פרוביוטיקה. על אף הבעיות עם מכרסמים microbiota תוך כדי לימוד מחלה ובריאות האדם, שיטה זו ניתן להרחיב את המחקר התמקד להבין את השינויים של microbiome עקב פרוביוטיקה. מודל זה מספק גם פלטפורמה ללמוד מארח-חיידק אינטראקציה, תגובות מערכת החיסון במהלך שלבים התפתחותיים שונים.

אצל תינוקות, שחשיפה מוקדמת פרוביוטיקה היה קשור עם אפקטים immunomodulatory שמוביל שכיחות מופחתת של מחלות כמו שדעתו enterocolitis, דלקת עור אטופית, אלח דם1,2,3, 4 , 5. עם זאת, המנגנון מאחורי תגובה immunomodulatory זו הוא מאתגר לחקור נתון המגבלה דגימה בניסויים בבני אדם הנולד (קרי, לקחת דם סדרתית, ביופסיות). מודלים neonatal העכבר יכול לעזור ללמוד מנגנון הפעולה המעורבים בוויסות המערכת החיסונית neonatal המשויך פרוביוטיקה לשימוש ושינויים microbiota מעיים. למרבה הצער, רוב הדגמים העכבר עבור מוצרי פרוביוטיקה התמקדו בעיקר על עכברים בוגרים; עם זאת, ההשפעה של פרוביוטיקה סביר להיות הגבוה ביותר בשלב מוקדם בחיים, מציע דגמים ספציפיים עבור קבוצת גיל זו תהיה שימושית3,6. בנוסף, העכבר neonatal מודלים מתאימים יותר ללמוד מחלות והתערבויות מיועדת עבור יישום בחיים מוקדם של תינוקות אנושיים הם צפויים לחקות באופן הדוק יותר בפיתוח מערכת החיסון ומערכת מיקרוביאלי7,8 9, ,10. המטרה הייתה לבחון במידה ואת דפוסי פרוביוטיקה מושבת עכברים neonatal עם דגש על האינטראקציה מכניסטית בין המארח לבין microbiome שלה. לא נמצאו מתאימים תיאורים של היילוד דגמים בספרות, ובכך צורך לפיתוח שיטה סטנדרטית ועמיד היה מיועד.
שיטות הוקמה מינהל אוראלי של תרכובות שונות לעכברים היילוד כוללות העברת אימהי של תרכובות הרצויה דרך חלב בטיפול מקור המים סכרים בהריון11 או באמצעות מחטים האכלה כדי להקל על הניהול של תרכובות הרצוי לתוך oropharynx12. שיטות אלה שימושיים עבור ניסויים שאין להן דרישות מינון מדויק, איפה הטיפול ברצון בליעתו על ידי העכבר הנמען. פרוביוטיקה ניתנת לעתים קרובות בשילוב עם prebiotic כגון galactooligosaccharide ו- fructooligosaccharide (פוס) המשמשים כמקור תזונה עבור חיידקים פרוביוטיים; תרכובות אלו מוספים להפוך את הפתרון צמיגה ומאתגר לנהל באמצעות למתודולוגיות הנ. להמציא שיטה לנהל כמויות מדויקות של פרוביוטיקה ו prebiotics עכברים היילוד מתחיל מוקדם היום הראשון של החיים (בארבי כוכ) שהיו נחוצות. פיתוח הטכניקה gavage, האפשרות של מושבת-התפשטות (כפי שנצפה במחקרים אחרים פרוביוטיקה בין הטיפול את בקרת נשק13,14,15,16) נבדקה שפע יחסי של להפקר plantarum לקטובצילוס (LP) במעיים של הגורים עם לוחות זמנים שונים gavage היה להעריך. הכנת פרוביוטיקה המשמשים את הניסויים כללה 109 המושבה יוצרי יחידות (CFU) לכל gavage של LP (בקרת האוויר-202195 זן), מעורבב עם פוס (prebiotic), מלטודקסטרין (excipient) כפי שמתואר הניסיון האנושי3האחרונים. המשלוח פרוביוטיקה הושג באמצעות IE gavage, התהליך זה מפורט להלן בפרוטוקול. לפרופיל קולוניזציה של פרוביוטיקה הוערך באמצעות הגברה בזמן אמת של DNA שחולצו מן המעיים שלם באמצעות תחל ספציפי LP.

