הדמיית פלורסנט של מנגו-מתויג RNA ב-Pvc פוליאקרילאמיד באמצעות שיטת Poststaining
21 ביוני 2019
כאן אנו מציגים רגיש, מהיר, ומפלה שיטת להפלות מכתים את התמונה rnas מתויג עם ה-RNA מנגו aptamers I, II, III, או IV, באמצעות מקורי או באמצעות הרפתקאות אלקטרופורזה ג'ל אלקטרופורזה (PAGE) ג'לים. לאחר הפעלת ג'לים סטנדרטיים של דף, מנגו-מתויג RNA יכול להיות מוכתם בקלות עם TO1-Biotin ולאחר מכן ניתח באמצעות קוראי קרינה זמינים נפוץ.
מתודולוגיית הדמיית הג'ל המתויגת במנגו שהוכח כאן היא חזקה וצפויה להיות מסוגלת פשוט להיות מורחבת מבחינת רגישות וספטיות. זה יהיה עוד יותר לפשט את הטיהור השגרתי של RNAs חשוב ביולוגית קומפלקסים RNA על ידי פשוט יעיל של הוספת תג מנגו ל- RNA של עניין. RNAs להיות מעורב יותר ויותר מחלות זה עבור שיטת היכרויות פוסט זו היא דרך קלה ומהירה כדי להיות מסוגל לעקוב ולדמיין RNA.
טיפול נוסף יידרש בהעברת הג'ל ממקום למקום מכיוון שהג'לים שבירים ונוטים להישבר. כדי להכין ג'ל denaturing 30 מיליליטר, בחר תחילה את אחוז פוליאקרילמיד עם כחול ברומופנול המתאים, וצבעי קסילן ציאנול לעומת RNA של עניין לבטח הפרדת פס גבוהה. לאחר מכן, ערבבו פתרונות A, B ו-C לפי לוח 1 והוסיפו APS וטימוד.
יוצקים מיד את תסנו הג'ל לתוך מנגנון יציקת ג'ל מתאים. מכניסים את הקונוס הרצוי ומשאירים את הג'ל לפולימראז למשך כ-30 דקות. הפוך את מיכל הג'ל באמצעות פתרון XTBE אחד ולהסיר בזהירות את הקונוס.
בזהירות להרים את הג'ל לעלות על מנגנון ג'ל ומאובטח באמצעות קליפים קלסר. באמצעות מזרק, שאף את בארות מיד לפני טעינת מדגם. הכן דגימות RNA 1X על ידי הוספת פתרון טעינת ג'ל denaturing 2X לדגימות RNA של עניין.
השתמש תרמוצ'ילר לחמם את הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן, לטעון דגימות מקורר לתחתית של כל באר באמצעות טיפים טעינת ג'ל. וגם את הג'ל בטמפרטורת החדר להבטיח את הכוח הוא נמוך ביעילות לא לפצח את צלחת הזכוכית של מנגנון הג'ל.
הכינו פתרון ויטראז' ג'ל 1X על פי כתב היד במיכל זכוכית נקי רחב מספיק כדי להתאים בנוחות לג'ל. מוסיפים מספיק פתרון 1X ג'ל מכתים את המיכל, כך הג'ל מכוסה לחלוטין עם הפתרון כאשר הוא ממוקם על סיבוב מסלולית. לאחר הג'ל מסיים לרוץ, להסיר את הג'ל מן המנגנון, לחתוך את הבארות שלה, פינה של הג'ל על מנת לעזור לקבוע את הכיוון.
לאחר מכן, מעבירים בזהירות את הג'ל לתסיכת הכתמת הג'ל 1X. כדי לבצע את ההדמיה, בזהירות decant פתרון הכתמים ולשטוף את הג'ל במהירות עם מים. לבסוף, בזהירות להעביר את הג'ל על המגש להיות ממוקם בתמונה.
