Name: נבג ספיחה כמערכת התצוגה Nonrecombinant אנזימים ו אנטיגנים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: למד שיטה לספיחת חלבונים לנבגי חיידקים ללא מניפולציה גנטית. טכניקה זו מאפשרת פיתוח חיסוני ריריות וביוקטליזטורים ניתנים לשימוש חוזר בבטיחות סביבתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי "Finanziamento di החיפוש אחר di Ateneo" כדי ל' Baccigalupi, כותרת פרוייקט "SP-LAY: בקטריאלי נבגים כפלטפורמה חיה לתצוגה חלבונים".

1. ספיחה התגובה
<ol><li>דגירה 2, 5 ו- 10 µg של mRFP עם 2 x 109 של נבגים מטוהרים פראי-סוג B. subtilis ב 200 µL של איגוד מאגר, 50 מ מ סודיום ציטרט, pH 4.0 (מ מ 16.7 סודיום ציטרט וגופרית והרכבו; חומצה ציטרית 33.3 מ מ) עבור 1 h 25 ° c-מטרף נדנדה (איור 1) .</li>
	<li>Centrifuge את תערובות מחייב (13,000 x g 10 דקות) כדי fractionate כדורי (P2, P5 ו P10), supernatants (S2 S5, S10). אחסן את supernatants עבור הערכת היעילות של ספיחה שמתואר בשלב 3.2 עקיף.</li>
	<li>לשטוף את כדורי 2 x עם 200 µL של איגוד מאגר ו resuspend אותם µL 100 איגוד של מאגר ולהשתמש בו עבור הניתוח הבא. הערה: איגוד התגובה מעדיפים מתרחשת ערך ה-pH נמוך יותר נקודה איזואלקטרית של החלבון; בדרך כלל, 1.5 M באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), pH pH 4.0 או 50 מ מ סודיום ציטרט, 4.0, משמשים.</li>
</ol>2. ישירה הערכת היעילות של ספיחה
<ol><li>
מיצוי של חלבונים פני שטח וניתוח תספיג חלבון
	<ol>
<li>. קח 50 µL של resuspension של mRFP-הספוחה נבגים (P2, P5 ו P10 של צעד 1.3) ולהוסיף 50 µL של 2 x dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות)-dithiothreitol (DTT) (0.1 M טריס-HCl, pH 6.8; 2% מרחביות; 0.1 M DTT) כדי solubilize נבג משטח חלבונים.</li>
		<li>השתמש mRFP חינם, מטוהרים תמציות של כמויות זהה של נבגים זה הם לא הספוחה כדי החלבון כפקדי חיוביים ושליליים, בהתאמה.</li>
		<li>אחרי 45 דקות של דגירה ב 65 ° C, centrifuge (13,000 x g 10 דקות) את תערובות ולנתח µL 10 של חילוץ החלבונים (supernatant) על ידי תספיג עם monoclonal נוגדן אנטי שלו לזהות את שלו תג נוכח N-מסוף של mRFP ( איור 2A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מיקרוסקופ פלואורסצנטי תצפיות הערה: באמצעות חלבונים heterologous פלורסנט או ביצוע ניתוח immunofluorescence, אפשרי להתאים לשפה ולכמת את המולקולות הספוחה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ.<ol>
<li>. קח 5 µL של resuspension של נבגים הספוחה מהשלב 1.3 ולהוסיף µL 95 ל- 1 x PBS, pH 4.0, כדי להשיג ~ 1 x נבגים6 10/µL....</li>
		<li>מקום 5 µL של השעיה בשקופית מיקרוסקופ, לכסות אותו. עם coverslip שטופלו בעבר פולי-l-ליזין ל 30 s, ולבחון אותו תחת מיקרוסקופ זריחה.</li>
		<li>עבור כל שדה, שמור את תמונת מיקרוסקופ שלב החדות ואת תמונת מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (איור 2B). הערה: לחלופין, נבגים פלורסנט ניתן לנתח אותם על-ידי cytofluorimetry. Resuspend בסך הכל 106 נבגים הספוחה או לא-הספוחה עם החלבון heterologous של 1 מ"ל של 1 x PBS, pH 4.0, ולנתח את המתלים. באמצעות cytometer של זרימה (איור 2C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ניתוח נתונים באמצעות ImageJ
	<ol>
<li>פתח את הדימויים מיקרוסקופ זריחה עם תוכנת ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/), ודא כל התמונות הן בתבנית של 8 סיביות (תמונה | סוג | 8 סיביות).</li>
		<li>כוונון הניגודיות במידת הצורך (תמונה | התאם | בהירות ניגודיות), ודא כי קנה המידה של התמונה פיקסל (תמונה | לקבוע קנה מידה).</li>
		<li>מתפריט ' נתח ', בחר לקבוע מידות. ודא כי יש אזור צפיפות משולבת, כלומר ערך אפור שנבחר.</li>
		<li>לצייר קו סביב הנבג עניין תוך שימוש בכל הכלים ציור/בחירה (קרי, מעגל, מצולע, או בצורה חופשית) (איור 3).</li>
		<li>בחר מדד בתפריט נתח (או פגע cmd + M). תיבה מוקפצת עם ערימה של ערכים עבור נבג הראשון הזה מופיע (איור 3).</li>
		<li>חזור על שתי הפעולות הבאות לפחות 50 נבגים אחרים בתוך שדה הראייה נבחר כדי למדוד.</li>
		<li>בחר במספר אזורים ללא כל הנבגים (שיש אין קרינה פלואורסצנטית) וחזור על המדידה; זה יהיה ברקע. הערה: הגודל הוא לא חשוב. אלו ערכי פלורסצנטיות הרקע המתאים ישמש להפחית באופן ידני את הרקע.</li>
		<li>בחר כל הנתונים בחלון תוצאות והעתק את התוצאות לתוך גיליון אלקטרוני.</li>
		<li>לחשב את ממוצעם של צפיפות משולב , אזור של נבגים שנבחרו ואת הערכים פלורסצנטיות רקע ולהשתמש בהם כדי להשיג את פלורסצנטיות סה כלכל-תא המתוקן (CTCF) תוך שימוש בנוסחה: CTCF = משולבים מרושע צפיפות - (כלומר אזור x כלומר רקע זריחה). הערה: לחלופין, אם כל הנבגים מופיעים מופרדים. ובכן, זה אפשרי לנתח כל נבגים של שדה התמונה באמצעות הפונקציה חלקיקים לנתח, בעקבות ההוראה של ImageJ. כדי למנוע תוכנת קורא פלורסצנטיות ספציפי או נבג אגרגטים, הממד של חלקיקים יש להגדיר ב- pixelˆ2 = 50-200 (איור 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. עקיפה הערכת היעילות של ספיחה
