Name: Wholemount ב באתרו הכלאה עבור עוברי Astyanax (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: למדו את פרוטוקול הכלאה באתרו לכל הרקמה לצפייה בביטוי גנים בעוברי Astyanax mexicanus עם רקע מינימלי. השיטה מפשטת תהליך מורכב ומספקת רשימות בקרה לשחזוריות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות חברי המעבדה ברוטו עבור הערות מועילות על כתב היד הזה. ברצוננו להודות ארבעה תלמידי תיכון אשר מנוצל פרוטוקול זה במהלך התמחות קיץ בחודשים 2017 2018, לרבות כריסטין סאו, מייקל וורדן, אקי Li נוואנקוו דוד. HL נתמכה על ידי מלגת UC ביולוגיה גזע במהלך קיץ 2017. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי הקרן הלאומית למדע (דב-1457630 כדי JBG), נבחרת מוסדות של שיניים ואת ואסטתיים מחקר (NIH; DE025033 אל JBG).

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) באוניברסיטת סינסינטי (פרוטוקול #10-01-21-01).
1. קיבוע
<ol><li>לבודד את המספר הרצוי של Astyanax mexicanus עוברי מטנק הרבייה ותקן ~ 50 העוברים במועד. אם העוברים גדול וישן, ייתכן צורך לתקן 25 בכל פעם כדי להבטיח קיבוע אפילו.</li>
	<li>בהתאם לגיל של העובר, לנצל את השיטה שאושרו על-ידי IACUC של הרדמה. עבור עוברי בוגרים עם מערכת העצבים מתפקדת, להקריב את העוברים דרך יתר הרדמה. בהתאם לכך, מקום עוברי פתרון של tricaine ~ 1% (נאגר ל pH 7.4) כדי למזער את הכאב ואי נוחות עבור האורגניזם.</li>
	<li>ברגע העוברים אינם מגיבים למגע, להחליף את מערכת מים המכילים tricaine, וכן להוסיף מ ~ 1 ל 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS, pH 7.4).</li>
	<li>הסר את הפתרון PBS, ולהוסיף 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA). את העוברים בן לילה ב 4 º C. התראה: PFA מסוכנים (קרי, זה דליק והוא העור, הריאות מגרה), לטפל.</li>
</ol>2. התייבשות
<ol><li>מייבשים את העוברים, להסיר את הפתרון מקבע ולשטוף עם 1 מ"ל ל- PBS. במקום בקבוקונים המכילים העובר בזווית (בין 30° 45°), על פלטפורמה מטרף במהלך השטיפה. ממשיכים לשטוף את העוברים פעמיים, 5 דקות לכל לשטוף.</li>
	<li>אם העוברים יש עדיין chorion, למקם את כל העוברים 50 100 מ"מ x 25 מ"מ פטרי, בזהירות לבודד אותם מן chorions באמצעות שני זוגות מלקחיים של שען (למשל, מלקחיים #5) תחת מיקרוסקופ. הערה: במהלך השלבים המתוארים להלן, ואת לשארית של הפרוטוקול, בזהירות להסיר את כל נוזל מהשלב הקודם באמצעות נקי, זכוכית פסטר סיליקון לפני הוספת את הפתרון הבא</li>
	<li>מייבשים את העוברים בסדרה של שוטף יותר ויותר מרוכז של מתנול (MeOH) המתוארים להלן. דילולים מבוססים על הנפח הכולל 1 מ"ל עם 500 µL של פתרון נכנס כל בקבוקון זכוכית 4 מ"ל. לבצע כל השלבים התייבשות בטמפרטורת החדר (RT) על פלטפורמת בשייקר.<ol>