<table><tbody><tr><td>מזרק טוברקולין 1 מ"ל עם קצה החלקה&nbsp;</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>1.2% טריטון X-100&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>2 מ"מ נתרן EDTA&nbsp; &nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>20 מ"מ Tris&middot; קל&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>15568025</td><td></td></tr><tr><td>5% דקסטרוז ו-0.9% תמיסת הזרקת NaCl</td><td>של בקסטר קורפ.</td><td>JB1064</td><td></td></tr><tr><td>Alphaimager</td><td>Alpha Innotech</td><td>N/A</td><td>מערכת הדמיית ג'ל</td></tr><tr><td>צנצנת אנאירובית</td><td>Millipore-Sigma</td><td>28029-1EA-F</td><td>2.5 ליטר</td></tr><tr><td>BD GasPak EZ שקיות מערכת מיכל אנאירובי</td><td>BD</td><td>260678</td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp; Difco Lactobacilli MRS Broth</td><td>BD</td><td>288130</td><td></td></tr><tr><td>Disruptor Genie</td><td>Scientific Industries Inc.</td><td>SI-D236</td><td></td></tr><tr><td>מחטי האכלה/גבאז' דרך הפה לעכברים וחולדות שזה עתה נולדו&nbsp;</td><td>קיידנס סיינס בע"מ</td><td>01-290-1</td><td>24 מד, אורך מחט 1 אינץ', קוטר כדורי 1.25 מ"מ</td></tr><tr><td>פרוקטו-אוליגוסכרידים</td><td>Millipore-Sigma</td><td>F8052</td><td>&nbsp; מעולש</td></tr><tr><td>צינורות חרוזי נופך 0.70 מ"מ&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>13123-50</td><td></td></tr><tr><td>iTaq אוניברסלי SYBR ירוק סופרמיקס</td><td>BioRad</td><td>172-5120</td><td></td></tr><tr><td>לקטובצילוס פלנטרום (Orla-Jensen) Bergey ואחרים&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>BAA-793</td><td>עבור עקומה סטנדרטית qPCR</td></tr><tr><td>חיידקים פרוביוטיים ליופיליזציה</td><td>N/</td><td>A N/A</td><td></td></tr><tr><td>ליזוזים</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89833</td><td></td></tr><tr><td>מלטודקסטרין</td><td>Millipore-Sigma</td><td>419672&nbsp;</td><td>שווה ערך לדקסטרוז 4.0-7.0</td></tr><tr><td>תא ג'ל Mini-Sub GT Cell</td><td>BioRad</td><td>1704406</td><td>Nanodrop</td></tr><tr><td>1000&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp ערכת דם ורקמות&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>51504</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus מערכת PCR בזמן אמת</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure dH2O</td><td>Invitrogen</td><td>10977023</td><td></td></tr></tbody></table>

פרוביוטיקה מחקרים בעכברים neonatal באמצעות gavage

Probiotic Studies in Neonatal Mice Using Gavage

מודלים העכבר למבוגרים היה בשימוש נרחב כדי להבין את המנגנון מאחורי התקדמות המחלה אצל בני אדם. תחולתה של מחקרים במודלים של העכבר למבוגרים מחלות neonatal הוא מוגבל. כדי להבין טוב יותר את התקדמות המחלה, המארח תגובות וההשפעה לטווח ארוך של התערבויות בתחום neonates, מודל העכבר neonatal סביר היא התאמה טובה יותר. השימוש העכבר neonatal מודלים דליל בחלקו ניתן לייחס את בעיות טכניות של עבודה עם חיות קטנות אלה. דגם העכבר neonatal פותחה כדי לקבוע את ההשפעות של פרוביוטיקה המינהל בחיים מוקדם, במיוחד להעריך את היכולת להקים מושבת העיכול העכבר היילוד. באופן ספציפי, כדי להעריך פרוביוטיקה קולוניזציה העכבר neonatal, לקטובצילוס plantarum (LP) נמסרה ישירות לתוך מערכת העיכול העכבר neonatal. לשם כך, LP היה מנוהל לעכברים מאכילים דרך הוושט-"אינטרה" gavage (IE). שיטה ישימה במיוחד פותחה כדי לתקנן את התהליך של IE gavage המאפשר ניהול מדויק של פרוביוטיקה במינונים תוך מזעור טראומה, היבט חשוב במיוחד בהתחשב השבריריות של עכברים היילוד. מגבלות של תהליך זה כולל אפשרויות של גירוי הוושט או נזק ואת השאיפה אם gavaged באופן שגוי. גישה זו מייצג שיפור על נוהלי הנוכחי כי IE gavage לתוך הוושט דיסטלי ומצמצמת את השאיפה. בעקבות gavage, לפרופיל קולוניזציה של פרוביוטיקה היה לעקוב אחריו באמצעות כמותיים תגובת שרשרת פולימראזית (qPCR) של ה-DNA שחולץ מעיים עם תחל ספציפי LP. הגדרות המלטה שונים וטכניקות ניהול כלוב שימשו כדי להעריך את פוטנציאל קולוניזציה הכפולה. הפרוטוקול מפרט המורכבות של IE העכבר neonatal gavage ו קולוניזציה עוקבות כימות עם LP.