<ol><li>להכין דילולים טורי עבור חלבון מטוהרים.<ol>
<li>הכן צינור 1.5 mL הראשון המכיל 250 µL של mRFP מטוהרים-ריכוז סופי של 0.5 ng/µL, באמצעות המאגר מחייב. אמצעי אחסון זה מספיקה לטעון שני נתיבים.</li>
		<li>לבצע שישה כפולה טורי דילולים של 250 µL (נפח סופי) כל אחד, באמצעות המאגר מחייב.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין כפולה דילולים טורית על הדגימות supernatant המכיל השבר mRFP לא מאוגד של התגובה ספיחה (S2 S5, S10 מהשלב 1.2).<ol>
<li>מכניסים צינור 1.5 מ ל 100 µL של כל תגובת שיקוע והוסף µL 100 איגוד המאגר. לבצע שישה כפולה טורי דילולים של 200 µL (נפח סופי) כל אחד, באמצעות המאגר מחייב.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חותכים ניטרוצלולוזה ממברנה (0.45 מיקרומטר הקיצוץ), 9 ס"מ x 10 ס"מ גודל, כך שתכסה את האזור של 5 (מספר דוגמאות) x 6 נקודות (מספר דילולים). הקרום לא יתמשך מעבר לקצה של האטם של המנגנון חשופה נקודה.</li>
	<li>מקם את הקרום prewet המנגנון חשופה נקודה. הסר את כל בועות אוויר לכוד בין הקרום את האטם. לכסות על החלק בחיוב המנגנון עם סרט קלטת או פרפין כדי למנוע אוויר עוברים דרך מאותן בארות.</li>
	<li>להרכיב את המנגנון חשופה נקודה כפי שתואר על ידי היצרן.</li>
	<li>אם ואקום משמש במהלך הרכבת, נתרענן הקרום עם µL 100 ל- PBS x 1 לכל טוב כדי להבטיח הכריכה אחיד של אנטיגן ולמנוע הילות או אות זיהוי חלש.</li>
	<li>הסר בעדינות את המאגר מן הבארות על ידי ואקום. ברגע בופר מנקז כל בארות, לעצור את משאבת ואקום, נתק אותו.</li>
	<li>לטעון את התקן בסמטאות החיצוני ביותר שני והדוגמאות באמצע (איור 5). למלא את ולס המתאימות µL 100 של דילול בכל. באותו אמצעי אחסון המשמש עבור כל טוב עליך לוודא סינון הומוגנית של כל מדגם בארות.</li>
	<li>להפעיל את משאבת ואקום למשך 2 דקות, תפסיק ולאחר מכן, אפשר את הדגימה לסנן דרך הקרום על ידי זרימת הכבידה.</li>
	<li>לשטוף כל הבארות עם µL 100 1 x PBS ולתת משאבת ואקום נוסו על עוד 5 דקות לאחר המאגר כביסה יש כבר מרוקנת לגמרי מן המנגנון.</li>
	<li>עם שואב האבק על, שחרר את הברגים ופתח בזהירות את המנגנון חשופה נקודה.</li>
	<li>לבטל את שואב האבק, לקחת את הקרום, לעבד אותו בעקבות פרוטוקול תספיג חלבון.</li>
	<li>לבצע ניתוח densitometric של המסנן, באמצעות תוכנה מתאימה, כגון ImageJ.<ol>
<li>מודדים את צפיפות משולבת של כל נקודה על ידי חלוקה לרמות אותם עם מעגל באותו האזור באמצעות הפקודה ניתוח/מדד .</li>
		<li>יש לבצע תיקון הרקע של התמונה, ציור מעגל על אזור ריק, מדידת צפיפות משולב שלה או באמצעות הפקודה רקע תהליך/חיסור .</li>
		<li>לתאם צפיפות הנקודות סטנדרטי משולב עם כמות חלבון טעון, לקבל קו כיול (R2 ערכים לצורך כיול עקומות אמורה להסתיים 0.95).</li>
		<li>השתמש את עקומת כיול לשחזר את הריכוז של mRFP של כל נקודה הדגימה.</li>
		<li>חשב את ריכוז mRFP הנותרים בחלקים לא מאוגד. הערה: כדי להבטיח סגירת הנכון של המנגנון חשופה נקודה ו, לכן, נושא הממברנה כדי לחץ אחיד, הדק את הברגים על-ידי ביצוע ערכה חצה באלכסון, לאחר מכן, פתח את משאבת ואקום להדק את הברגים בצורה חזקה יותר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. נבג כלים להשתמש אוסף ולעשות שימוש חוזר
<ol><li>עבור מיחזור של הנבג הספוחה, לבצע שתי תגובות ספיחה של 2.0 x 109 מטוהרים נבגים עם 10 µg של xylanase GH10-XA מטוהרים או 10 µg של β GH3-XT מטוהרים-xylosidase, כמתואר בצעדים 1.1-1.3 (איור 6א).</li>
	<li>לאסוף את כדורי המכיל אנזים-הספוחה הנבגים, resuspend אותם ב- 50 µL המאגר אופטימלית assay אנזימטי התגובה (50 מ מ מאגר סודיום פוספט ב- pH 6.5; 2.48689 g/L נה2HPO4, 4.88991 g/L NaH2PO4), ומערבבים אותם יחד כדי לקבל תערובת 100 µL של נבגים adsorbing GH10-XA או GH3-XT.</li>
	<li>הוסף את המצע (5 מ"ג/מ"ל 4-O-methyl-d-glucuronod-xylan [MGX]) ותנו תגובות אנזים מתקיימים על h 16-65 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>Centrifuge את תערובת התגובה (למשך 15 דקות ב 13,000 x g) ולאחסן את תגובת שיקוע המכיל את המוצר תגובת האנזים.</li>
	<li>Resuspend בגדר ב 100 µL מאגר סודיום פוספט טריים 50 מ מ ב- pH 6.5 בנוכחות מצע חדש (MGX) (ראה תמונה 6B). הערה: כדי לספוח אנזים אחד או יותר, זה אפשרי כדי לספוח את שניהם יחד או אחד אחד באופן עצמאי. האפשרות השנייה מקלה על ניתוח כמותי של יעילות ספיחה, הפעילות של כל אנזים, המאפשר איזון stoichiometric של כל אנזים הדרוש עבור התגובות.</li>
</ol>

