Name: איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: גלו שיטה מתקדמת לזיהוי אתרי אוביקוויטינציה בחלבונים באמצעות העשרת פפטידי diGly וספקטרומטר מסה Orbitrap. השיטה מספקת כיסוי מעמיק של האוביקוויטינום ומשפרת את הרפרודוציביליות במחקר חלבונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו היא חלק מהפרוייקט "חלבונים בעבודה", תוכנית של הולנד פרוטאומניקס מרכז ממומן על ידי הארגון הולנד למחקר מדעי (NWO) במסגרת מפת הדרכים הלאומית מתקנים מחקר בקנה מידה גדול (מספר פרוייקט 184.032.201 ).

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (EDC) של ארסמוס MC.
1. הכנה לדוגמא
<ol><li>תאים מתורבתים<ol>
<li>בחר קו תא של עניין (למשל, הלה או אוסטאוסרקומה [U2OS] תאים) ולגדול את התאים בינונית נשר מינימלי של דולבקה (DMEM) שיושלם עם 10% חום בלתי מופעל באמצעות סרום העוברי (FBS) ו 100 יחידות/לסטרפטומיצין.</li>
		<li>עבור ניסויים כמותיים הפרוטקומאים, התרבות תאים ב dmem חסר ארגינין ו ליזין. המדיום חייב להיות שיושלם עם 10% סרום העוברי העובר דיאליזה (fbs), 100 יחידות/סטרפטומיצין ו-mL, ו אלכין-גלוטמין. ליצור שני סוגים של מדיה על ידי הוספת ליזין קונבנציונאלי ו ארגינין (' אור ' בינוני) או ליזין-8 (13ג6; 15N2) ו-arginine 10 (13ג6; 15N4) (' כבד ' בינוני), בהתאמה.</li>
		<li>התרבות אצוות של תאים בינוני בהיר (כלומר, ללא תווית) ו בינונית כבד (כלומר, מתויג, SILAC) עבור לפחות שישה טווח לפני התרחבות וטיפול כדי לוודא כי כל החלבונים בתרבות בינונית כבדה מתויגים עם איזוטופ יציב כבד המכיל חומצות אמינו.</li>
		<li>לטפל בתאים עבור 8 h עם 10 μM של מעכבי מעכב פרוטאסדום או נפח שווה ערך של DMSO כטיפול מבוים. רחץ את התאים עם PBS, הנתק אותם באמצעות 1% טריפסין/EDTA, וכלה את התאים.</li>
		<li>Lyse את הגלולה תא מ 1 150 ס מ2 לוחית התרבות לכל תנאי נבדק 2 מ ל של קרח קר 50 mM טריס-HCl (pH = 8.2) עם 0.5% נתרן deאוקסיכולולאואט (DOC). מרתיחים את הליפוסט ב 95 ° c עבור 5 דקות ו sonicate עבור 10 דקות (הגדרת "H" עבור sonicator המפורטים בטבלה של חומרים) ב 4 ° c. אנחנו לא ממליצים על השימוש של מעכבי ביוקווינואז כמו N-ethylmaleimide (NEM), כי זה עשוי להציג שינויים חלבון לא רצויים שיכולים לסבך זיהוי פפטיד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ברקמת מוח vivo העכבר<ol>
<li>כאשר משתמשים ברקמה vivo, lyse את הרקמה בתוך מאגר קר קרח המכיל 100 mM טריס-HCl (pH = 8.5), 12 mM נתרן DOC, ו 12 מ"מ נתרן N-lauroylsarcosinate17. Sonicate הליפוסט במשך 10 דקות (הגדרת "H" לsonicator המפורטים בטבלת החומרים) ב -4 ° c ומרתיחים את הליפוסט במשך 5 דקות ב 95 ° c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ככמת את סכום החלבון הכולל באמצעות שיטת התאמת החלבון BCA. הסכום הכולל של החלבון צריך להיות לפחות כמה מיליגרם עבור immunoprecipitation פפטיד מוצלחת של diGly (IP). עבור ניסויים SILAC לערבב את האור ואת החלבונים המסומנים כבדים ביחס 1:1 בהתבסס על כמות החלבון הכולל.</li>
	<li>להפחית את כל החלבונים באמצעות 5 מ"מ 1, 4-dithioitol עבור 30 דקות ב 50 ° c ולאחר מכן לאחר מכן האלדול אותם עם 10 מילימטר מאשר במשך 15 דקות בחושך. לבצע עיכול חלבון עם Lys-C (1:200 יחס אנזימים למצע) עבור 4 שעות ואחריו העיכול לילה עם טריפסין (1:50 יחס אנזים למצע) ב 30 ° צ' או בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>הוסף חומצה trifluoroacetic (TFA) למדגם מתעכל לריכוז הסופי של 0.5% ו צנטריפוגה את המדגם ב 10,000 x g עבור 10 דקות כדי לזרז ולהסיר את כל חומרי הניקוי. לאסוף את סופרנטנט המכיל את הפפטידים עבור המהומה הבאה.</li>
</ol>2. משבר פפטיד לא מקוון
<ol><li>השתמש גבוהה pH לאחור שלב (RP) סי18 כרומטוגרפיה עם חומר נייח בשלב הקבוע (300 Å, 50 μM; ראה טבלת חומרים) נטען לתוך מחסנית עמודה ריקה כדי לאנגיופלסטיקה את הפפטידים טריפטיים. הגודל הנייח של מיטת הפאזה חייב להיות מותאם לכמות החלבונים שניתן לעכל. הכינו מחסנית עמודה ריקה בגובה 6 מ ל (ראו טבלת חומרים) המלאה ב-0.5 גרם של חומר נייח בשלב של ~ 10 מ ג של תקציר חלבונים. תקציר חלבון ליחס שלב נייח צריך להיות כ 1:50 (w/w).</li>
	<li>טען את הפפטידים על הטור המוכן ושטוף את העמודה עם כ 10 כרכים של עמודות של 0.1% TFA, ואחריו כ 10 כרכים של עמודות של H2O.</li>
	<li>Elute הפפטידים לתוך שלושה שברים עם 10 כרכים של עמודות 10 מ"מ הפתרון אמוניום (pH = 10) עם 7%, 13.5%, ו 50% acetonitrile (AcN), בהתאמה. ליאופליז כל השברים לשלמות.</li>