הייחוד של שיטה זו נח שלה עיבוד של הטכניקה gavaging לגודל, חולשה של עכבר neonatal. בסעיף הקודם תיאר את השלבים חשוב בביצוע הליך gavage מוצלח עם העכבר 2 עוד לא יודעיםעליהם כלום. כדי ליצור מידה טובה כמת, עיקול רגיל נוצר באמצעות דנ א טהור LP עם משכפל טכני 3 (איור 2). העקומה הסטנדרטי מספק טווח דינמי של זיהוי ה-dna LP באמצעות תחל. הטווח הדינמי היה בין 7 ו- 28 מחזורים היכן טווח של 101 עד 107 עותקים של ה-DNA LP זוהה. מדרון יציב של העקומה סטנדרטי ייצג את היעילות ואת המדרגיות של התגובה.
ההליך של IE gavage שימש בעכברים בוגרים בקלות יחסית. עם זאת, מערכת העיכול העליונה של עכבר neonatal שביר, נדרש מכוילת תנועות של gavage מחט במהלך ההליך. Gavages חוזרות ונשנות יכול להגדיל את הסיכוי של גירוי הוושט-"אינטרה", פציעה, כשל או דחייה על ידי הסכר עקב הטיפול. לפיכך, נבדקו שני לוחות זמנים שונים gavaging, הקולוניזציה מעיים היה לכמת באמצעות ה-DNA של כל המעי homogenates. עכברים היו gavaged עוד לא יודעיםעליהם כלום 2 עד 8 עוד לא יודעיםעליהם כלום עם פרוביוטיקה מנוהל כל יום או כל יומיים (איור 3). כל מדגם הכיל שכפול טכני אחד והיה כל תנאי משכפל ביולוגית לפחות שני. הגורים gavaged כל יום עם מינונים 7 היה בסביבות 103 עותקים של LP ואילו הגורים gavaged בכל יומיים עם מינונים 4 היה בסביבות 105 עותקים. מרקם של תוצאות בין משכפל להוסיף אשראי הדיוק של טכניקה. היה יותר LP זוהה במעיים של הגורים gavaged בכל יומיים בהשוואה הגורים היו gavaged כל יום. כך, הניסויים הבאים היו להגדיר עם לוח זמנים gavage בכל יום כמו זה גם מפחית את הלחץ על הגורים.
חשוב להימנע אינטרה-המלטה פרוביוטיקה לחצות זיהום בעת עבודה עם פרוביוטיקה. Microbiome הארנבונים מאותה היה צפוי להיות דומה כפי שהם חולקים את אותה אמא ואת הסביבה הקינון. זה מוכיח בעיה ללימודי פרוביוטיקה אם התנאים טיפול ובקרה נכחו בתוך הפסולת אותו כמו האורגניזם פרוביוטיקה יש פוטנציאל להפוך לחלק microbiota ("קולוניזציה התפשטה '). כדי לקבוע אם פרוביוטיקה לזהם, לישוב הארנבונים מאותה לא מטופל, מחצית המליטה gavaged כמו לעיל, המעיים נאספו עבור qPCR. ניתוח מעיים qPCR של 10 בארבי כוכ עכברים הראו הגברה הצפוי של ה-DNA LP בעכברים gavaged אבל גם, במידה פחותה יותר, הארנבונים מאותה הלא-gavaged (איור 4). המעיים של העכברים בארבי כוכ אותו מהכלוב מטופל הראה ללא הגברה או הגברה מינימלית-מחזורים יותר מ 32. זה סיפק ראיות שיתוף קהילתי microbiome בתוך בהמלטה בכלוב. לפיכך, עבור ניסויים עם פרוביוטיקה להפרידם הקבוצות טיפול על ידי כלובי לפקד על השתנות דרך לחצות זיהום. השימוש של סכרים פוסטר יכול להיחשב אם ניסוי היא להקים בתוך סביבה המלטה, אבל בלבול אפקטים כמו טיפול מופחתת מהסכר פוסטר, דחייה צריך להיות מוערכים והותאמו במיוחד. כאשר עכברים gavaged עד 8 בארבי כוכ נותרו לא מטופל במשך שישה ימים, ה-DNA מעיים היה מנותח בגיל 14 עוד לא יודעיםעליהם כלום, נמצאו כ 10 עותקים של LP (איור 5). לפיכך, הקולוניזציה של LP נמצאה להיות ארעית, האוכלוסיה לזיהוי פחתה במשך הזמן.
<img alt="דיסקציה של דגימת מכרסמים במהלך מחקר אנטומי; החדרת מחט במערך המעבדה." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59074/59074fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> איור 1 . מדידת אורך בין הסרעפת (הקצה הנמוך של עצם החזה) את החוטם כדי להפוך ההכנסה המרבית סימון המחט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59074/59074fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="גרף עקומה סטנדרטי המציג מספר עותק DNA של LP לעומת ממוצע Ct; משמש לכיול ניתוח qPCR." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59074/59074fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> איור 2 . עיקול רגיל הוקמה באמצעות תחל LP ו- DNA LP בקרת האוויר. לדילול טורי של ה-DNA LP בקרת האוויר היה עשוי לקבוע את טווח לזיהוי דינמי עבור תחל השתמשו במחקר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59074/59074fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="עלילת הגברה של SYBR qPCR; ערכי Ct עבור מחזורים שונים; תוצאות ניתוח ביטוי גנים." