Name: ניתוח של ספיגת Endocytic ותעבורה רטרוגרדית לרשת הטרנס-גולגי באמצעות Functionalized Nanobodies בתאים בתרבית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: חקור תעבורה רטרוגרדית של חלבונים לרשת הגולג'י באמצעות ננו-אנטיבודים פונקציונליים בתאי HeLa. שיטה זו מאפשרת ניתוח ביוכימי מדויק של דינמיקת ממברנות ושמירה על הומאוסטזיס תאי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי גרנט 31003A-162643 על ידי קרן המדע הלאומית השוויצרית. אנו מודים ניקול Beuret, את Biozentrum הדמיה הליבה מתקן (IMCF) לקבלת תמיכה.

המחברים אין לחשוף.

Nanobodies מייצג את שיעור המתעוררים של חלבון פיגומים קלסר עם יתרונות רבים על פני נוגדנים קונבנציונלי: הם קטנים, יציבה, monomeric, ניתן לבחור עבור דיסולפידי זיקה וחוסר גבוהה אג ח33,35, 44 , 45. הם משמשים במספר יישומים, כגון מערכות התרבות תאים, אורגניזמים ב ביולוגיה התפתחותית46,47,48,<sup clas...

תנועה רטרוגרדית של חלבונים ושומנים מפני השטח תא אל תאי תאיים שונים הוא קריטי עבור תחזוקה של הומאוסטזיס ממברנה לאזן את הפרשה, למחזר מרכיבי anterograde תחבורה machineries1 , 2. בעקבות הפנמה דרך אנדוציטוזה clathrin תלוית או - עצמאית, חלבונים, שומנים בדם מטען קודם לאכלס מוקדם endosomes מהיכן שהם נמצאים רחוק הופנה גם לאורך מערכת אנדו-lysosomal, ממוחזר כדי קרום פלזמה, . או יישוב לרשת הטרנס-גולג'י (TGN). מיחזור endosomes ו/או על פני התא כדי TGN זה חלק מהמחזוריות פונקציונלי של מספר anterograde מטען transmembrane רצפטורים, כגון הקטיון תלוית ועצמאי הקטיון מנוז-6-פוספט הקולטנים (CDMPR ו- CIMPR) אספקת לאחרונה מסונתז hydrolases lysosomal מ TGN endosomes מאחר lysosomes3,4,5, sortilin,6,SorLA7ושל Wntless (WLS) הובלת ונ ט ליגנדים השטח תא 8 , 9 , 10 , 11. לחלבונים אחרים לאחזר לחזור TGN TGN46 הינם שלו קשורים איזופורמים12,13,14, מלכודות (מסיס N- ethylmaleimide רגיש פיוז'ן גורם מצורף קולטנים) 15 , 16 , 17, קודמן עמילואיד חלבון (APP)18,19, ankylosis מתקדמת (תודה) חלבון20, מובילי מתכת כגון ATP7A/B או DMT121,22, ו transmembrane עיבוד אנזימים כולל קרבוקסיפפטידאז D, furin או BACE123,24,25. מלבד אלה חלבונים אנדוגני, רעלים בקטריאלי, צמח (למשל, טוקסין שיגה, כולרה, ריצין ו abrin) לחטוף machineries רטרוגרדית תחבורה כדי להגיע לחדר מיון לשם retrotranslocation לתוך ציטוזול26,27, 28,29.
על מנת לנתח ישירות רטרוגרדית התנועה, קודם לכן פיתחנו ערכת כלים מבוססי nanobody תווית ולעקוב אחר מטענים חלבונים מהמשטח תא תאיים תאים30. Nanobodies לייצג משפחה חדשה של קלסרים חלבון נגזר homodimeric כבד שרשרת-בלבד נוגדנים (hcAbs) המתרחשים באופן טבעי31,של גמליים ודגים סחוס-32. הם מהווים תחום שרשרת כבדה (VHH) משתנה של hcAbs ויש להם יתרונות רבים קונבנציונאלי נוגדנים (למשל, IgGs): הם monomeric, קטן (~ 15 kDa), מסיס מאוד, ללא, אגרות דיסולפידי יכול להיות מבוטא bacterially, ונבחר גבוהה-זיקה מחייבת33,34,35,36. כדי להפוך את כלי nanobody שלנו רב-תכליתי וישימים בקנה מידה נרחב, אנחנו מועסקים nanobodies נגד functionalized-GFP חלבונים פני תווית ולעקוב המתויגת GFP שלהם בתחום חוץ-תאית/lumenal. על ידי functionalization של nanobodies עם mCherry, ascorbate peroxidase 2 (APEX2) תחבורה רטרוגרדית37, או טירוזין sulfation (TS) רצפים, בוטרפליי מטען transmembrane חלבונים ניתן לנתח הכתיב קבוע ולחיות הדמיה תא, על-ידי מיקרוסקופ אלקטרונים, או מבחינה ביוכימית. מאז sulfation טירוזין מתווכת על-ידי sulfotransferases tyrosylprotein (TPST1 ו- TPST2) הוא שינוי posttranslational מוגבלת של הטרנס-גולג'י/TGN, ישירות שלומדים תחבורה, קינטיקה של חלבונים עניין מהמשטח התא הזה תאיים גולג'י תא38,39,40.
במאמר שיטות, נתאר את הקלות של ייצור של nanobodies functionalized (VHH-2xTS-APEX2, - mCherry נגזרים) מתאים עבור מספר יישומים כדי לנתח תחבורה רטרוגרדית תאים בתרבית של30. אנו מתמקדים בעיקר על השימוש של TS באתר-השתנה nanobody עבור ניתוח של התעבורה תאיים מהמשטח תא התא של sulfation.

