אינדוקציה והבקיע של מחלת השתל מול מארחים ב מודל Murine מורה Xenoic ו כימות האדם תאים T ברקמות העכבר באמצעות PCR דיגיטלי

פרוטוקול זה מתאר כיצד לגרום למחלת קסנוגרפט מול מארח, או xenoGVHD, וכיצד לעוור ולתקנן ניקוד קליני כדי להבטיח תוצאות עקביות. מודל xenoGVHD מספק שיטת in vivo לבדיקת טיפולים מדכאי חיסון נגד תאים אנושיים ולא מורין T, שיפור התרגום של מחקרים אלה למרפאה. הפגנת ההליך תהיה אמארה סנג, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי.

יום אחד לפני ההזרקה, מקום שמונה עד 12 שבועות, לא שמנים סוכרתית scid גמא, או NSG, עכברים בכלוב עוגה מעקר, ולהקרין את העכברים במקור צסיום-137 עם מנה כוללת של 150 centigrays, עם סיבוב איטי כדי להבטיח הקרנה אפילו. לאחר מכן, מניחים את העכברים בכלובים נקיים בארון ביו-בטיחות סטרילי בן לילה. למחרת בבוקר, לאסוף מספיק דם אנושי בריא כדי לבודד 1.1 פעמים 10 לשבעה תאים mononuclear דם היקפי, או PBMCs, לכל עכבר, ולדלל את הדם heparinized בנפח שווה של 2% נסיוב בקר עוברי, או FBS, ב PBS.

בזהירות כיסוי עד 25 מיליליטר של הדם מדולל על 15 מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות הפרדת לימפוציטים בצינור חרוט 50 מיליליטר עבור צנטריפוגה שיפוע צפיפות. בסוף ההפרדה, לקצור את PBMC בממשק, ולשטוף את התאים ב 10 מיליליטר של PBS בצינור חרוט חדש 50 מיליליטר. שאפו את העל-טבעי, והניפו את הצינור כדי לשחרר את גלולת הכדור.

תן שימוש חוזר ב-PBMCs ב-10 מיליליטר של PBS טרי לצנטריפוגה נוספת, ולאחר מכן יהיה שימוש חוזר בחמישה מיליליטר של PBS טרי לספירה. לאחר מכן, לאסוף את התאים עם צנטריפוגה סופית, ו להשתמש שוב את גלולה באחת פעמים 10 לשמונה PBMCs למיליליטר של ריכוז PBS. למסירה רטרו-מסלולית של PBMC האנושי המבודד לתוך עין העכבר, לטעון מזרק אחד מיליליטר מצויד מחט 28-מד עם 100 microliters של תאים.

אשר חוסר תגובה לצביטת בוהן, ורסן בעדינות את העכבר באמצעות האגודל והאצבע האמצעית. הכנס את המחט בצד משופע למטה, צדדי לתוך canthus המדיאלי, דרך קרום הלחמית עד החלק האחורי של העין הוא הגיע. מעט לסגת המחט, לאט להזריק את כל נפח התאים.

לאחר מכן, לסגת לחלוטין את המחט לסילוק נאות של המזרק והמחט. סגור את העפעף, ולהחיל לחץ קל על אתר ההזרקה עם ספוג גזה. לאחר מכן, בדקו את אתר ההזרקה לנפיחות או לטראומה גלויה אחרת, ואפשרו לעכבר לחזור להכרה בכלוב סטרילי מרופד במגבות נייר וניטור לפני העברת החיה לכלוב הביתי שלה.

כדי למדוד את ציון GVHD, מניחים את הכלוב במכסה המנוע של זרימה למינארית, ומסירים את המזון והמים מהכלוב. כדי להבקיע את הפעילות, להתבונן בהתנהגות של העכברים במשך חמש דקות. כדי לקבל ציון הרזיה, לשקול כל עכבר ב זכוכית.

בזמן שהעכבר עדיין בגוון, בדוק אם החיה יציבה, מרקם פרווה ושלמות העור. לאחר קצירת הרקמות של עניין, לחתוך כ 3 על 0.5 מילימטר חתיכת רקמה מהאיבר, ולשקול את המדגם על איזון. מעבירים את הרקמה המשוקללת לצינור סטרילי של 1.5 מיליליטר, ומקפיאים את הדגימה בחנקן נוזלי לאחסון לילה במינוס 80 מעלות צלזיוס.

למחרת בבוקר, להפשיר את הדגימות לפני תמיסת, על פי ההוראות של ערכת בידוד DNA גנומי. לכימות תאי T אנושיים על ידי תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלית, או PCR, הכינו תגובות PCR דיגיטליות בהתאם לפרוטוקול לצבעי קשירה לדנ"א עבור מכונת PCR הדיגיטלית המשמשת ושימוש בפרימרים המתאימים לדנ"א גנומי EPSILON של CD3 אנושי. לאחר מכן, לבצע את תגובת PCR דיגיטלית תחת תנאי התגובה המתאימים.

Sublethally מוקרן שמונה עד 12 שבועות עכברי NSG משני המינים המקבלים PBMC אנושי להתחיל להציג סימנים קליניים של GVHD סביב היום 10 לאחר הזרקה לעומת עכברי שליטה שלילית שטופלו PBS בלבד. עכברי XenoGVHD יש הישרדות חציונית של 23.5 ימים. באמצעות PCR דיגיטלי, CD3 אפסילון חיובי תאי T אנושיים ניתן לזהות את דגימות הריאה והכבד של עכברים המקבלים מחשבים אנושיים.

זה קריטי כי הניקוד מבוצע באופן עקבי, כי החוקר ניקוד העכברים עיוור לטיפול שלהם. בעקבות הליך זה, סרום ניתן לאסוף מעכברים המתת דם לניתוח ביטוי ציטוקינים היקפיים, ותאי החיסון ניתן לאסוף מן הטחול לניתוח באמצעות ציטומטריה זרימה.