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59074/59074fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> איור 3 . LP הגברה של DNA מעיים 10 בארבי כוכ הגורים טיפל בין 2 עוד לא יודעיםעליהם כלום עוד לא יודעיםעליהם כלום 8 gavages מתוזמנת כל יום (7 מנות), בכל יום אחר (4 מנות). Gavaging בכל יום אחר הראה LP מעיים גבוהה יותר בהשוואה gavaging כל יום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59074/59074fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="עלילת הגברה qPCR, שיטת SYBR; השוואה חזותית של ערכי Ct בין קבוצות ניסוי." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59074/59074fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> איור 4 . LP הגברה של DNA מעיים 10 בארבי כוכ הגורים עם 2 מטופלים ו- 2 לא מטופל בהמלטה 4 גורים. Gavage היה בין 2 עוד לא יודעיםעליהם כלום עוד לא יודעיםעליהם כלום 8 ב gavages מתוזמנת כל יום (7 מינונים). פרוביוטיקה שני מטופלים הגורים הצג הפרופיל ההגברה הצפויה. הגורים לא מטופלת להראות הגברה משתנה של LP המציין שיתוף קהילתי של האורגניזם פרוביוטיקה בתוך בהמלטה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59074/59074fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="תוצאות SYBR qPCR, ΔRn לעומת מחזור; כימות DNA; גרף עקומת הגברה; סף CT&gt;28." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59074/59074fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> איור 5 . LP הגברה של DNA מעיים בארבי כוכ 14 הגורים טיפל בין 2 עוד לא יודעיםעליהם כלום עוד לא יודעיםעליהם כלום 8 gavages מתוזמנת כל יום (7 מנות), בכל יום אחר (4 מנות). הטיפות עומס LP להלן מחזור 28 סיווג אנלוגיים של LP במשך 6 ימים פוסט האחרון gavage פרוביוטיקה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59074/59074fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>שלב</td>
			<td>טמפרטורה</td>
			<td>זמן</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>50 ° C</td>
			<td>2 דקות</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>95 ° C</td>
			<td>3 דקות</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>95 ° C</td>
			<td>30 שניות</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>58 ° C</td>
			<td>30 שניות</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>72 ° C</td>
			<td>30 שניות</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1. תנאים הגברה qPCR. טמפרטורה, מספר תנאים מחזור התגובה ה-PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>היעד</td>
			<td>אזור מרווח intergenic 16-23S</td>
		</tr>
<tr>
<td>גודל המקטע הצפוי</td>
			<td>144 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>פריימר Tm</td>
			<td>58˚C</td>
		</tr>
<tr>
<td>פריימר לפנים (FP)</td>
			<td>מעשי-1: TGG ATC ACC TCC TTT CTA AGG AAT</td>
		</tr>
<tr>
<td>פריימר הפוכה (RP)</td>
			<td>מעשי-2: חתול CGG TTT TGT TCT תאת גה AAA אתא</td>
		</tr>
</tbody></table>בטבלה 2. הפרטים של רכיבי התגובה qPCR. הפרטים על תחל שלהם טמפרטורה מחזק וגודל פרגמנט הצפוי בעקבות תגובות PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>ריכוז</td>
			<td>תגובה 10 µL</td>
			<td>התגובה 20 µL</td>
		</tr>
<tr>
<td>תבנית ה-DNA</td>
			<td>עמוד 200/µL</td>
			<td>1 ΜL</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>מיקס מאסטר SYBR</td>
			<td>-</td>
			<td>5 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>FP</td>
			<td>10 מיקרומטר</td>
			<td>0.3 ΜL</td>
			<td>0.6 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>RP</td>
			<td>10 מיקרומטר</td>
			<td>0.3 ΜL</td>
			<td>0.6 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>-</td>
			<td>3.4 ΜL</td>
			<td>8.8 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>בטבלה 3. לפי התגובה כרכים וריכוזי. הריכוז של ריאגנטים ואמצעי אחסון לתגובות.