	<li>השתמש אוביקוויב שארית מוטיב (K-ε-GG) נוגדנים מצוזרת לחלבון מחרוזת agarose עבור העשרת הפפטידים של diGly. בגלל הסכום המדויק של הנוגדן לכל אצווה של חרוזים הוא מידע קנייני ולא נחשף על ידי היצרן, מומלץ להשתמש באותה הגדרה עבור אצווה של חרוזים כמו היצרן עושה כדי למנוע בלבול. לשטוף חבילה אחת של החרוזים האלה 2x עם PBS ולפצל לתוך שישה שברים שווים. ראה איור 1 עבור ערכה ניסיונית מפורטת.</li>
	<li>לפזר את שלושת השברים פפטיד שנאספו בשלב 2.3 ב1.4 mL של מאגר המורכב 50 מ ל מגבים, 10 מ"מ נתרן פוספט, ו 50 מ"מ (pH = 7.2), ולסובב את השברים.</li>
	<li>הוסיפו את הסופרנטנים של השברים לחרוזי הנוגדן diGly ו הדגירה עבור 2 h ב 4 ° c על יחידת מסובבי. לסובב את החרוזים ולהעביר את supernatant לתוך אצווה טרייה של חרוזי נוגדן ו הדגירה שוב 2 h ב 4 ° c.</li>
	<li>לאחסן את סופרנטנים עבור ניתוח פרוטדום הכללית הבאים (GP).</li>
	<li>להעביר את החרוזים מכל שבר לתוך הקצה 200 μL הצינורות מצויד תקע GF/F מסנן לשמור את החרוזים. לשים את העצה הצינורות עם החרוזים לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL מצויד במתאם קצה צנטריפוגה. לשטוף את החרוזים 3x עם 200 μL של מאגר IAP קר קרח ולאחר מכן 3x עם 200 μL של קרח קר מילי מילימטר2O. ספין לאורך העמודה ב 200 x g עבור 2 דקות לפני כל צעד לשטוף, אבל להיזהר לא לתת את העמודה לרוץ יבש. אליוט הפפטידים באמצעות 2 מחזורים של 50 μL של 0.15% TFA.</li>
	<li>Desalt הפפטידים באמצעות תיאור שלב סי18 (למעשה טיפ 200 μL הפיפטה עם שני דיסקים סי18) ולייבש אותם לשלמות באמצעות צנטריפוגה ואקום.</li>
</ol>3. ננופרופיל LC-MS/MS
<ol><li>בצע ניסויים LC-MS/MS על ספקטרומטר מסה רגיש בשילוב עם מערכת LC nanoflow.</li>
	<li>השתמש ב-house ארוז 50 ס מ היפוך-שלב הטור עם קוטר 75 יקרומטר הפנימי ארוז עם שרף CSH130 (3.5 יקרומטר, 130 Å) ו elute הפפטידים עם הדרגתי של 2 ל 28% (acn, 0.1% FA) מעל 120 דקות ב 300 nL/min. לחילופין, השתמש בעמודות LC מסחריות זמינות עם מאפיינים דומים שמור את העמודה ב 50 ° צ' באמצעות תנור עמודה, למשל (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>בצע את ניתוח הספקטרומטר המסה.<ol>
<li>על ספקטרומטר המסה להיות מופעל במצב רכישה תלוית נתונים (לוד). ספקטרום המסה MS1 יש לאסוף ברזולוציה גבוהה (למשל, 120,000), עם בקרת רווח אוטומטי (AGC) הגדרת היעד של 4E5 וזמן הזרקה מקסימלית של 50 ms במקרה של ספקטרומטר המסה של אורבראפ.</li>
		<li>בצע תחילה את ניתוח הספקטרומטר המסה במצב ' עוצמה גבוהה ביותר '. בדרך זו, היון האינטנסיבי ביותר נבחר ראשון לפיצול, אז השני הגבוה ביותר, וכן הלאה, באמצעות שיטת המהירות העליונה עם זמן מחזור כולל של 3 s. לאחר מכן, בצע סיבוב שני של ניתוח הדה-לילי במצב "העוצמה הנמוכה ביותר הראשונה", כך שהיון העמוק ביותר ייבחר קודם, ואז השני הנמוך ביותר, וכן הלאה. אסטרטגיה זו מבטיחה זיהוי אופטימלי של פפטידים מאוד נמוכים.</li>
		<li>סנן את היונים הקודנות לפי מצבי הטעינה שלהם (2-7 חיובים) והקצאת שיא מונואיזונושא. אל תכלול סמנים מוקדמים שנחקרו בעבר באופן דינאמי עבור 60 s. בידוד מקדים פפטיד עם מסנן המסה פי ארבעה של מוט מוגדר לרוחב של 1.6 Th.</li>
		<li>לאסוף MS2 ספקטרום במלכודת יונים ב-AGC של 7E3 עם זמן הזרקה מקסימלית של 50 ms ואנרגיה התנגשות HCD של 30%.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ניתוח נתונים
<ol><li>נתח את הקבצים הגולמיים של הספקטרומטר ספקטרומטריה באמצעות מנוע חיפוש מתאים כגון חבילת התוכנה הזמינה באופן חופשי maxquant המבוססת על מנוע החיפוש של אנדרומדה18,19. ב-MaxQuant, בחר בהגדרות ברירת המחדל עם מספר עיבודים המצוינים להלן. הגדר את האנזים לטריפסין, עם המספר המירבי של ביקנים שהחמצת הגדלים עד שלוש. הגדר ליזין עם שארית digly (+ 114.04 Da), חמצון של מתיונין ו-N-טרמינל מרחלציה כמו שינויים משתנים, ולהגדיר carbamidomלציה של ציסטאין כשינוי קבוע.</li>
	<li>בצע חיפושים במסד נתונים מול קובץ FASTA המכיל רצפי חלבון שהורדו מ-, לדוגמה, מאגר יוניפרוט (<a href="https://www.uniprot.org/downloads" target="_blank">https://www.uniprot.org/downloads</a>) בשילוב עם מדמה ומסד נתונים רגיל של מזהם שמסופק באופן אוטומטי על-ידי MaxQuant. קבע את קצב גילוי השקר (רוזוולט) ל-1% והגדר את הניקוד המינימלי עבור שינוי (diGly) כדי 40 (ערך ברירת מחדל). לא לכלול פפטידים מזוהה עם C-טרמינל diGly שונה ליזין שאריות מניתוח נוסף.</li>
	<li>לניתוח כמותי של קבצי ניסוי SILAC, הגדר את הריבוי ל-"2" וחזור על שלב 4.2.</li>
	<li>בצע את כל ניתוחי במורד הזרם (למשל, סטטיסטיקה, ניתוחי האונטולוגיה גנטי) עם מודול פרסאוס20 של חבילת התוכנה MaxQuant.</li>
</ol>