<ol><li>Felici, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+and+protein+display+on+the+surface+of+filamentous+bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Annual+Review%22%5BJournal%5D)">Peptide and protein display on the surface of filamentous bacteriophage.</a> Biotechnology Annual Review. 1, 149-183 (1995).</li>
<li>Cortese, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+biologically+active+peptides+using+random+libraries+displayed+on+phage%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Identification of biologically active peptides using random libraries displayed on phage.</a> Current Opinion in Biotechnology. 6, 73-80 (1995).</li>
<li>Sousa, C., Cebolla, A., de Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+metalloadsorption+of+bacterial+cells+displaying+poly-His+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides.</a> Nature Biotechnology. 14, 1017-1020 (1996).</li>
<li>Richins, R., Kaneva, I., Mulchandani, A., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradation+of+organophosphorus+pesticides+by+surface-expressed+organophosphorus+hydrolase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Biodegradation of organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase.</a> Nature Biotechnology. 15, 984-987 (1997).</li>
<li>Wu, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+immunogenic+epitopes+of+hepatitis+B+surface+antigen+with+hybrid+flagellin+proteins+by+a+vaccine+strain+of+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expression of immunogenic epitopes of hepatitis B surface antigen with hybrid flagellin proteins by a vaccine strain of Salmonella.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86, 4726-4730 (1989).</li>
<li>Newton, S. M., Jacob, C. O., Stocker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+to+cholera+toxin+epitope+inserted+in+Salmonella+flagellin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin.</a> Science. 244, 70-72 (1989).</li>
<li>Fischetti, V. A., Medaglini, D., Pozzi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gram-positive+commensal+bacteria+for+mucosal+vaccine+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Gram-positive commensal bacteria for mucosal vaccine delivery.</a> Current Opinion in Biotechnology. 7, 659-666 (1996).</li>
<li>Isticato, R., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spore+surface+display%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Spectrum%22%5BJournal%5D)">Spore surface display.</a> Microbiology Spectrum. 2 (5), (2014).</li>
<li>Ricca, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+vaccine+delivery+by+non-recombinant+spores+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 13, 115(2014).</li>
<li>McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bacillus+subtilis+assembly+and+functions+of+the+multilayered+coat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The Bacillus subtilis assembly and functions of the multilayered coat.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 33-44 (2013).</li>
<li>Knecht, L. D., Pasini, P., Daunert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+spores+as+platforms+for+bioanalytical+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bacterial spores as platforms for bioanalytical and biomedical applications.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 400, 977-989 (2011).</li>
<li>Isticato, R., Cangiano, G., De Felice, M., Ricca, E. Display of molecules on the spore surface. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIsticato%2C+R+%22Bacterial+Spore+Formers%3A+Probiotics+and+Emerging+Applications%22">Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications</a>. Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. , Horizon Bionsciences. Norfolk, UK. 193-200 (2004).</li>
<li>Sirec, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+%CE%B2-galactosidase+of+Alicyclobacillus+acidocaldaricus+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Adsorption of β-galactosidase of Alicyclobacillus acidocaldaricus wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 11, 100(2012).</li>
<li>Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+probiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacillus probiotics.</a> Food Microbiology. 28, 214-220 (2011).</li>
<li>Baccigalupi, L., Ricca, E., Ghelardi, E. Non-LAB Probiotics: Spore Formers. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaccigalupi%2C+L+%22Probiotics+and+Prebiotics%3A+Current+Research+and+Future+Trends%22">Probiotics and Prebiotics: Current Research and Future Trends</a>. Venema, K., Do Carmo, A. P. , Caister Academic Press. 93-103 (2014).</li>
<li>Cutting, S. M., Hong, H. A., Baccigalupi, L., Ricca, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Vaccine+Delivery+by+Recombinant+Spore+Probiotics%5BTitle%5D)+AND+%22International+Reviews+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Oral Vaccine Delivery by Recombinant Spore Probiotics.</a> International Reviews of Immunology. 28, 487-505 (2009).</li>
<li>Lee, S. Y., Choi, J. H., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+cell-surface+display%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microbial cell-surface display.</a> Trends in Biotechnology. 21, 45-52 (2003).</li>
<li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+display+of+recombinant+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores.</a> Journal of Bacteriology. 183, 6294-6301 (2001).</li>
<li>Huang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+delivery+of+antigens+using+adsorption+to+bacterial+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Mucosal delivery of antigens using adsorption to bacterial spores.</a> Vaccine. 28, 1021-1030 (2010).</li>
<li>Isticato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-recombinant+display+of+the+B+subunit+of+the+heat+labile+toxin+of+Escherichia+coli+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Non-recombinant display of the B subunit of the heat labile toxin of Escherichia coli wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 12, 98(2013).</li>
<li>Mattossovich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+xylan+by+recyclable+spores+of+Bacillus+subtilis+thermophilic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Conversion of xylan by recyclable spores of Bacillus subtilis thermophilic enzymes.</a> Microbial Cell Factories. 16, 218(2017).</li>
<li>Pesce, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+charge+and+hydrodynamic+coefficient+measurements+of+Bacillus+subtilis+by+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Surface charge and hydrodynamic coefficient measurements of Bacillus subtilis by optical tweezers.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 116, 568-575 (2014).</li>
<li>Donadio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+a+red+fluorescence+protein+adsorbed+on+wild+type+and+mutant+spores+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Localization of a red fluorescence protein adsorbed on wild type and mutant spores of Bacillus subtilis.</a> Microbial Cell Factories. 15, 153(2016).</li>
<li>Pan, J. G., Choi, S. K., Jung, H. C., Kim, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Display+of+native+proteins+on+Bacillus+subtilis+spores%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Display of native proteins on Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 358, 209-217 (2014).</li>
<li>Cutting, S., Vander Horn, P. B. Genetic analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCutting%2C+S+%22Molecular+Biological+Methods+for+Bacillus%22">Molecular Biological Methods for Bacillus</a>. Harwood, C., Cutting, S. , John Wiley & Sons. Chichester, UK. (1990).</li>
<li>Lanzilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Display+of+the+peroxiredoxin+Bcp1+of+Sulfolobus+solfataricus+probiotic+spores+of+Bacillus+megaterium%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Display of the peroxiredoxin Bcp1 of Sulfolobus solfataricus probiotic spores of Bacillus megaterium.</a> New Biotechnology. 46, 38(2018).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה ספיחה נבג הוא פשוט וברור מאוד. התגובה תלויה אך ורק ה-pH של המאגר התגובה ונמצא היעילות של ספיחה אופטימלית על ערכי pH חומצי (pH 5.0 או נמוכים יותר). ב- pH ניטראלי תנאים, היעילות של ספיחה נמוכה, על ערכי pH אלקליין, ספיחה עלולים להופיע. ספיחה אופטימלית מתקבל באמצעות אמצעי אחסון של µL 200 1.5 mL צינורות (או שמירה על יחס דומה) על נדנדה מטרף.
ספיחה מאוד הדוקה, שוטף באמצעות בופר ב- pH זהה של המאגר התגובה אינם גורמים כל שחרור של החלבונים הספוחה. שוטף עם מאגרי אלקליין עלול לגרום מינימלית (בד...