מחקר זה מפרט את תהליך gavaging כמויות מדויקות של פרוביוטיקה לעכברים neonatal. הסידור ניסיוני אופטימלי כדי לכלול, אך אינה מוגבלת פרוביוטיקה מינון, שיטות ניהול, כימות של חיידקים במעיים.

פרוביוטיקה מחקרים בעכברים Neonatal באמצעות Gavage

Adult mouse models have been widely used to understand the mechanism behind disease progression in humans. The applicability of studies done in adult ...

מחקרים פרוביוטיים, בעכברים יילודים באמצעות gavage. הקדמה, פרוטוקול וידאו זה יפרט את ההתקנה ואת ההליך עבור gavaging פרוביוטיקה לעכבר יילודים, ביום החיים השני שלה. האוסף הסטרילי של המעיים, לניתוח מיקרוביום מעיים, מפורט גם בפרוטוקול זה.חלק מהתוצאות הייצוגיות, נכללות גם בפרוטוקול זה, כדי להציג חלק מסוגי הנתונים, שניתן להפיק מהליך זה. גבאז' תוך-ושט של עכבר יילודים, יום החיים השני. מניחים את כלוב הסכר באותו מכסה המנוע שבו, כלובים ניסיוניים ממוקם על כרית החימום, כרית החימום מוגדרת לרמה בינונית, שהוא כ 38 מעלות צלזיוס.הסר כמה קינון אדמה מכלוב הבית, לשפשף את הקינון בידיים כפפות כדי להעביר את הריחות, של חומר הקינון על הכפפה. זה מקטין את העברת ריחות זרים, על הגור כאשר מטופלים. זה בתורו מפחית את הסיכון, של נטישה או קניבליזציה, על ידי הסכר בשל ריחות זרים.כאשר הגורים מוחזרים לכלוב הבית, לאחר ההליך. צרו קן אחזקות חרוטי, והמקמו אותו בכלוב הניסוי החדש והסטרילי, שהתחמם מראש. מעבירים את כל הגורים מכלוב הבית, לכלוב הניסיוני.הזז את הגורים לתוך הקינון חרוט, בכלוב הניסיוני. מוציאים את כלוב הסכר ומ מניחים אותו, הרחק מאזור הגוועינג. זה מפחית את התנאים המלחיצים עבור הסכר, על ידי מניעת הסכר לשמוע את הגור, עושה את ההליך.פתח את אריזות המזרק לגישה נוחה. מוציאים את מחט ההזנה האוטומטית, בצורה סטרילית, ומצמידים אותה לראש המזרק. המחט נשטפת עם 70% אתנול, ומים, לפני autoclaving.סטים שונים של מחטי האכלה, משמשים בין קבוצות הטיפול והבקרה, כדי למנוע זיהום צולב. צייר את פתרון הצבע הפרוביוטי לתוך המזרק, הפוך וצליף באצבע כדי להסיר בועות, וריק מקום בנפח בתוך המזרק. משוך בחזרה על הבוכנה כדי לנקות את הנוזל, מן המחטים שטח מת, ולאחר מכן לדכא את הבוכנה, כדי לגרש בועות אוויר ואוויר, זה חשוב להבטיח, כי אין בועות אוויר gavaged, לתוך החיה.כוונן את עוצמת הקול הרצויה במזרק, ליום של חיים שני עכברים, לא יותר מ 30 microliters צריך להיות gavaged. הסימון השחור שאתה רואה על המחט, מציין את האורך המרבי, כי המחט ניתן להכניס לתוך העכבר. אורך זה מתקבל על ידי מדידה חיצונית, האורך בין האף לתהליך xiphoid.מניחים את המזרק על משטח סטרילי, מסירים את הגור כדי להיות gavaged מכלוב הניסוי, ולבחון סימנים בריאותיים. סימנים בריאותיים אלה כוללים, נשימה קבועה וצבע ורוד של העור. מניחים את הגור על גיליון שומרי מצוות סטריליים, על כרית החימום.לשמן את המשטח החיצוני של מחט האכלה, באמצעות הממס המשמש להמסת פרוביוטיקה. הנה זה מים דקסטרוז, מתקנים אלה הכניסה החלקה של המחט, לתוך הוושט של החיה. לקשקש את הגור על ידי העור על הצוואר, באמצעות האגודל והאצבע המורה שלך.אחוז במזרק בידך הדומיננטית, בתצב המאפשר לך להכניס את המחט, ודכא את הבוכנה מבלי להתאים את האצבעות. הכנס את הנורה של מחט האכלה בזווית של 45 מעלות, עד שהוא מגיע האחורי של הפה. לסובב את היד שלך עם המחט ממך, תוך החזקת הנורה של המחט במקום, פעם המחט היא פשוטה עם פלג הגוף העליון, זה יתחיל להחליק.ודא שאין לחץ נוסף מוחל על המזרק, כדי לעורר את התנועה. תהליך הבליעה יהיה איטי, וסבלנות היא המפתח. ככל שהגור מזדקן בליעת המחט, תהפוך למהירה וקלה יותר.מחט ההאכלה סומנה מראש, כדי למנוע מהנורה להיכנס לקיבה. לאחר הסימון מתקרב חוטם, לעצור את התנועה של המחט, ולאט לאט לספק את הפתרון פרוביוטיקה. לאחר השלמת המשלוח, להסיר את המחט לאט.