<ol><li>Clague, M. J., Urbé, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin%3A+Same+molecule%2C+different+degradation+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways.</a> Cell. 143, 682-685 (2010).</li>
<li>Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway.</a> Cell. 79 (1), 13-21 (1995).</li>
<li>Ohtake, F., Tsuchiya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JB+special+review+-+Recent+topics+in+ubiquitin-proteasome+system+and+autophagy%3A+The+emerging+complexity+of+ubiquitin+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">JB special review - Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture.</a> Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).</li>
<li>Bergink, S., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+ubiquitin+and+SUMO+modifications+in+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair.</a> Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).</li>
<li>Komander, D., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ubiquitin+Code%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Ubiquitin Code.</a> Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).</li>
<li>Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+Linkage-Specific+Affimers+Reveal+Insights+into+K6-Linked+Ubiquitin+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling.</a> Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).</li>
<li>Swatek, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+ubiquitin+chain+architecture+using+Ub-clipping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping.</a> Nature. 572, 533-537 (2019).</li>
<li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li>
<li>Wagner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Analyses+Reveal+Divergent+Ubiquitylation+Site+Patterns+in+Murine+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).</li>
<li>Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+Ubiquitylation+and+Phosphorylation+Signaling+in+Rapamycin-treated+Yeast+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).</li>
<li>Elia, A. E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Proteomic+Atlas+of+Ubiquitination+and+Acetylation+in+the+DNA+Damage+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response.</a> Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).</li>
<li>Wagner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Proteome-wide%2C+Quantitative+Survey+of+In+Vivo+Ubiquitylation+Sites+Reveals+Widespread+Regulatory+Roles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284(2011).</li>
<li>Udeshi, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Quantification+of+in+vivo+Changes+in+Protein+Ubiquitination+following+Proteasome+and+Deubiquitinase+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).</li>
<li>Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+reveals+extensive+remodeling+of+the+ubiquitinome+after+perturbation+of+the+proteasome+by+dsRNA+mediated+subunit+knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown.</a> Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).</li>
<li>Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+lysine+ubiquitination+by+ubiquitin+remnant+immunoaffinity+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling.</a> Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).</li>
<li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li>
<li>Wakabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteome+analysis+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+tissue+sections+mounted+on+microscope+slides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides.</a> Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).</li>
<li>Rose, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Multiplexed+Quantitative+Mass+Spectrometry+Analysis+of+Ubiquitylomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes.</a> Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).</li>
<li>Kaiser, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+standard+absolute+quantification+%28PSAQ%29+method+for+the+measurement+of+cellular+ubiquitin+pools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools.</a> Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).</li>
<li>Van Der Wal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+ubiquitylation+site+detection+by+Orbitrap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry.</a> Journal of Proteomics. (July), (2017).</li>
<li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li>
</ol>