מערכות התצוגה מכוונים הצגת מולקולות פעילים ביולוגית על פני השטח של מיקרואורגניזמים ומציאת יישומים במגוון רחב של שדות, מן התעשייה כדי מנרב רפואיות וסביבתיות. בנוסף phages1,2 תאים שונים גראם שליליים וחיוביים - מינים3,4,5,6,7, נבגי חיידקים היו גם מערכות התצוגה כפי שהוצע על ידי שתי גישות8,9.
בגלל המבנה המיוחד שלה, כלומר הציטופלסמה מיובש מוקף על ידי סדרה של שכבות ההגנה10, הנבג מספקת מספר יתרונות על פני phage תא מבוססות התצוגה מערכות8,9. יתרון ראשון מגיע קיצוני החוסן והיציבות של נבגים על תנאי זה יהיה ברישול על כל שאר התאים10,11. אנטיגנים מוצגים נבג ואנזימים יציבים לאחר שהוארך אחסון בטמפרטורת החדר12 ולהגן עליהם מפני השפלה ב pH נמוך, טמפרטורות גבוהות13. יתרון נוסף של נבגים זה הביטחון של מינים רבים להיוות נבג. B. subtilis, נולד ב- clausii, נולד ב- coagulans, מספר מינים אחרים משמשים ברחבי העולם כמו פרוביוטיקה, היו בשוק לשימוש אדם או בעלי חיים במשך עשרות שנים14,15. רשומה בטיחות יוצאת דופן זו היא ברורה הדרישה כללי מערכת התצוגה משטח והיא הרלוונטיות, כאשר המערכת מיועדת לשימוש אדם או בעלי חיים16. שלישית, יתרון חשוב של מערכת התצוגה המבוסס נבג הוא כי אין לו מגבלות עבור הגודל המולקולה שצריך להיות חשופים. במערכות מבוססות phage, חלבון heterologous גדול עשוי להשפיע על המבנה capsid, בעוד מערכות מבוססות תא, זה עלול להשפיע על המבנה של הקרום או עשוי להגביל/לפגום ממברנה רוברטסונית שלב17. שכבות ההגנה המקיפה הנבג מורכב של חלבונים שונים יותר מ 7010 והם גמיש מספיק כדי לקבל חלבונים זרים גדולים ללא כל פגם מבנית ניכרת או תיפקודי8. בנוסף, עם שתי מערכות תצוגה מבוססי נבג, רוברטסונית ממברנה של החלבון heterologous אינו נדרש8,9. אכן, חלבונים heterologous או המיוצר בציטופלסמה אמא תא, התאספו על הנבג היא יצירת בציטופלסמה אותו או הספוחה8,ספורה בוגר9.
נבג התצוגה הושג בתחילה על ידי פיתוח מערכת גנטית להנדס את השטח נבג18. מערכת גנטית זו התבססה על אני) הבנייה של שילוב גנים בין קידוד גנטי את חלבון המעיל נבג (משמש כנשא) את קידוד גנטי החלבון להיות מוצג - הנוכחות של גנים ברמת השעתוק והתרגום מאותת אנדוגני ג'ין ישלוט הביטוי של פיוז'ן, ו- ii) שילוב של הגן chimeric על כרומוזום ה- B. subtilis להעניק יציבות גנטית. מגוון רחב של אנטיגנים ואנזימים הוצגו על ידי גישה זו רקומביננטי, שימוש שונים נבג פני שטח חלבונים נשאים, מכוון יישומים אפשריים שונים, החל חיסון הרירית biocatalyst, ביוסנסור, למצבה או כלי וביו-אנליטיות וואלידציה8,13.
לאחרונה, גישה שונה של תצוגת נבג כבר מפותחת19. המערכת השנייה היא nonrecombinant וכן על ספיחה ספונטנית, הדוק ביותר של מולקולות על פני השטח ספורה9. אנטיגנים19,20 ואנזימים13,21 הוצגו בצורה יעילה ו חשפו כי שיטה זו היא באופן משמעותי יעיל יותר האחד רקומביננטי. גישה nonrecombinant זו מאפשר את התצוגה של חלבונים ב- טופס מקורי20 , יכול לשמש גם עם בלוק, מוות נבגים19. מנגנון מולקולרי של ספיחה יש לא מלא הובהרו עדיין. את מטען שלילי, את hydrophobicity של הנבג הוצעו כמאפיינים הרלוונטיים עבור ספיחה13,19,22. לאחרונה, הוכח כי חלבון מודל, החלבון autofluorescent אדום (mRFP) של קורל Discosoma, כאשר הספוחה כדי הנבג, הצליחה לחדור דרך שכבות פני ההתאמה לשפות אחרות המעיל הפנימי23. אם הוכחו כנכונות חלבונים אחרים, לוקליזציה פנימי של החלבונים heterologous יכול להסביר את יציבות מוגברת כאשר הספוחה נבגים23.
במחקר שנערך לאחרונה, שני אנזימים ותזרז שני שלבים רצופים של הנתיב השפלה xylan הוצגו באופן עצמאי על נבגים של B. subtilis , כאשר מודגרות יחד, היו מסוגלים לבצע שני צעדים של השפלה21. נבגים שנאספו לאחר התגובה היו עדיין פעיל, יכולים להמשיך השפלה xylan על התוספת של המצע טריים21. גם אם הפסד של 15% של המוצר הסופי נצפתה ב התגובה השנייה21, שימושית של אנזימים הספוחה לתגובות יחיד, וכן רב שלבי, היא יתרון חשוב נוסף של מערכת התצוגה נבג.
פאן ואח24 דיווח גישה נוספים להצגת חלבונים heterologous על פני השטח נבג: חלבונים heterologous (חלבון endoglucanase ובטא-galactosidase אחד) המיוצר בתא אמא במהלך הנבגה היו באופן ספונטני עטוף במעיל נבג ויוצרים, ללא הצורך של הספק. מערכת תצוגה זו נבג נוספים היא שילוב של שתי הגישות שתוארו עד כה. אכן, זה רקומביננטי מאז החלבונים heterologous היו מהונדסים לבוא לידי ביטוי בתא אמא במהלך הנבגה, בזמן ההרכבה שלהם בתוך המעיל היה ספונטני ו, לכן, nonrecombinant24. עם זאת, היעילות של התצוגה של גישה זו נוספים נשאר להיות נבדק, לעומת שתי הגישות אחרים באמצעות אותם חלבונים heterologous.
בפרוטוקול הנוכחי אינו כולל את תהליכי הייצור נבג, טיהור, אשר היו תיאר בהרחבה במקום אחר24. זה כולל התגובה ספיחה, הערכת היעילות של ספיחה על ידי מיקרוסקופ דוט-סופג, זריחה, וכן מיחזור של אנזימים הספוחה עבור התגובה נוספים סיבובים.