מניחים את העכבר על כרית החימום ולצפות להתאוששות. רפלקס מתנשף נפתר וקצב הלב עולה, צבע ורוד בריא מופיע שוב, רפלקס התנשפות לא פתור לאחר 45 שניות, מצביע על gavage נכשל ואת העכבר חייב להיות המתת דם. צבע gavage צריך להיות גלוי דרך העור החיוור, הצבע צריך להיות גלוי רק באזור, שבו כתמי החלב נמצא בדרך כלל.הכליאה לצבע לקיבה, מצביעה על גבאז' מוצלח. אם הצבע נמצא בחלל בית החזה, או בכל חלל אחר מאשר הקיבה, יש להותיע את העכבר, כיוון שהוא מצביע על הבטן הכושלת. יש צורך בלחץ מינימלי, כדי לקשקש יום של עכבר שני בחיים.סימנים של scruffing קשה יכול לכלול, חוסר יכולת לנשום, התנשפויות משמעותיות, והדבקת הלשון החוצה במשך זמן רב. כמה הצעות להליך gavaging, לנוח את החלק האחורי של האצבע הידיים מגרדות שלך, על כף היד מחזיק את המזרק, זה מבטיח את תנוחת הגורים יציבה, במהלך ההליך ואת המחט, לא זז בתוך החיה. במהלך gavage, המשקל של המחט, יקל על ההזזה, לאפשר את המחט להיבלע על ידי הגור, מבלי להפעיל כל לחץ חיצוני.החזירו את הגורים לכלוב הסכר, ועקבו אחר הניטור לפי לוח הזמנים שלכם. אוסף של דגימות מעיים לניתוח קולוניזציה. החיה הייתה בהרת דם אנושית, בשיטות שאושרו בפרוטוקול טיפול ושימוש בבעלי חיים.השולחן הכירורגי מרופד מחצלת סופגת סטרילית. הכלים עברו עיקור באמצעות 70 אחוז אתנול, ועיקור פעימה חמה ב 250 מעלות צלזיוס. השירות החיצוני של החיה, הוא חיטוי עם 70 אחוז אתנול.חותכים את העור החיצוני באמצעות מדפים ומספריים, לארבעה רבעים, תוך נקיטת זהירות רבה, כדי לא לגרד את החצץ. תוחב את העור לצד כך, peritoneum חשוף היטב. השתמש בכלים סטריליים שונים, חדשים, כדי לחתוך את peritoneum פתוח, ולנקוט זהירות נוספת לא לגרד, האיברים הפנימיים בתהליך זה.אתר את הקיבה של הגור, ומהדק על התריסום. באמצעות שני מטלאים סטריליים, לאתר את הבטן, ולאתר את הקצה התריסים של הבטן. מהדקים ישר בצומת, בבטן ובתריסרון.השתמש בשני מדפים סטריליים חדשים כדי להפעיל את המעיים, להשתמש בכוח אחד להחזיק את התריסום, תוך שימוש השני לקרוע כל רקמת חיבור, מחזיק את המעיים שלמים. כפי שאתה לפענח, למקם את המעיים, על כרית סופג סטרילי מכסה את החיה. אם יקרה לך לקרוע את המעיים, במהלך הליך ההתפרקות, לסמן את האזור שבו הוא קרע, כך הכיוון של המעי הוא שלם.מהדק בקצה רקטלי, ולעשות חתכים בשני המהדקים. מניחים את המעי שלם, על רדיד אלומיניום מסומן סטרילי בכיוון הנכון. סמן את כל החלקים של המעי, הכרחי לניתוח הבא שלך.DNA מופק ממעיים אלה, באמצעות הליך מיצוי אופטימיזציה, וניתוח QPCR נעשה כדי לכמת את פרוביוטיקה. הדנ"א מופק ממעיים טריים, או שניתן לאחסן את המעיים, ב-80 מעלות צלזיוס שליליות באמצעות קופסת מקפיא. תוצאות מייצגות, פלנטריום לקטובצילוס, קולוניזציה עם gavage כל יום וכל יומיים.אות LP גבוה יותר נצפתה במעיים של עכברים, gavaged כל יומיים, בהשוואה לעכברים gavaged כל יום. לכן, הם ניסויים הבאים נבנו, באמצעות gavages כל יומיים. לקטובצילוס plantarum gavaged עכברים, שוכנים במשותף עם עכברים ungavaged.אותות משתנים של LP נצפו בעכברים לא מטופלים, שהיו שוכנים במשותף עם עכברים gavaged LP. התפשטות הקולוניזציה של LP, אפשרית עם חברי המלטה, ולכן תנאי הטיפול, הופרדו על ידי כלובים לניסויים הבאים שלנו. מסקנה, הליך זה יכול לשמש כדי לספק, כמויות מדויקות של כל נוזל לעכברים שזה עתה נולדו.הדגימה של המעיים ניתן לשער, כדי לחקור את השינויים microbiome, באמצעות שיטות אחרות של ניתוח. היקף הסרטון הזה הוא לספק פלטפורמה, לחוקרים להשתמש במודלים gavage עכבר יילודים, כדי להבין את המנגנונים מאחורי ההשפעות שנצפו, עם ניהול מוקדם של פרוביוטיקה. תודה מיוחדת לצוות מעבדת קולמן, שירותי הטיפול בבעלי חיים של, אוניברסיטת קולומביה הבריטית, על שאפשרו את המחקר הזה.