המחברים לא מצהירים. על ניגוד אינטרסים

הפרוטוקול המתואר כאן חל על דגימות ממקורות ביולוגיים שונים, כגון תאים מתורבתים ורקמות vivo. בכל המקרים זיהינו אלפי פפטידים diGly, בתנאי הסכום הכולל של החלבון כמות היה לפחות 1 מ ג. העשרה שימוש בנוגדנים ספציפיים היא יעילה מאוד, בהתחשב בכך שרק ברוב 100-150 מאוד נמוך מאוד הפפטידים diGly זוהו מתוך ליטים תא שלם אם לא הליכי העשרה עבור חלבונים אוביקטיתים או הפפטידים diGly הוחלו. ברור, ספקטרומטר מסה רגיש הוא תנאי מוקדם להשגת מספר גבוה של זהויות diGly. למרות שאנחנו השתמשנו בהצלחה מספר ספקטרומטר מסה שונים, מצאנו את Tribrid לומוס להי...

בניין של אוביקוויב לחלבונים מסמן אותם עבור השפלה על ידי פרוטאסדום והוא תהליך מכריע ב פרוטאוסטזיס. C-טרמינל קרבוקסילי הקבוצה של הצורות אוביקוויב בקשר עם הקבוצה ליזין ε-אמינו של חלבון היעד1,2. בנוסף, אוביקוויב יכול להיות מצורף מודולים אחרים אוביקוויב, וכתוצאה מכך היווצרות של הומוגנית (כלומר, K48 או K11) או מסוקנים (כלומר1, הטרוגנית או מעורב) polyubiquitinמבנים 1,3. הפונקציה הידועה ביותר של אוביקוויב היא תפקידה השפלה פרוטאספאל, בתיווך על ידי K48 מקושרים polyubiquitin. עם זאת, התברר כי הן מונו, כמו גם polyubiquitination גם לשחק תפקידים בתהליכים רבים כי הם עצמאיים של השפלה על ידי פרוטאסדום. למשל, רשתות מקושרות K63 יש תפקידים nondegradative בסחר תאיים, השפלה ליסוזומיום, איתות קינאז, ואת הנזק DNA תגובה4,5. שישה סוגי ההצמדה האחרים הם פחות שופע ותפקידם הם עדיין במידה רבה, למרות הסימנים הראשונים על התפקודים שלהם בתא הם המתעוררים, בעיקר בגלל התפתחות של כלים חדשניים כדי לאפשר זיהוי ספציפי הצמדה6,7.
ספקטרומטר מסה הפכה כלי הכרחי עבור ניתוחים פרוטדום וכיום אלפי חלבונים שונים כמעט כל מקור ביולוגי ניתן לזהות בניסוי אחד. שכבה נוספת של מורכבות מוצגת על ידי שינויים בפוסט-שינוי (למשל, זירחון, מתילציה, מרחלציה ואוביקווינציה) אשר יכולים לווסת את פעילות החלבונים. זיהוי בקנה מידה גדול של חלבונים PTM הנושאת גם התאפשר על ידי התפתחויות בשדה ספקטרומטר המסה. הסטואיצ'ימטריה הנמוכה יחסית של פפטידים הנושאים את הדבר המקביל לעמיתיהם שאינם שונו מציג אתגר טכני ושלבי העשרה ביוכימיים נחוצים בדרך כלל לפני ניתוח הספקטרומטר ההמוני. במהלך שני העשורים האחרונים פותחו מספר שיטות העשרה ספציפיות לניתוח של "פטין".
בגלל התפקידים הרב ביותר של אוביקוויטים חלבונים בתא, יש דרישה גדולה לפיתוח שיטות אנליטיות לאיתור אתרים אוביקווינציה על חלבונים8. היישום של שיטות ספקטרומטרי המוני הוביל לפיצוץ של מספר האתרים המזוהים אוביקווילנציה בתוך מעוף פירות, עכבר, אדם, ושמרים חלבונים9,10,11,12,13,14. צעד מרכזי הוצג על ידי פיתוח אסטרטגיות העשרה המבוססות על immunoprecipitation ברמה פפטיד באמצעות נוגדנים בבימויו של K-ε-GG מוטיב שארית (המכונה גם "diglycine" או "diGly"). הפפטידים האלה מיוצרים על העיכול של חלבונים אוביקטילביים באמצעות טריפסין כפרוטאז15,16.
כאן, אנו מציגים זרימת עבודה ממוטבת כדי להעשיר את הפפטידים diGly באמצעות immunopurification ובעקבות גילוי על ידי ספקטרומטר המסה של אורדרראפ. באמצעות שילוב של מספר שינויים של זרימות עבודה קיימות, במיוחד בהכנה לדוגמה ובשלבים ספקטרומטר המסה, עכשיו אנחנו יכולים לזהות באופן שגרתי יותר מ 23,000 הפפטידים diGly ממדגם אחד של תאי הלה שטופלו עם פרוטאסדום מעכבי ו-~ 10,000 מתאי הלה לא מטופל. יש לנו להחיל את הפרוטוקול הזה כדי lysates מתוך תיוג איזוטופ יציב ו יציבה עם חומצות אמינו בתרבות התא (SILAC) המסומנים תאי הלה, כמו גם לדגימות אנדוגניים כגון רקמת המוח.
זרימת עבודה זו מציגה תוספת רבת ערך לרפרטואר של כלים לניתוח של האתרים אוביקווינציה על מנת לחשוף את אוביקוויבידום עמוק. הפרוטוקול הבא מתאר את כל השלבים של זרימת העבודה בפירוט.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithioerythritol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8255</td><td></td></tr><tr><td>3M Empore C18 Octadecyl disks</td><td>מוצר Supelco</td><td>66883-U</td><td>הופסק ב-Supelco; CDS Analytical היא היצרנית החדשה (https://www.cdsanalytical.com/empore)</td></tr> <tr><td>אמוניום פורמט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70221</td><td></td></tr><tr><td>Bortezomib</td><td>UBPbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSH130 שרף, 3.5 &mu; מ', 130 וארינג;</td><td></td><td></td><td></td>מים</tr><tr><td>דימתילסולפוקסיד (DMSO)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>34869</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EASY-nanoLC 1200</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GF/F תקע מסנן</td><td>Whatman</td><td>1825-021</td><td></td></tr><tr><td>יודואצטמיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>ליזין, ארגינין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ליזין-8 (13C6; 15N2), ארגינין-10 (13C6; 15N4)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lysyl Endopeptidase(LysC)</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>129-02541</td><td></td></tr><tr><td>תנור</td><td>NanoLC עיצוב MPI, MS Wil GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine מלח נתרן</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-5125</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos ספקטרומטר מסה</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת חלבון BCA Pierce</td><td>ThermoFisher / Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>PLRP-S (300 &Aring;, 50 &micro; m) חלקיקי פאזה הפוכים פולימריים</td><td>Agilent Technologies</td><td>PL1412-2K01</td><td></td></tr><tr><td>PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-&epsilon;-GG) ערכת</td><td>איתות תאים</td><td>5562</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak tC18 6 סמ"ק Vac Cartridge</td><td>Waters</td><td>WAT036790</td><td>הסר את חומר tC18 מהמחסנית לפני מילוי המחסנית ב-PLRP-S</td></tr><tr><td>נתרן דאוקסיכולט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, ThermoFisher מטופל TPCK</td><td></td><td>20233</td><td></td></tr></tbody></table>