מגלגלים פיפיט זכוכית מעל הג'ל כדי להסיר בועות לכודות ונוזל עודף. ולהמשיך לקחת תמונת ג'ל. מנגו aptamers אחד, שתיים, שלוש, ארבע התנגדו באופן משמעותי denaturation עד ריכוז אחד טוחן אוריאה.
זמן הכתמה של 20 עד 40 דקות הספיק לפרוח ג'ל מקסימלי. זמן רב יותר לא היה מתאים RNAs קטן בשימוש במחקר זה כפי שהם התחילו להתפזר מתוך הג'ל. ניתוח פלואורומטר הראה כי מנגו aptamers אחד, שתיים, ושלושה בנוכחות אוריאה יכול לקפל מהר יותר מאשר aptamer ארבע.
בהיעדר אוריאה, הקיפול היה מהיר בהרבה מהצפוי. הרגישות של שיטת הכתמת הפוסט הוצגה על ידי להקות בודדות המתאימות ל- RNAs מקופלים היטב עבור כל אחת מגרסאות המנגו בג'לים מקוריים ומרוקנים עם מעט פחות רגישות עבור המאוחר יותר. כימות של ג'לים מקומיים היה יומן ליניארי על סדר גודל אחד עם מנגו אחד, שתיים, וארבע מתנהג בצורה ליניארית יותר מאשר מנגו שלוש.
כימות של ג'לים denaturing היו ליניאריים יותר מציע כי הנוכחות של אוריאה בג'ל denaturing עשוי לספק דרך הומוגנית יותר לקפל את aptamers ברגע שהם ממוקמים בתתבת הכתמת ביוטין TO1. מנגו מתויג RNAs ניתן לזהות בנוכחות RNA הכולל באמצעות TO1 כתמי ביוטין לעומת כתמי SG. זכור לוודא כי מיכל מכתים ג'ל גדול מספיק כדי להתאים את הג'ל אחרת הג'ל עלול להתקפל על עצמו.
דגימות ה-RNA יתעבירו ממקום למקום. בדומה לג'לים denaturing, שיטה זו יכולה להתבצע עבור ג'ל מקומי. הפעל את הג'ל בחדר קר בהספק נמוך יותר כדי לשמור על התנאים המקומיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטת צביעה מהירה ורגישה לאחר ג'ל להדמיה של RNAs המסומנים באפטמרים מסוג RNA Mango באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד (PAGE). המתודולוגיה משפרת את היכולת לעקוב ולהדמיות של RNAs וקומפלקסים של RNA בעלי חשיבות ביולוגית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביוכימיה
- ביולוגיה מולקולרית
- דימוי RNA
רקע
- ה-RNA ממלא תפקיד מכריע בתהליכים ביולוגיים שונים.
- מעקב אחר RNA חיוני להבנת מעורבותו במחלות.
- שיטות קיימות לוויזואליזציה של RNA עלולות להיות מורכבות וגוזלות זמן.
- גישת התיוג ב-Mango מציעה חלופה פשוטה יותר.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטת צביעה חסונה לוויזואליזציה של RNA.
- שיפור הרגישות והספציפיות של מעקב אחר RNA.
- סיוע בטיהור של קומפלקסים של RNA.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- צביעה של הג'ל לאחר ההרצה באמצעות TO1-Biotin.
- שימוש בג'לי PAGE במצב טבעי (native) או דנטורציה (denaturing).
- הכנת ג'לים עם אחוזי פוליאקרילאמיד ספציפיים.
- ניתוח באמצעות קוראי פלואורסצנציה.
תוצאות עיקריות
- שיטת הדימוג המתוייגת ב-Mango היא רגישה ומהירה.
- היא מאפשרת ויזואליזציה קלה של פסי RNA.
- נדרשת זהירות יתרה בעת הטיפול בג'ל בשל שבירותו.
- ניתן להתאים את השיטה לסוגי RNA שונים.