probiotic-studies-in-neonatal-mice-using-gavage

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

כאן, הליך מתואר להקמת זיהום מערכתי בחולדה היילודים עם תרבויות של Escherichia coli K1. הליך בלתי פולשני זה מאפשר קולוניזציה של מערכת העיכול, טרנסלוקציה של הפתוגן למחזור המערכתי, ופלישה של מערכת העצבים המרכזית במקלעת דמית העין.

דגם לא פולשנית של Neuropathogenic Coli Escherichia זיהום בעכברוש הילודים

אנו מציגים כאן תיאור אחיד של טכניקות שיכולות לשמש לפיתוח, לשנות, לנהל, ולבדוק ביטוי חלבון Heterologous של boulardii Saccharomyces שמרים פרוביוטיים.

טרנספורמציה של שמרים פרוביוטיים ושחזור שלהם מרקמות העיכול החיסון בעקבות Gavage אוראלי עכברים

פרוטוקול זה מספק את הצעדים הדרושים כדי ליצור ולהעריך אלח דם neonatal בעכברים בן יום-7.

דגם עכבר מבוקר Neonatal אלח דם Polymicrobial

זיהום של עכברים יילודים עם bioluminescent E. coli O1:K1:H7 תוצאות זיהום ספיגה עם דלקת ריאות משמעותית ופתולוגיה ריאות. כאן, אנו מתארים נהלים למודל וחקר נוסף אלח דם יילודים באמצעות הדמיה תוך ויציתית אורך במקביל ללקטואר של נטל חיידקי מערכתי, פרופיל דלקתי, היסטופתולוגיה ריאות.