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

השינוי הפוסט-ממדי של חלבונים על ידי החלבון הקטן אוביקוויפין מעורב באירועים סלולריים רבים. לאחר העיכול הטריפטי של חלבונים אוביקוויטיים, פפטידים עם שארית דיגליצין מצוזרת לקבוצת האמינו אפסילון של ליזין (K-ε-diglycine ' או פשוט ' diGly ') ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר האתר המקורי שינוי. החיסונית יעילה של פפטידים diGly בשילוב עם זיהוי רגיש על ידי ספקטרומטר מסה הביא לעלייה עצומה במספר האתרים אוביקווינציה שזוהו עד היום. עשינו מספר שיפורים בזרימת עבודה זו, כולל גבוהה במצב לא מקוון pH-שלב לאחור השבר של פפטידים לפני הליך העשרה, והכללת הגדרות פיצול פפטיד מתקדמות יותר ב-multipole הניתוב יונים. גם, ניקוי יעיל יותר של המדגם באמצעות תקע מבוסס מסנן כדי לשמור על חרוזים הנוגדן תוצאות ספציפיות יותר עבור פפטידים diGly. שיפורים אלה התוצאה של הגילוי השגרתי של יותר מ 23,000 diGly פפטידים מתאי סרטן צוואר הרחם האנושי (הלה) תא lysates על עיכוב פרוטאסדום בתא. אנו מראים את היעילות של אסטרטגיה זו לניתוח מעמיק של הפרופילים אוביקווינוביים של מספר סוגי תאים שונים ובדגימות vivo, כגון רקמת המוח. מחקר זה מציג תוספת מקורית לארגז הכלים עבור ניתוח אוביקווינציה חלבונים כדי לחשוף את אוביקוויבידום הסלולר עמוק.

חלבונים אוביקווילביים להשאיר את שארית 114.04 Da דה דיגליצין על השאריות ליזין היעד כאשר החלבונים מתעכלים טריפסין. ההפרש ההמוני שנגרם על-ידי מוטיב זה שימש לזיהוי משמעי של האתר של אוביקווינציה בניסוי ספקטרומטר המוני. האסטרטגיה שאנו מתארים כאן היא שיטה מתקדמת ליצירת העשרה והזדהות הבאה של פפטידים diGly על-ידי nanoflow LC-MS/MS (איור 1א). במחקר זה, הן תאים מתורבתים והן בחומר vivo שימשו כמקור הביולוגי של חלבונים, אבל פרוטוקול זה תואם לכל מקור של חלב...

אנו מציגים שיטה לטיהור, איתור וזיהוי של פפטידים diGly שמקורם בחלבונים אוביקטיביים מדגימות ביולוגיות מורכבות. השיטה המוצגת מופצת, איתנה, ומבצעת שיטות שפורסמו ביחס לרמת העומק של האנליזה האוביקווינופית.