<table><tbody><tr><td>נוגדן נגד GFP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>118144600001</td><td>המוצר מופץ על ידי Sigma-Aldrich, אך מיוצר על ידי Roche</td></tr><tr><td>Anti-His6 נוגדן</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>A190-114A</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד אקטין</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0545</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד עכבר HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0168</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>מומס ב-1x PBS/1% BSA</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>Applichem</td><td>A3672</td><td></td></tr><tr><td>D-biotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501</td><td>מומס בסטרילי 500 מ"מ NaH2PO4 or DMSO</td></tr><tr><td>5-aminolevuilnic acid (dALA) הידרוכלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A3785</td><td>מומס במים סטריליים</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Applichem</td><td>A3778</td><td>מומס במים סטריליים</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18037059001</td><td>המוצר מופץ על ידי Sigma-Aldrich, אך מיוצר על ידי Roche</td></tr><tr><td>Brefeldin A (BFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5936</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pr-1</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Bioconcept</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Applichem</td><td>A3704</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s שונה Eagle' s בינוני (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי (FCS)</td><td>Biowest</td><td>S181B-500</td><td></td></tr><tr><td>גופרית-35 בצורת נתרן גופרתי</td><td>מוצר Hartmann Analytics</td><td>ARS0105</td><td>מכיל 5 mCi</td></tr><tr><td>מלחים מאוזנים של ארל</td><td>תמיסת חומצות אמינו Sigma-Aldrich</td><td>E6267</td><td></td></tr><tr><td>MEM (50x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5550</td><td></td></tr><tr><td>MEM תמיסת ויטמין (100x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, קוקטייל מעכב מיני פרוטאז</td><td>מוצר Sigma-Aldrich</td><td>11836153001</td><td>מופץ על ידי Sigma-Aldrich, אך מיוצר על ידי Roche</td></tr><tr><td>Isopropyl-&beta;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Applichem</td><td>A1008</td><td>מומס במים סטריליים, המלאי הוא 1 M</td></tr><tr><td>מלח דיסודיום קרבניצילין</td><td>Applichem</td><td>A1491</td><td>מומס במים סטריליים, המלאי הוא 100 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>קנמיצין סולפט</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td>מומס במים סטריליים, המלאי הוא 100 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>Coomassie-R (כחול מבריק)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-0149</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Applichem</td><td>A3813</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Ni Sepharose High Performance</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5268-01</td><td></td></tr><tr><td>עמודות GraviTrap שלו GE</td><td>Healthcare</td><td>GE11-0033-99</td><td></td></tr><tr><td>ערכת החיץ שלו</td><td>GE Healthcare</td><td>GE11-0034-00</td><td></td></tr><tr><td>עמודי התפלה חד פעמיים PD10</td> GE <td>Healthcare</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל Mini-Protean TGX, 4-20%, 15 בארות</td><td>ביו-ראד</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>דולבקו s תמיסת מלח חוצצת פוספט (DPBS) עם Ca2+/Mg2+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 35 מ"מ</td><td>פלקון</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>6 בארות</td><td>TPP</td><td>92406</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית (מס' 1.5H)</td><td>VWR</td><td>631-0153</td><td></td></tr><tr><td>פנילמתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF)</td><td>Applichem</td><td>A0999.0025</td><td>מומס ב-40% DMSO 60% איזופרופנול, מלאי ב-500 מ"מ</td></tr><tr><td>טריפטון</td><td>Applichem</td><td>A1553</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>Applichem</td><td>A1552</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידרט</td><td>Merck Millipore</td><td>105833</td><td>מומס במים סטריליים, המלאי הוא 1 M</td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידרט</td><td>Merck Millipore</td><td>102382</td><td>מומס במים סטריליים, המלאי הוא 1 M</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Merck Millipore</td><td>106404</td><td>מומס במים סטריליים, המלאי הוא 5 M</td></tr></tbody></table>