מודל הדמיה יילודים של אלח דם חיידקי גרם שלילי

נמק enterocolitis (NEC) היא המחלה הקשה ביותר במערכת העיכול (GI) המתרחשת לעתים קרובות אצל פגים, במיוחד תינוקות במשקל לידה נמוך מאוד, עם תמותה גבוהה ופתוגנזה לא ברורה. הגורם ל- NEC עשוי להיות קשור לחריגות במערכת הרגולציה החיסונית הדלקתית. מודל בעלי חיים NEC הוא כלי הכרחי למחקר חיסוני מחלות NEC. מודלים בעלי חיים NEC בדרך כלל להשתמש C57BL / 6J עכברי יילודים; עכברי יילודים BALB / c משמשים לעתים רחוקות. מחקרים קשורים הראו כי כאשר עכברים נגועים, בידול התא Th2 הוא דומיננטי בעכברים BALB / c לעומת עכברי...

מודל עכבר BALB /c יילודים של דלקת אנטרוקוליטיס נמק

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביסוס מודל עכברי קוליטיס המושרה על ידי פסאודו-חיידקים נטולי חיידקים דקסטרן סולפט נתרן כדי לחקור את תפקידה של מיקרוביוטת המעיים בוויסות ההשפעות החיוביות של Bacillus cereus על קוליטיס.

חקירת ההשפעות המקלות של מתן Bacillus cereus על קוליטיס באמצעות אפנון מיקרוביוטה של המעיים

בקטריופאג'ים (פאגים), נגיפים שמדביקים חיידקים, הם מרכיב אינטגרלי של מיקרוביום המעי. אף על פי שהתושבים הסימביוטיים האלה מניעים את הכושר החיידקי ואת דינמיקת האוכלוסייה, מעט מאוד מובן על האופן שבו הם משפיעים על הומאוסטזיס מעיים ומחלות. פרוטוקול זה חוקר פאגים T4 מבודדים בתוך מודל עכברי, הניתן להתאמה לזוגות פאגים-חיידקים אחרים.

אינטראקציה בין בקטריופאג' T4 ואי קולי במעי מורין: מודל אב-טיפוסי לחקר דינמיקה של בקטריופאג' מארח ב-Vivo

לידה מוקדמת (לידה &lt; שבוע 37) היא בעיה בריאותית עולמית דחופה עם אפשרויות מניעה וטיפול לא אופטימליות. אנו מציגים מודל עכברי של לידה מוקדמת הנגרמת על ידי זיהום חיידקי בנרתיק ומתארים כיצד לנתח את התחלואה והתמותה של היילודים כתוצאה מכך.

מידול זיהום נרתיקי עולה, לידה מוקדמת ותחלואה בילודים בעכברים

פרוטוקול זה מתאר מודל עכבר יילודים של דלקת מעיים נמקית (NEC) ובידוד לאחר מכן של תאי חיסון למינה פרופריה מהמעי הדק של עכברי היילוד.

מודל עכבר יילודים של דלקת מעיים נמקית ובידוד למינה פרופריה לפרופיל תאי חיסון

מאמר זה מתאר: (1) העברת מולקולות בדיקה לעכברים יילודים כבר ב-DOL 6; ו-(2) הערכה חיצונית של תפקוד מחסום אפיתל המעי הגס בביופסיות מגורי DOL 10 לגמילה (DOL 20) על ידי הערכת חדירות פארא-תאית וטרנס-תאית עם תאי Ussing.

גוואג' אורלי בגורי עכבר יילודים והערכה תפקודית של שלמות מחסום המעי באמצעות תאי שימוש

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הנדרשים להתיישבות בעכברים עם pks+ Escherichia coli בתנאים לא דלקתיים, וכן שיטות לא פולשניות לאימות קולוניזציה והערכת התרחבות pks+ E. coli בצואה.

התיישבות עם עכברים pks+ Escherichia coli בתנאים לא דלקתיים

למדו את פרוטוקול ההזנה בגאבג' לתינוקות עכברים לחקר מיקרוביום המעיים. שיטה זו מאפשרת מתן פרוביוטיקה מדויק ואיסוף דגימות סטריליות לניתוח השפעות החיידקים על התפתחות המערכת החיסונית.

פרוביוטיקה מחקרים בעכברים Neonatal באמצעות Gavage

גלה סרטונים נוספים