<table><tbody><tr><td>0.1% תמיסת פולי-L-ליזין</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>0.45 ומיקרו; m ניטרוצלולוזה ספיגת ממברנה</td><td>Sartorius</td><td>M_Blotting_Membranes</td><td></td></tr><tr><td>100&פעמים; אובייקטיבי UPlanF1&nbsp;</td>ציוד <td></td><td>מיקרוסקופ</td> <td>אולימפוס</td></tr><tr><td>Bacillus subtilis&nbsp; זן NCIB3610</td><td>בצילוס מרכז מלאי גנטי</td><td>3A1</td><td></td></tr><tr><td>BD ACCURI C6 PLUS</td><td>BD</td><td>זרימה ציטומטר</td><td></td></tr><tr><td>BX51</td><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td></td><td>אולימפוס</td></tr><tr><td>בהירות</td><td>Biorad</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>DP70 מצלמה דיגיטלית</td> ציוד <td></td><td>מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td></tr><tr><td>עז אנטי ארנב IgG (H + L) נוגדן משני נספג צולב, FITC</td><td>תרמו פישר</td><td>F-2754</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב IgG H& L (HRP)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td></td></tr><tr><td>מונוקלונלי אנטי-פוליהיסטידין&מינוס; נוגדן פרוקסידאז</td><td>Sigma</td><td>A7058-1VL</td><td>המשמש לאיתור חלבונים נספגים המציגים תג 6xhistidine במסוף C- או N-&nbsp;</td></tr><tr><td>SecureSlip&nbsp; כיסוי זכוכית</td><td>Sigma</td><td>S1815-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Superwhite שקופיות מיקרוסקופ לא טעון</td><td>VWR</td><td>75836-190</td><td></td></tr><tr><td>U-CA מחליף הגדלה&nbsp;</td>ציוד <td></td><td>מיקרוסקופ</td> <td>אולימפוס</td></tr></tbody></table>