ניתוח של ספיגת endocytic ותעבורה רטרוגרדית לרשת הטרנס-גולג'י באמצעות functionalized nanobodies בתאים בתרבית

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

הובלה של חלבונים וממברנות מהמשטח תא גולג'י ומעבר חיוני הומאוסטזיס, זהות אברון, פיזיולוגיה. ללמוד תנועה רטרוגרדית חלבון, לאחרונה פיתחנו ערכת כלים מגוונים מבוססי nanobody לנתח תחבורה מהמשטח תא למתחם גולג'י, או על ידי תא קבוע ולחיות הדמיה, באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, או מבחינה ביוכימית. אנחנו מהונדסים חלבון פלואורסצנטי ירוק אנטי functionalized (GFP) nanobodies — חלבון קטן, monomeric, גבוהה-זיקה קלסרים — כי ניתן להחיל על שורות תאים לבטא קרום חלבונים עניין עם moiety-GFP חוץ-תאית. Nanobodies derivatized קשור הכתבים GFP במיוחד הם הפנימו והועברו קמח לאורך נתיבי המיון של הכתבים. Nanobodies היו functionalized עם fluorophores בצע תחבורה רטרוגרדית על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ ולחיות הדמיה, עם ascorbate peroxidase 2 (APEX2) לחקור לוקליזציה ultrastructural של מתחמי כתב-nanobody על ידי אלקטרון מיקרוסקופ, ועם טירוזין מוטיבים sulfation (TS) כדי להעריך קינטיקה של טרנס-גולג'י רשת (TGN) הגעה. במאמר מתודולוגי, אנחנו חלוקה לרמות ההליך כללי bacterially אקספרס ולטהר functionalized nanobodies. אנו מדגימים את השימוש כלי שלנו באמצעות את nanobodies mCherry - ו TS-השתנה כדי לנתח ספיגת endocytic ואת ההגעה TGN של חלבונים מטען רב עוצמה.