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

השינוי שלאחר התרגום של חלבונים על ידי חלבון קטן ubiquitin מעורב באירועים רבים בתא. מחקר זה מציג תוספת מקורית לארגז הכלים לניתוח חלבון בכל מקום. אנו משתמשים בטכניקות העשרה ובספקטרומטריית מסה כדי לחשוף את ההכל העמוק.ביצענו מספר שיפורים בניתוח של פפטידים diGly שמקורם חלבונים בכל מקום. אלה כוללים שבר פפטיד גולמי לפני העשרה, ואת היישום של הגדרות פיצול פפטיד מתקדמות יותר Orbitrap. בסך הכל התוצאה היא כיסוי גדול יותר של ubiquitinome.קשה לתאר מספר היבטים של הפרוטוקול במילים. הדמיה של חלק מהצעדים העיקריים חיונית כדי להיות מסוגל לחזור על ניתוחים אלה על ידי מפעיל אחר במעבדה אחרת. ההליך יוכח על ידי קארל Bezstarosti, שהוא טכנאי בכיר במעבדה שלי.התחל על ידי הכנת תאים מתורבתים או רקמת המוח של העכבר לניסוי. אם עובדים עם תאים, lyse גלולת התא מצלחת אחת 150 ס"מ בריבוע תרבות בשני מיליליטר של קרח קר, 50 מילימולר טריס HCL עם 0.5% נתרן deoxycholate. מרתיחים את הלט ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.ואז sonicate אותו בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. אם משתמשים ברקמת המוח של עכבר vivo, lyse אותו במאגר קר קרח המכיל 100 מילימולר טריס HCL, 12 מילימולאר נתרן deoxycholate ו 12 מילימולאר נתרן N-lauroylsarcosinate. סוניקאט למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.ואז להרתיח אותו במשך חמש דקות ב 95 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, מכמתים את כמות החלבון הכוללת באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA סופגת קלורימטרית, שאמורה להיות לפחות כמה מיליגרם לכשל חיסוני מוצלח של פפטיד diGly. לניסויי SILAC, ערבבו את החלבונים הקלים והכבדים ביחס של אחד לאחד בהתבסס על כמות החלבון הכוללת.להפחית את כל החלבונים עם 5 מילימולר DTT במשך 30 דקות ב 50 מעלות צלזיוס. ולאחר מכן אלקילאט אותם עם 10 מילימולרים iodoacetamide במשך 15 דקות בחושך. לאחר מכן לבצע עיכול חלבון עם Lys-C במשך ארבע שעות.ועיכול טריפסין לילה ב 30 מעלות צלזיוס, או בטמפרטורת החדר. למחרת, לחלק את המדגם לשני צינורות Eppendorf שני מיליליטר ולהוסיף TFA לדגימה מתעכל לריכוז הסופי של 0.5% צנטריפוגה זה ב 10, 000 פעמים G במשך 10 דקות כדי לזרז ולהסיר את כל חומר הניקוי. לאסוף את הפפטיד המכיל על טבעי עבור שברים הבאים.השתמש pH גבוה הפוך שלב C18 כרומטוגרפיה כדי לשבר את פפטידים טריפטי. הכינו מחסנית עמודים ריקה של שישה מיליליטר מלאה בחומר פאזה נייח של 0.5 גרם לכ-10 מיליגרם של תקציר חלבונים. טוענים את הפפטידים על העמוד המוכן ושוטפים אותו בכ-10 כרכים של 0.1%TFA, ואחריו 10 כמויות מים.אלתר את הפפטידים לשלושה שברים באמצעות 10 כרכים עמודה של 10 מילימור אמוניום formate עם שבעה, 13.5 ו 50% אצטוניטריל, בהתאמה. לאחר מכן, ליטוליזה כל השברים. קבוצה אחת של נוגדני מוטיב מוטיב בכל מקום מצומד חלבון תרחיף חרוז אגרוז מחולק לשישה שברים שווים.ממיסים את שלושת שברי הפפטיד לפי הוראות כתב היד ומסתובבים במורד ההריסות. מוסיפים את העל-טבעיים של שלושת השברים לתרחץ חרוזים תוך שמירה על שלושת השברים האחרים על הקרח. ותמהר אותם במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס ביחידת מסובב.לאחר מכן, סובב את חרוזים. מעבירים את העל-טבעי לקבוצה טרייה של חרוזים. ולחזור על הדגירה עם שלושת שברי תרחיף חרוזים הנותרים.אחסן את העל-טבעיים לניתוח פרוטאום גלובלי עוקב. ולהעביר את חרוזים 200 טיפים פיפטה microliter מצויד תקע מסנן GFF. שים את הטיפים לתוך 1.5 צינורות מיליליטר מצויד מתאם קצה צנטריפוגה ולשטוף את חרוזים שלוש פעמים עם 200 microliters של חיץ קרח קר IAP, ואחריו שלוש שטיפות עם מים מטוהרים קרים כקרח.