נבג ספיחה כמערכת התצוגה nonrecombinant אנזימים ו אנטיגנים

Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens

הנבג החיידק הוא תא סמויה השבתה הדרגתית, שהוקמה על ידי סדרה של שכבות ההגנה המקיפה של הציטופלסמה מיובש. מבנה משונה זה גורם הנבג יציב ועמיד מאוד והציע את השימוש הנבג כפלטפורמה להצגת מולקולות heterologous. עד כה, מגוון רחב של אנטיגנים ואנזימים הוצגו על נבגים של Bacillus subtilis ושל כמה מינים אחרים, בתחילה על ידי בגישה רקומביננטי ואז, בשיטה nonrecombinant פשוטה ויעילה. מערכת התצוגה nonrecombinant מבוסס על ספיחה ישירה של מולקולות heterologous על פני השטח נבג, הימנעות הבנייה של זנים רקומביננטי על שחרורו של חיידקים מהונדסים לסביבה. מולקולות הספוחה התייצב, מוגן על ידי האינטראקציה עם נבגים, אשר מגביל את ההתדרדרות המהירה של אנטיגנים ואובדן של פעילות אנזים-התנאים שלילי. ברגע מנוצל, אנזימים נבג-הספוחה ניתן לאסוף בקלות עם ירידה מזערית של פעילות ולהשתמש בהם שימוש חוזר לביקור נוסף תגובה. נייר זה מוצג כיצד לספוח מולקולות דגם מטוהרים נבגים של B. subtilis, כיצד להעריך את היעילות של ספיחה וכיצד לאסוף את הנבגים בשימוש כדי למחזר אותם לתגובות חדשות.

ספיחה מוצלח יכול להיות מוערך על ידי סופג המערבי. על התגובה, התערובת fractionated על ידי צנטריפוגה, שטף, ו השבר גלולה (איור 1) משמש כדי לחלץ את החלבונים משטח. התמצית fractionated על ידי מרחביות לזיהוי בג'ל (עמוד), electrotransferred את קרום פלואוריד (PVDF) polyvinylidene, מחתה כנגד נוגדנים ראשיים ומשניים. נוכחותם של חלבונים של גודל הצפוי, רק בנתיב נטען עם תמצית של נבגים הספוחה, היא מעידה על תגובה ספיחה מוצלחת (איור 2א</str...

פרוטוקול זה מתמקד בשימוש של נבגי חיידקים ככלי nanobiotechnological "חי" כדי לספוח את מולקולות heterologous עם פעילויות ביולוגיות שונות. המפה מראה גם השיטות כדי למדוד את היעילות של ספיחה.

נבג ספיחה כמערכת התצוגה Nonrecombinant אנזימים ו אנטיגנים

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure ...