לחקור חלבונים רטרוגרדית תחבורה ליעדים תאיים שונים, הקמנו לאחרונה כלי מבוסס-nanobody anti-GFP כדי תווית ובצע פיוז'ן רקומביננטי חלבונים מן השטח תא30. . הנה, נדגים לייצור חיידקים כגון derivatized nanobodies ומדגימים את היישום שלהם ללמוד ספיגת endocytic על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, immunoblotting, כמו גם השימוש שלהם כדי לחקור את ההגעה TGN על ידי ניתוח sulfation. היישום האחרון הוא המוקד מתודולוגי של פרוטוקול זה.
<p class="jove_content" fo:keep-together.withi...

העברת רטרוגרדית חלבונים מהמשטח תא גולג'י הוא חיוני כדי לשמור על הומאוסטזיס ממברנה. כאן, אנו מתארים שיטה לנתח מבחינה ביוכימית תא השטח-כדי-גולג'י הובלה של חומרים באמצעות functionalized nanobodies בתאים הלה.

ניתוח של ספיגת Endocytic ותעבורה רטרוגרדית לרשת הטרנס-גולג'י באמצעות Functionalized Nanobodies בתאים בתרבית

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

שיטה זו מאפשרת ייצור ויישום של חיידקים מבוטאים, ננו-גופים פונקציונליים לנתח הובלת חלבון מדרדר מפני השטח של התא לתאים בין תאיים. במיוחד רשת טרנס-גולגי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא השימוש בגופרית. שינוי ספציפי מאוד, ממודר ורגיש לאחר התרגום כדי להעריך את הגעתו המורכבת של הכתב ננו-גוף לתא DTN. שיטה זו בשילוב עם ננו-גופים נגזרים אחרים להדמיית תאי חיים ומיקרוסקופיית אלקטרונים יכולה לשמש גם לחקר תהליכים אנדוציטיים של קולטני פני תאים הקשורים למחלות. הרפרטואר שלנו של ננו-גופים פונקציונליים תוכנן לחקור תחבורה מדרדרת בתאים מתורבתים. עם זאת, כלים אלה עשויים להיות מיושמים גם באורגניזמים רב תאיים. כדי להתחיל בהליך זה, לבחור מושבה חיידקית המכילה את הווקטור של עניין מהצלחת לחסן בקבוק המכיל 20 מיליליטר של בינוני LB בתוספת אנטיביוטיקה. דגירה לילה בגיל 37

analysis-endocytic-uptake-retrograde-transport-to-trans-golgi-network

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

סרטון זה מדגים שיטה לחקר קליטה והובלה לאחור של ננו-גופים פונקציונליים כדי להבין את מסלולי התעבורה התוך-תאיים שלהם. על ידי החדרת סולפט רדיואקטיבי ושימוש בטכניקות בידוד וזיהוי, שיטה זו מאפשרת לחקור ספיגה אנדוציטית והגעת רשת טרנס-גולג'י של חלבוני מטען.

ניטור הגעתם של חלבוני שטח מתויגים GFP לרשת טרנס-גולג'י באמצעות ננו-גופים פונקציונליים

סחר בממברנה כרוך בהובלה של חלבונים מקרום הפלזמה לפנים התא (כלומר אנדוציטוזיס) ואחריו סחר לליזוזומים לפירוק או לקרום הפלזמה למיחזור. השיטות המתוארות במאמר זה נועדו לחקור אנדוציטוזיס ומיחזור של חלבוני ממברנת פלזמה.

מבחני הגנת L-גלוטתיון מבוססי תאים לחקר אנדוציטוזיס ומיחזור של חלבוני ממברנת פלזמה

אנו מתארים שיטה לתייג חלבון על פני השטח של תאי עצב חיים באמצעות נוגדן polyclonal ספציפי לאפיטופים תאיים. החלבון קשור בנוגדן על פני התא, ולאחר מכן הפנים באמצעות אנדוציטוזה ניתן להבחין בין החלבון שנותר ב, או נסחרים ל, את פני השטח במהלך הדגירה.