סובבו את העמודים פי 200 G במשך שתי דקות בין הכביסה, ודאגו לא לתת לעמוד להתייבש. לאחר הכביסה הסופית, ללטף את הפפטידים עם שני מחזורים ב 50 microliters של 0.15% TFA. מפלים את הפפטידים עם קצה שלב C18 ומייבשים אותם בצנטריפוגה ואקום.בצע ניסויי LC-MS/MS על ספקטרומטר מסה רגיש יחד עם מערכת LC ננו-זרימה. הטור הוקם על פי הוראות כתב היד ושמור על 50 מעלות צלזיוס. הפעילו את ספקטרומטר המסה במצב רכישה תלוי נתונים.אסוף את ספקטרום המסה MS1 ברזולוציה גבוהה עם הגדרת יעד מבוקרת רווח אוטומטית של 4E5 וזמן הזרקה מרבי של 50 אלפיות שניה. בצע את ניתוח ספקטרומטריית המסה במצב הראשון האינטנסיבי ביותר, באמצעות שיטת המהירות העליונה עם זמן מחזור כולל של שלוש שניות. לאחר מכן לבצע סיבוב שני של ניתוח MS DDA במצב ראשון אינטנסיבי לפחות, אשר יבטיח זיהוי אופטימלי של פפטידים שפע נמוך.סנן את היונים המבשרים בהתאם למדינות המטען שלהם ולהצהלה מונואיזוטופית. ואל תכלול מבשרים שנחקרו בעבר באופן דינמי למשך 60 שניות. בודד מבשרי פפטיד עם מסנן מסה מרובעת מוגדר לרוחב של 1.6 תומסון.לאחר מכן לאסוף ספקטרום MS2 במלכודת היונים בשליטה אוטומטית להשיג של 7E3 עם זמן הזרקה מרבי של 50 אלפיות שנייה ואנרגיית התנגשות HCD של 30%לנתח את הספקטרומטריה מסה קבצי גלם באמצעות מנוע חיפוש מתאים, כגון חבילת תוכנה MaxQuant זמין בחופשיות המבוסס על מנוע החיפוש אנדרומדה. פתח את MaxQuant ובחר את קבצי הנתונים הגולמיים המתאימים. הגדר את מספר המעבדים ולחץ על הכרטיסיה פרמטרים ספציפיים לקבוצה.בחר עיכול, ולאפשר שלושה מחשוף שלא נענו. לאחר מכן בחרו שינויים והוסיפו דיגלי לשינויים המשתנים. בחר את לשונית הפרמטרים הגלובלית והוסף את מסד הנתונים הנכון של רצף החלבון.השאר את ההגדרות האחרות כברירת מחדל ולחץ על התחל לבצע את החיפוש במסד הנתונים. לניתוח כמותי של קבצי ניסוי SILAC, הגדר את הרבי לשניים ובחר את תוויות חומצות האמינו הכבדות. לאחר סיום החיפוש, יבא את קבצי הטקסט לתוך פרסאוס.פרוטוקול זה שימש לזיהוי אתרי בכל מקום בחלבונים מתאים מתורבתים וחומר vivo על ידי גילוי פפטידים diGly עם ננו-זרימה LC-MS/MS. מספר שיפורים נעשו בפרוטוקול הקיים אשר הביא למספרים גבוהים יותר של פפטידים diGly שזוהו. שבר גולמי לשלושה שברים בוצע לפני immunoprecipitation.אחד השברים מכיל פפטיד טריגלי שונה K48 של Ubiquitin, המאופיין בפסגה רחבה בכרומטוגרמת LC. יתר על כן, משטר פיצול פפטיד הותאם לשלב את ריצות LC-MS עם משטר הפיצול הראשון והנמוך ביותר בהליך ניתוח נתונים, אשר הפיק יותר מ 4, 000 פפטידים ייחודיים נוספים diGly. יותר מ 23, 000 פפטידים diGly ניתן לזהות באופן שגרתי מדגם אחד של תאי HeLa שטופלו מעכבי פרוטאזום.מכל הפפטידים הדיגליים שזוהו על פני שלושה מסכי שכפול ביולוגיים, יותר מ-9,000 היו נוכחים בכל השלושה, בעוד שיותר מ-17,000 היו נוכחים בלפחות שניים מתוך שלושה שכפולים. מספר זיהויי הפפטיד מותנה מאוד בכמות חומר הקלט. מספר משוער של פפטידים diGly מזוהה ניתן לצפות בהתאם לחומר ההתחלתי, אבל מספרים אלה הם רק הערכות יהיה גם תלוי בסוג של ספקטרומטר מסה בשימוש.בעת ביצוע פרוטוקול זה, ניסיון קודם עם שיטות פרוטאומיקה מבוססות ספקטרומטריית מסה וטיפול וניתוח כמויות מדגם דקות בהחלט יהיה יתרון. התוכנה MaxQuant יכול להיות מוחלף על ידי כל אלגוריתם חיפוש מסד נתונים אחר. כמו כן ניתן להשתמש בסוג אחר של ספקטרומטר מסה.התוצאות במונחים של זיהוי פפטיד עשויות להיות שונות במקצת, אבל זה אופייני לכל ספקטרומטריית מסה המבוססת על פרוטומיקה. Ubiquitin חשוב בהתקדמות של השפלת חלבון מתווך, אבל גם ממלא תפקיד בתהליכים רבים אחרים בתא. ידע מעמיק יותר של ubiquitin כשינוי שלאחר תרגום הוא חיוני כדי להבין טוב יותר את תפקידו.