<li>הסר בזהירות את הפתרון PBS. להוסיף פתרון MeOH 25% (250 µL של MeOH) + µL 750 ל- PBS. מנערים בעדינות על מטרף פלטפורמה עבור 5 דקות.</li>
		<li>הסר בזהירות את הפתרון MeOH של 25%. להוסיף פתרון MeOH 50% (500 µL של MeOH) + µL 500 ל- PBS. מנערים בעדינות על מטרף פלטפורמה עבור 5 דקות.</li>
		<li>הסר בזהירות את הפתרון MeOH של 50%. להוסיף פתרון MeOH 75% (750 µL של MeOH) + µL 250 ל- PBS. מנערים בעדינות על פלטפורמה מטרף למשך 5 דקות.</li>
		<li>הסר בזהירות את הפתרון MeOH 75%. להוסיף פתרון MeOH 100% (1 מ"ל של MeOH). מנערים בעדינות על מטרף פלטפורמה עבור 5 דק. חזור על צעד זה 3 פעמים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בשלב זה, החנות מיובש עוברי, לפי הצורך, ב המבחנות זכוכית ב-20 ° C (לטווח ארוך). לחלופין, להמשיך ישירות יום 1 של הפרוטוקול.</li>
</ol>3. יום 1: התייבשות
<ol><li>להשיג עוברי מיובש של המקפיא-20 ° C (או להמשיך ישירות משלב 2.5).</li>
	<li>למיין את העוברים באמצעות פיפטה של פסטר. אחד ניתן למיין על בסיס morphotype (קרי, מערת ו/או משטח) ולאחר מספר גנים העריכו ניסוי. ישנם העוברים בדרך כלל לא יותר מ 12 לכל מבחנה פעם ממוינים. כדי לשמור על הארגון, אשתמש בקלטת מעבדה צבעוניים כדי לייעד בקבוקונים, פיפטות כל הגן. עוברי תישאר בבקבוקון אותו לאורך כל פרוטוקול כולו. הערה: המקום קצה פיפטה פסטר 100% EtOH לחטא אותה בין משתמש.</li>
	<li>הגדר באמבט מים חזק עד 70 ° C כדי לשמש בשלב מאוחר יותר. . בזהירות, למשוך החוצה את MeOH ב צלוחיות של העוברים מיון ולהחליף עם 500 µL של חדש 100% MeOH. לשטוף בקצרה (~ 1 דקות) על פלטפורמת בשייקר.</li>
	<li>נתרענן עוברי בריכוז גדל והולך של PBS x 1 עם Tween 20 (PBT, ראה להלן) על פלטפורמת בשייקר. דילולים מבוססים על אמצעי אחסון דילול הסופי של 1 מ"ל עם 500 µL נכנס לכל מבחנה.<ol>
<li>להוסיף פתרון PBT 25% (250 µL של PBT, 750 µL של MeOH). מנערים בעדינות על מטרף פלטפורמה עבור 5 דקות.</li>
		<li>הסר בזהירות את הפתרון PBT 25%. להוסיף פתרון PBT 50% (500 µL של PBT, 500 µL של MeOH). מנערים בעדינות על מטרף פלטפורמה עבור 5 דקות.</li>
		<li>הסר בזהירות את הפתרון PBT 50%. להוסיף פתרון PBT 75% (750 µL של PBT, 250 µL של MeOH). מנערים בעדינות על מטרף פלטפורמה עבור 5 דקות.</li>
		<li>הסר בזהירות את הפתרון PBT 75%. להוסיף פתרון PBT 100% (1 מ"ל של PBT). מנערים בעדינות על מטרף פלטפורמה עבור 5 דק. חזור על צעד זה 3 פעמים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. יום 1: לעיכול, קיבוע
<ol><li>להכין proteinase של K (PK) פתרון על-ידי הוספת 1 µL של PK (20 מ"ג/מ"ל) 2 מיליליטר PBT.</li>
	<li>בציפייה והשלבים, להשיג aliquots הקפוא של מאגרי הכלאה (Hyb - ו Hyb +; ראה משלימה קובץ 2 ו- 3 קובץ משלים), כדורגלן של אחסון-20 ° C.<ol>
<li>לאפשר PFA להפשיר-RT.</li>