תיוג ההפרש של על פני קרום תא וחלבונים הפנימו לאחר האכלת נוגדן שידורים חיים בתרבית נוירונים

מאמר זה מתאר שיטות לסינתזה ותיוג ניאון של חלקיקים (NPS). הצירופים ויושמו בניסויי דופק מרדף לתייג מערכת אנדו-lysosomal של תאים האיקריוטים. מניפולציה של מערכת אנדו-lysosomal על ידי פעילויות של enterica סלמונלה הפתוגן תאיים היו במעקב על ידי הדמיה תא החי ולכמת.

יישום של פלורסנט חלקיקים לחקר שיפוץ של מערכת Endo-lysosomal על ידי חיידקים תאיים

סחר קולט מודולציה היענות איתות ותא לligands והוא, עצמו, מגיב לתנאי תא, כוללים איתות מושרה ליגנד. כאן אנו מתארים טכניקה חזקה וגמישה לכמותית הערכת סחר קולט תוצאת משימוש בסמים באמצעות immunolabeling וניתוח colocalizational.

מעקב אחר שינויים בהשפעת סמים בסחר פוסט-הפנמת קולטן על ידי ניתוח Colocalizational

החקירה של סחר קרום הוא חיוני להבנת תפקודים נוירונים. כאן, אנו מציגים שיטה לכימות תנועתיות שלפוחית ​​נוירונים. זוהי שיטה נוחה שניתן להתאים את כימות של סחר קרום במערכת העצבים.

כימות של Endosome ו Lysosome Motilities ב נוירונים תרבותיים באמצעות בדיקות פלואורסצנטי

שתי שיטות biotinylation מבוססות, שנועדו לקביעת ביטוי פני התא ואת שיעור endocytic של חלבונים לידי ביטוי בקרום פלזמה, מוצגים בדוח זה.

קביעת הביטוי משטח תאים ושיעור אנדוציטי של חלבונים בתרבויות אסטרוציטיות ראשוניות באמצעות Biotinylation

אנו מתארים של assay אופטי עבור שלפוחית סינפטית (SV) מיחזור בנוירונים בתרבית. שילוב פרוטוקול זה עם תרביות תאים כפול לבטא סמן presynaptic וחלבון עניין מאפשר לנו לאתר אתרי presynaptic, שלהם שלפוחית סינפטית מיחזור קיבולת, ולקבוע את תפקידו של החלבון עניין.

וזמינותו אופטי למיחזור שלפוחית סינפטית בנוירונים בתרבית Overexpressing חלבונים Presynaptic

מיחזור אנדוזומים הם חלק מהרשת הצינורית האנדוסומית. כאן אנו מציגים שיטה לכמת את הדינמיקה של מיחזור אנדוזומים באמצעות GFP-STX13 כסמן אברונים.

המיקרוסקופיה מבוססת אסאי ללמוד ולנתח את אנדוזומים מיחזור באמצעות סחר SNARE

הובלה אנדוציטית ונסיגה של חלבונים מקרום הפלזמה לרשת הטרנס-גולגי חיונית לשמירה על הומאוסטזיס הממברנה ולוויסות האיתות. כאן, אנו מתארים שיטה להדמיה וכימות של הובלה אנדוציטית של חלבוני מטען טרנסממברניים על ידי מיקרוסקופ תאים חיים באמצעות ננו-גופים נגזרים נגד GFP בתאי HeLa.

הדמיית תאים חיים של הובלה אנדוציטית באמצעות ננו-גופים פונקציונליים בתאים מתורבתים

חקור תעבורה רטרוגרדית של חלבונים לרשת הגולג'י באמצעות ננו-אנטיבודים פונקציונליים בתאי HeLa. שיטה זו מאפשרת ניתוח ביוכימי מדויק של דינמיקת ממברנות ושמירה על הומאוסטזיס תאי.

ניתוח של ספיגת Endocytic ותעבורה רטרוגרדית לרשת הטרנס-גולג'י באמצעות Functionalized Nanobodies בתאים בתרבית

גלה סרטונים נוספים