detection-protein-ubiquitination-sites-peptide-enrichment-mass

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

Ubiquitination הוא שינוי posttranslational המפתח בוצע על ידי קבוצה של שלושה אנזימים. מוטציות של גנים המעורבים שינוי זה קשור הרבה מחלות אנושיות שונות. כאן אנו מתארים פרוטוקולים לזהות ubiquitination החלבון בתאים...

זיהוי של חלבון Ubiquitination

תקנים איזוטופ יציב ו ללכוד על ידי Anti-פפטיד נוגדנים (SISCAPA) זוגות להעשרת הזיקה של פפטידים עם איזוטופ יציב דילול ספקטרומטריית מסה (MRM-MS) כדי לספק מדידה כמותית של פפטידים כתחליפי עבור חלבונים, בהתאמה. כאן אנו מתארים את פרוטוקול באמצעות חלקיקים מגנטיים בפורמט אוטומטיות חלקית.

כימות של חלבונים באמצעות העשרה Immunoaffinity פפטיד יחד עם ספקטרומטריית מסה

בסרטון זה אנו מדגימים משקעים חיסוניים מבוססי נוגדנים של פוספופפטידים מתערובת פפטידים. הפוספפטידים המועשרים מרוכזים בוואקום ומאוחסנים לניתוח במורד הזרם.

העשרת פוספופפטידים: טכניקת משקעים חיסוניים מבוססת נוגדנים להפרדת פפטידים זרחניים ספציפיים מתערובות פפטידים מורכבים

סרטון זה מתאר שיטה לחלץ ולטהר פפטידים יוביקוויטיניל המכילים שאריות פפטידים די-גליצין מתערובת פפטידים מורכבת. השיטה המוצגת עשויה לסייע בזיהוי אתרי יוביקוויטינציה מקוריים בחלבון.

מיצוי מבוסס אימונוזיקה של פפטידים יוביקוויטינילטים: טכניקה לחילוץ סלקטיבי של פפטידים מתויגים של יוביקוויטין משברי פפטידים מטוהרים

פרוטוקול זה מתאר הליך כדי לחלץ ולהעשיר את phosphopeptides סרטן הערמונית שורות תאים או רקמות עבור ניתוח של phosphoproteome באמצעות פרוטאומיקס מבוססי ספקטרומטר מסה.

העשרה Phosphopeptide בשילוב עם ספקטרומטר מסה ללא תווית כמותיים כדי לחקור את Phosphoproteome סרטן הערמונית

פרוטוקול זה מטרתו להקים אוביקוויב (וכדומה) ו אוביקוויב-אוהב (Ubls) הפרוטאמים ספציפיים כדי לזהות שינויים של סוג זה של שינויים לאחר העברה (לאחר ההעברה), הקשורים במצב ספציפי כגון טיפול או פנוטיפים.

יצירת פרופיל אוביקוויפין ואוביקוויב-שינויים עצמאיים וזיהוי של שינויים משמעותיים

שיטה זו מתארת הערכה של שינויים גלובליים בטופולוגיית שרשרת ubiquitin. ההערכה מבוצעת על ידי יישום של גישה פרוטאומית ממוקדת ספקטרומטריית מסה.

ניתוח שרשרת Ubiquitin על ידי ניטור תגובה מקבילה

CENP-מהווה מהווה דרישה חשובה עבור CENP-A התצהיר ב צנטרומר, ירש דרך dimerization בין החטיבה התא, והכרחי לקיום תאים. כאן אנו מתארים ניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות אובילילציה של EYFP-מתויג CENP-A (EYFP-CENP-A) חלבון.

ניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות את אוביקווילציה של EYFP-מתויג CENP-A (EYFP-CENP-A)

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבדיקת יוביקוויטילציה של מצע מסוים ויוביקוויטין-ליגאז E3 בתאי יונקים. קווי תאים HEK293T שימשו לביטוי יתר של חלבונים, המצע הפוליוביקוויטילטיבי טוהר מליאסטים של תאים על ידי מיצוי חיסוני, ונפתר ב- SDS-PAGE. אימונובלוטינג שימש כדי לדמיין את השינוי הפוסט-תרגומי הזה.

הערכה של יוביקוויטילציה של מצע על ידי E3 יוביקוויטין-ליגאז בליסאטים של תאי יונקים

הפרוטוקול מתאר שיטה שלב אחר שלב לטיהור חלבונים הנמצאים בכל מקום מתאי יונקים באמצעות חלבון מדכא הגידול p53 כדוגמה. חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום טוהרו מתאים בתנאים מחמירים של אי-דנטורציה ודנאטורציה.

טיהור של חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום מתאי יונקים

יוביקוויטינציה היא רגולטור קריטי של תפקודי החלבון התוך-תאי. כאן, אנו מתארים שתי שיטות ניתוק תאים לזיהוי רמות יוביקוויטינציה של חלבוני סובסטרט בתאי יונקים ומשווים את יעילותן בניתוח רמות יוביקוויטינציה. ביטוי יתר של חלבונים בתאים HEK293T הושר על ידי טרנספקציה חולפת, וחלבונים מאוביקוויטיניים זוהו בניתוח Western Blot.

אסטרטגיות השוואתיות לזיהוי יוביקוויטינציה בליזטים של תאי יונקים באמצעות SMAD2/SMURF2 כמודל

גלו שיטה מתקדמת לזיהוי אתרי אוביקוויטינציה בחלבונים באמצעות העשרת פפטידי diGly וספקטרומטר מסה Orbitrap. השיטה מספקת כיסוי מעמיק של האוביקוויטינום ומשפרת את הרפרודוציביליות במחקר חלבונים.

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

גלה סרטונים נוספים