נבגים חיידקיים חיים המציגים אנטיגן או אנזימים הם חלקיקים פעילים מבחינה תפקודית שיכולים לשמש כחיסונים נגד ריר או ביו-קטריטיים. באופן עקרוני, כל חלבון יכול להיות ספיס ביעילות נבגים. טכניקה זו היא פשוטה ואינו דורש כל מניפולציה גנטית.לכן, אין שחרור של אורגניזמים רקומביננטיים לסביבה מעורב. בנוסף לחיסון ריר לבני אדם ובעלי חיים, נבגים המציגים אנזימים יכולים להיות מפותחים כמו biocatalyzers לשימוש חוזר. התחל על ידי תיוג פעמיים 10 כדי התשיעי B.subtilis פראי סוג נבגים מטוהרים עם שניים-חמישה או 10 מיקרוגרם ריכוזים של דגם RFP ב 200 microliters של חיץ מחייב בתוספת 50 מילימולר נתרן ציטראט במשך שעה אחת ב 25 מעלות צלזיוס על שייקר נדנדה.בסוף הדגירה, גלולה תערובות מחייב על ידי צנטריפוגה, ולהעביר את supernatants לתוך צינורות חרוט חדשים לניתוח יעילות פיחה הבאים. לאחר מכן, לשטוף את כדורי הנבג פעמיים עם 200 microliters של חיץ מחייב לכל לשטוף, resuspending כדורי ב 100 microliters של חיץ קשירה טרי לאחר לשטוף השני. להפקת חלבון פני השטח, יש להוסיף 50 מיקרוליטרים של כל נגר ספולקט ל-50 מיקרוליטרים של 2X נתרן דודציל סולפט-דיתיותריתול כדי לבודד את חלבוני הנבגים על פני השטח.לאחר 45 דקות ב 65 מעלות צלזיוס, לאסוף את תערובות על ידי צנטריפוגה, ולהפעיל 10 microliters של כל נפח של חלבונים שחולצו על טבעי על כתם מערבי, באמצעות נוגדן חד שבטי אנטי שלו מזהה את התג שלו נוכח N-terminus של mRFP כדי לזהות את החלבונים משטח שכותרתו. כדי לאתר ולכומת את המולקולות הסחוטות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, הוסף חמישה מיקרוליטרים של הנגר המפושט ל-95 מיקרוליטרים של PBS, והוסף חמישה מיקרוליטרים של כל מתלה שנוצר על מגלשות מיקרוסקופ בודדות. מניחים כיסוי פולי-L-לינזין מטופל על כל שקופית, ומ מניחים שקופית אחת על שלב מיקרוסקופ פלואורסצנטי.לאחר מכן, עבור כל שדה, שמור את תמונות המיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה ופילואורסצנטיות. לניתוח תמונה, פתחו את תמונות המיקרוסקופיה הפלואורסצנטיות ב-ImageJ ובחרו 'תמונה' ו'כתב' כדי לאשר שכל התמונות הן בתבנית של שמונה סיביות. מתפריט 'ניתוח', בחרו 'קבע מידות' ואשרו שנבחרו 'אזור', 'דחיסות משולבת' ו'ערך אפור ממוצע'.השתמש בכלי ציור או בחירה כדי לצייר קו סביב הנבג של עניין, ובחר למדוד מתפריט ניתוח. תופיע תיבה מוקפצת עם ערימת ערכים עבור הנבג שנבחר. לאחר שנבחרו לפחות 50 נבגים, בחר מספר אזורים ללא נבגים וחזור על המדידה כדי לקבל קריאה עבור פלואורסצנטיות הרקע.לאחר קבלת מספר מדידות רקע, העתק את כל הנתונים בחלון התוצאות לגיליון אלקטרוני וחשב את ממוצע הצפיפות המשולבת באזור הנבגים שנבחרו ואת ערכי הפלואורסצנטיות ברקע כדי לקבל את הפלואורסצנטיות הכוללת לכל תא מתוקן. להערכת יעילות פיח עקיפה, בצעו שישה דילולים סדרתיים כפולים של mRFP מטוהר בריכוז של 0.5 ננוגרם למיקרוליטר לנפח סופי של 250 מיקרוליטרים לדילול מחייב חיץ ומספר ניסיוני מתאים של דילול טורי כפול של 100 מיקרוליטרים של כל מדגם על-טבעי שמור המכיל את שבר ה- mRFP הלא מאוגד של תגובת הפילחות עם 100 מיקרוליטרים של מאגר כריכה לדילול. לאחר מכן, לחתוך קרום nitrocellulose עם ניתוק 0.45 מיקרומטר לגודל של תשעה על 10 ס"מ, כדי לכסות את חמש מדגם על שש נקודות של דילול שטח מבלי להרחיב מעבר לקצה אטם של מנגנון כתם נקודה.מניחים את קרום prewet ב מכשיר כתם נקודה. בדוק את הגודל הנכון של הממברנה, ולהסיר את כל בועות האוויר לכודים בין הממברנה ואת אטם. להרכיב את מנגנון כתם נקודה כפי שתואר על ידי היצרן, ולכסות את החלק שאינם שימוש של המנגנון כדי למנוע אוויר לנוע דרך בארות אלה.כאשר המנגנון מוכן, לטעון את התקן בשני הנתיבים החיצוניים ביותר ואת הדגימות בנתיבים האמצעיים עם 100 microliters של כל דילול מתאים לכל באר. לאחר שכל הדגימות נטענו, הפעל את משאבת הוואקום במשך שתי דקות, לפני עצירת הוואקום ואיפשר לדגימות לסנן דרך הממברנה בכוח הכבידה. לאחר 10 דקות, לשטוף כל באר עם 100 microliters של PBS.תריץ את משאבת הוואקום לחמש דקות נוספות. כאשר מאגר הכביסה התנקז לחלוטין מהמוקטר, בעוד הוואקום דול, שחרר את הברגים ופתח בזהירות את מנגנון כתם הנקודות. לאחר מכן, לעבד את הממברנה על פי פרוטוקולים כתם מערבי סטנדרטי.לניתוח דנסיטומטרי של המסנן, פתחו את ImageJ ושרטטו כל נקודה כדי למדוד את הצפיפות המשולבת באמצעות הפקודה 'נתח', 'מדידה' כפי שהוכח. כדי לבצע תיקון רקע של התמונה, צייר עיגול באזור ריק ולמדוד את הצפיפות המשולבת שלו כפי שהוכח. לתאם את הצפיפות המשולבת של הנקודות הסטנדרטיות עם כמות החלבון הטעון כדי להשיג קו כיול, ולהשתמש בעקומת הכיול כדי לשער את ריכוז ה- mRFP של כל נקודה לדוגמה.לאחר מכן ניתן לחשב את ריכוז ה- mRFP שנותר בשברים הלא מאוגדים. נוכחותם של חלבונים בגודל הצפוי רק בנתיבים עמוסים בתמצית של הנבגים המפולסים מעידה על תגובת ספיחים מוצלחת. הערכה ישירה של יעילות הספגוע תלויה בחלבון ההטרולוגי ששימש ונוכל להתבצע על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וציקטופלורימטריה של שבר גלולה לאחר השבר של תגובת הספח.לכמת את אותות הפלואורסצנט הקיימים על נבגים ניתן לבצע באמצעות ImageJ כפי שהוכח. ניתוח עקיף של יעילות ספיגת יכול להתבצע על ידי ניתוח כתמי נקודה של השבר העל-טבעי המכיל את החלבון הלא מאוגד, וניתוח צפיפות עוקב של החלבון הלא מאוגד מאפשר חישוב עקיף של כמות החלבון ששופך על הנבגים. אמנם, באופן עקרוני, כל חלבון יכול להיות סחוף לשימוש כמו חיסונים ריר או biocatalysts, בפועל את היעילות של סחוף תלוי באתרי החלבון ואת המאפיינים הכימיים.

spore-adsorption-as-nonrecombinant-display-system-for-enzymes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

תצוגת הפאג היא טכניקה רבת עוצמה כדי ללכוד חלבונים או moieties חלבון הפועלים באינטראקציה עם מולקולה משותקת של עניין. ברגע שהחלטה מהסוג של ספריית cDNA הפאג ליצור והמסך נעשתה, הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר בחירת זיקה יעילה שמוביל לזיהוי של interactors.

