הדמיית פלורסנט של מנגו-מתויג RNA ב-Pvc פוליאקרילאמיד באמצעות שיטת Poststaining

כאן אנו מציגים רגיש, מהיר, ומפלה שיטת להפלות מכתים את התמונה rnas מתויג עם ה-RNA מנגו aptamers I, II, III, או IV, באמצעות מקורי או באמצעות הרפתקאות אלקטרופורזה ג'ל אלקטרופורזה (PAGE) ג'לים. לאחר הפעלת ג'לים סטנדרטיים של דף, מנגו-מתויג RNA יכול להיות מוכתם בקלות עם TO1-Biotin ולאחר מכן ניתח באמצעות קוראי קרינה זמינים נפוץ.

מתודולוגיית הדמיית הג'ל המתויגת במנגו שהוכח כאן היא חזקה וצפויה להיות מסוגלת פשוט להיות מורחבת מבחינת רגישות וספטיות. זה יהיה עוד יותר לפשט את הטיהור השגרתי של RNAs חשוב ביולוגית קומפלקסים RNA על ידי פשוט יעיל של הוספת תג מנגו ל- RNA של עניין. RNAs להיות מעורב יותר ויותר מחלות זה עבור שיטת היכרויות פוסט זו היא דרך קלה ומהירה כדי להיות מסוגל לעקוב ולדמיין RNA.

טיפול נוסף יידרש בהעברת הג'ל ממקום למקום מכיוון שהג'לים שבירים ונוטים להישבר. כדי להכין ג'ל denaturing 30 מיליליטר, בחר תחילה את אחוז פוליאקרילמיד עם כחול ברומופנול המתאים, וצבעי קסילן ציאנול לעומת RNA של עניין לבטח הפרדת פס גבוהה. לאחר מכן, ערבבו פתרונות A, B ו-C לפי לוח 1 והוסיפו APS וטימוד.

יוצקים מיד את תסנו הג'ל לתוך מנגנון יציקת ג'ל מתאים. מכניסים את הקונוס הרצוי ומשאירים את הג'ל לפולימראז למשך כ-30 דקות. הפוך את מיכל הג'ל באמצעות פתרון XTBE אחד ולהסיר בזהירות את הקונוס.

בזהירות להרים את הג'ל לעלות על מנגנון ג'ל ומאובטח באמצעות קליפים קלסר. באמצעות מזרק, שאף את בארות מיד לפני טעינת מדגם. הכן דגימות RNA 1X על ידי הוספת פתרון טעינת ג'ל denaturing 2X לדגימות RNA של עניין.

השתמש תרמוצ'ילר לחמם את הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן, לטעון דגימות מקורר לתחתית של כל באר באמצעות טיפים טעינת ג'ל. וגם את הג'ל בטמפרטורת החדר להבטיח את הכוח הוא נמוך ביעילות לא לפצח את צלחת הזכוכית של מנגנון הג'ל.

הכינו פתרון ויטראז' ג'ל 1X על פי כתב היד במיכל זכוכית נקי רחב מספיק כדי להתאים בנוחות לג'ל. מוסיפים מספיק פתרון 1X ג'ל מכתים את המיכל, כך הג'ל מכוסה לחלוטין עם הפתרון כאשר הוא ממוקם על סיבוב מסלולית. לאחר הג'ל מסיים לרוץ, להסיר את הג'ל מן המנגנון, לחתוך את הבארות שלה, פינה של הג'ל על מנת לעזור לקבוע את הכיוון.

לאחר מכן, מעבירים בזהירות את הג'ל לתסיכת הכתמת הג'ל 1X. כדי לבצע את ההדמיה, בזהירות decant פתרון הכתמים ולשטוף את הג'ל במהירות עם מים. לבסוף, בזהירות להעביר את הג'ל על המגש להיות ממוקם בתמונה.

מגלגלים פיפיט זכוכית מעל הג'ל כדי להסיר בועות לכודות ונוזל עודף. ולהמשיך לקחת תמונת ג'ל. מנגו aptamers אחד, שתיים, שלוש, ארבע התנגדו באופן משמעותי denaturation עד ריכוז אחד טוחן אוריאה.

זמן הכתמה של 20 עד 40 דקות הספיק לפרוח ג'ל מקסימלי. זמן רב יותר לא היה מתאים RNAs קטן בשימוש במחקר זה כפי שהם התחילו להתפזר מתוך הג'ל. ניתוח פלואורומטר הראה כי מנגו aptamers אחד, שתיים, ושלושה בנוכחות אוריאה יכול לקפל מהר יותר מאשר aptamer ארבע.

בהיעדר אוריאה, הקיפול היה מהיר בהרבה מהצפוי. הרגישות של שיטת הכתמת הפוסט הוצגה על ידי להקות בודדות המתאימות ל- RNAs מקופלים היטב עבור כל אחת מגרסאות המנגו בג'לים מקוריים ומרוקנים עם מעט פחות רגישות עבור המאוחר יותר. כימות של ג'לים מקומיים היה יומן ליניארי על סדר גודל אחד עם מנגו אחד, שתיים, וארבע מתנהג בצורה ליניארית יותר מאשר מנגו שלוש.

כימות של ג'לים denaturing היו ליניאריים יותר מציע כי הנוכחות של אוריאה בג'ל denaturing עשוי לספק דרך הומוגנית יותר לקפל את aptamers ברגע שהם ממוקמים בתתבת הכתמת ביוטין TO1. מנגו מתויג RNAs ניתן לזהות בנוכחות RNA הכולל באמצעות TO1 כתמי ביוטין לעומת כתמי SG. זכור לוודא כי מיכל מכתים ג'ל גדול מספיק כדי להתאים את הג'ל אחרת הג'ל עלול להתקפל על עצמו.

דגימות ה-RNA יתעבירו ממקום למקום. בדומה לג'לים denaturing, שיטה זו יכולה להתבצע עבור ג'ל מקומי. הפעל את הג'ל בחדר קר בהספק נמוך יותר כדי לשמור על התנאים המקומיים.