מסקנות
- השיטה שפותחה מפשטת את המעקב וההדמיה של RNA.
- יש לה יישומים פוטנציאליים בחקר מחלות הקשורות ל-RNA.
- עבודות עתידיות עשויות לשפר את הרגישות והספציפיות של השיטה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ויזואליזציה פלואורסצנטית של RNA מתויג ב-Mango בג'לי פוליאקרילאמיד מאפשרת זיהוי רגיש, ספציפי ומשתלם של מיני RNA בתערובות מורכבות. יכולת זו נותנת מענה לצורך קריטי במעקב וכמותיות מדויקים של RNA במהלך שלבי הגילוי המוקדמים ופיתוח הבדיקות, ובכך תומכת בביטחון חיזוי במחקרים הממוקדים ב-RNA. הרגישות והספציפיות הגבוהות של השיטה מקלות על תעדוף פורטפוליו וקידום נכסי RNA מבוססי ניהול סיכונים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופרמקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה מדויקת של סוגי RNA וקומפלקסים של RNA בדגימות הטרוגניות.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות RNA באמצעות ויזואליזציה וכמותיות ישירות.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבחנה בין אינטראקציות ספציפיות של RNA לבין רעש רקע.
- משפר את רמת הביטחון החיזויית בתוכניות גילוי ממוקדות RNA.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק תהליך עבודה סטנדרטי וניתן לשחזור לזיהוי RNA הן בג'לים טבעיים (native) והן בג'לים דנטורביליים (denaturing).
- מספק תוצאות כמותיות המתאימות לכיול ואופטימיזציה של הבדיקה.
- מאפשר הערכה מהימנה של שלמות ה-RNA והקיפול שלו בתנאים מרובים.
- תומך בסריקה ניתנת להרחבה (scalable) של וריאנטים או קומפלקסים של RNA עבור יישומים המשכיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מחקרי סמנים ביולוגיים של RNA הרלוונטיים למחלה על ידי מתן אפשרות לגילוי רגיש ברקעים מורכבים.
- מבטיח רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות תמיכה במעקב חסון אחר RNA.
- מפחית את הסיכון הטרנסלציונלי על ידי אספקת נתוני ויזואליזציה כמותיים וניתנים לשחזור של RNA.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטת הצביעה המאוחרת הזו משתלבת בצורה חלקה משלבי הגילוי המוקדמים, דרך זיהוי המועמדים המובילים ועד למחקר הפרה-קליני, ומספקת יכולת רב-פעמית לוויזואליזציה וכימות של RNA.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי מתן אפשרות לתצפית ישירה על מטרות RNA.
- סריקה: מספקת תוצרים כמותיים המוכנים לבדיקה לצורך השוואה מהימנה של דגימות RNA.
- אנליטיקה: מספקת כימות לוג-ליניארי ורגישות גבוהה לצורך ניתוח נתונים חסון.
- מחקר תרגומי: מקלה על סנכרון של סמנים ביולוגיים והמשכיות בין שלבי המחקר.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה יעילה מבחינת עלויות וניתנת להתאמה לצרכים חוזרים של זיהוי RNA.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות בתיקוף מטרות RNA.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של תהליכי עבודה להדמיית RNA ומשפר את השחזוריות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון בתוכניות הממוקדות ב-RNA.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של נכסי RNA מותאם סיכון, בהתבסס על נתוני זיהוי אמינים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ב-RNA ובאלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד.
- נדרשת גישה למכשור של דימוי פלואורסצנציה ולריאגנטים תאימים לצביעה.
- דורש טיפול זהיר בג'ל בשל שבירותו והסיכון לשבירה במהלך העברות.
- דורש התאמה של זמני ותנאי הצביעה עבור גדלי RNA וסוגי ג'לים שונים.
- מוגבל בשל דיפוזיה פוטנציאלית של RNA קטן במהלך תקופות צביעה ממושכות.