פרוטוקול לתצוגת הפאג וזיקה בחירה באמצעות פיתיונות חלבון רקומביננטי

התקשרות חיידקית לתאי מארח היא שלב מפתח במהלך קולוניזציה וזיהום של המארח. פרוטוקול זה מתאר את הייצור של הידבקויות רקומביננטיות מצומדות פולימר כחומרים ביומימטיים המאפשרים ניתוח של תרומתם של הידבקויות בודדות לתהליכים אלה, ללא תלות בגורמים חיידקיים אחרים.

חומרי Biomimetic לאפיין אינטראקציות חיידקים-מארח

אנו מספקים שיטה לסינון בו-זמנית של ספרייה של שברי נוגדנים לזיקה קשירה ומסיסות ציטופלזמית על ידי שימוש במסלול הטרנסלוקציה של Escherichia coli Twin-arginine, שיש לו מנגנון בקרת איכות מובנה לקיפול חלבון תוך תאי, כדי להציג את שברי הנוגדנים על הממברנה הפנימית.

Inner-קרום חיידקי תצוגה להקרנת ספרייה של שברי נוגדן

ספריות התצוגה חיידקי Biopanning היא טכניקה מוכחת על גילוי של פפטיד זיקה ריאגנטים, אלטרנטיבה איתנה נוגדנים. בשיטת המיון האוטומטי למחצה בזאת יש יעיל biopanning כדי להקטין את המופע של תוצאות חיוביות שגויות. כאן אנו ממחישים את התהליך המחשבתי וטכניקות מתבצעת הערכת המועמדים וצמצום ניתוח במורד הזרם.

Biopanning חצי אוטומטי של התצוגה חיידקי ספריות פפטיד זיקה ריאגנט גילוי וניתוח של מבודד וכתוצאה מכך

טכניקה הרומן לתצוגה מהירה אנטיגן על משטח חיידקי מוצג, שיכלול משטח biotinylation ואחריו חשיפה חלבונים עניין בפיוז'ן עם אבידין monomeric. טעינת BCG עם אנטיגנים שנבחר בהצלחה משפר את immunogenicity שלה, רומז כי הקליגרפיות יכול להחליף את הגישות המסורתיות גנטי.

ביטוי של אנטיגנים אקסוגני חיסון ה-BCG Mycobacterium חיידקי סטרפטקוקוס בוביס דרך קישוט משטח שאינו גנטי עם מערכת אבידין-ביוטין

כאן אנו מציגים שיטה לבחור עבור גרסאות הרומן של E. coli biotin-חלבון ליגאז בירה כי הביוטיטים מטרה מסוימת פפטיד. הפרוטוקול מתאר את בניית הפלסמיד לתצוגה החיידקית של פפטיד היעד, הדור של ספריית בירה, בחירה ואפיון של משתני בירה.

התצוגה פפטיד בקטריאלי לבחירת הרומן הביוטילדירוג אנזימים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הביו-הנדסה של שלפוחיות הממברנה החיצונית כפלטפורמת חיסון "Plug-and-Display", כולל ייצור, טיהור, ביו-קונגציה ואפיון.

פלטפורמת חיסון ננו-חלקיקים "plug-and-display" המבוססת על שלפוחיות ממברנה חיצוניות המציגות תחום קשירת קולטן SARS-CoV-2

פרוטוקול זה מתמקד בשימוש בציטומטריית זרימה וספירת חרוזים כדי לכמת נבגי חיידקים המסומנים באתידיום ברומיד. השיטה יעילה גם לניתוח הצימוד הקוולנטי של חלבונים על פני השטח של נבגים שלמים.

שיפור של Bacillus subtilis ספירת נבגים וניתוח תוויות בציטומטריית זרימה

פרוטוקול זה מתאר את השלבים החיוניים לביצוע קמפיינים לבחירת פני השטח של שמרים להעשרת וריאנטים חלבוניים הנקשרים לאנטיגן מעניין.

הנדסת חלבונים על ידי תצוגת פני שטח שמרים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש במצעים המוצגים על פני השטח של שמרים לבדיקות שינוי אנזימטיות. הפלטפורמה הודגמה באמצעות ניתוח פעילות הדפוספורילציה של טירוזין פוספטאז SHP-2 כנגד אחד המצעים שלו כבדיקת שינוי אנזימטי מייצגת.

שינוי אנזימטי והערכת ציטומטריית זרימה של חלבונים המוצגים על פני השטח של שמרים

למד שיטה לספיחת חלבונים לנבגי חיידקים ללא מניפולציה גנטית. טכניקה זו מאפשרת פיתוח חיסוני ריריות וביוקטליזטורים ניתנים לשימוש חוזר בבטיחות סביבתית.

נבג ספיחה כמערכת התצוגה Nonrecombinant אנזימים ו אנטיגנים

גלה סרטונים נוספים