		<li>מקום aliquots של Hyb - ו Hyb + אמבט מים מסתובב של 70 מעלות צלזיוס. מקם כל ריאגנטים, בקבוקונים בתוך קטן "אטם" עם חלק תחתון עם רשת שינוי, בתוך המנגנון אמבט מים צף. פעולה זו מאפשרת תוספת פשוטה והסרה של צינורות, בקבוקונים מהאמבטיה מים של 70 מעלות צלזיוס מסתובב.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בעדינות להוסיף פתרון PK vial(s) של העוברים להבטיח לכל רקמות יהיו מכוסים לגמרי פתרון. לעכל את העוברים ~ 12 דקות ב- PK הפתרון עובד על פלטפורמה ניעור. הערה: האורך של מערכת העיכול יכולים להיות מגוונים על-ידי החוקר כדי להבטיח תוצאות מיטביות.</li>
	<li>למשוך בעדינות את הפתרון PK, בקצרה להציף את המבחנה עם PBT לדלל כל הנותרים PK.</li>
	<li>לצייר את הפתרון PBT והחלף µL 500 של PBT חדש. לאפשר את הפתרון לשטוף על ניעור פלטפורמה עבור 5 דקות.</li>
	<li>להרחיק PBT ולהחליף µL 500% 4 המופשרים מחברים. לאפשר את העוברים על תקופת דגירה של 20 דקות על ניעור פלטפורמה ב- RT.</li>
	<li>להרחיק את % 4 מחברים, ויטביע בקצרה את המבחנה עם PBT לדלל כל כדורגלן הנותרים. להרחיק את PBT, והחלף µL 500 של PBT טריים. לאפשר עוברי לשטוף למשך 5 דקות על פלטפורמה ניעור. חזור על שלב זה 4 פעמים נוספות.</li>
</ol>5. יום 1: Prehybridization
<ol><li>במקום 500 µL של Hyb-פתרון ומחוממת מראש לתוך הבקבוקון. בזהירות הכנס את המבחנה 70 מעלות צלזיוס המים אמבט (בתוך אטמים) מבלי לרעוד, במשך 5 דקות.</li>
	<li>לצייר את הפתרון Hyb, להציף את המבחנה עם 500 µL של טרום ומחוממת Hyb + פתרון. מניחים את הצנצנת בחזרה לתוך האמבט מים 70 מעלות צלזיוס ברעידות (40 סל ד). תקופת דגירה של גם 4 שעות, או למשך הלילה. הערה: דגירה 4 שעות תניב פרוטוקול באתרו מלאה יימשך 4 ימים בסך הכל. כאן, שלב זה מוצג הדגירה לילה, אשר תניב פרוטוקול שנמשך 5 ימים בסך הכל.</li>
</ol>6. יום 2: הכלאה
<ol><li>המקום aliquot של Hyb + מהמקפיא-20 ° C באמבט מים חמים חזק במשך 5 דקות.</li>
	<li>להרחיק את Hyb + מ המבחנה והחלף 500 µL של Hyb מראש ומחוממת +. על הפתרון הזה, בזהירות להוסיף 2 µL של RNA בדיקה לכל מבחנה. מערבולת בעדינות את הצנצנת כדי להבטיח הפצה אפילו של המכשיר.</li>
	<li>דגירה Hyb + (עם בדיקה נוספת) הפתרון באמבט מים חמים 70 ° C בלילה תוך כדי טלטול-40 סל ד. הערה: אפשר להיעזר מחדש Hyb + (עם המכשיר) פתרון. בשביל זה, סעו Hyb + עם החללית הראשונה לרוץ מקפיא-20 ° C, המקום אותו באמבט מים חמים במשך 5 דק החלף Hyb + מיום 1 פרוטוקול עם Hyb + עם בדיקה ולאפשר המקננת בן לילה באמבט מים חמים.</li>
</ol>7. יום 3: פתרון הכנה
<ol><li>להכין צינורות microcentrifuge Hyb + המסומנת החללית RNA "ג'ין-של-עניין". הכינו את סדרת דילולים ייעשה שימוש במהלך יום 3.<ol>
<li>באמצעות צינורות נפרדת 6, להכין את הבאים סדרת דילולים של Hyb - ו נתרן מלוחים ציטראט (האס, 0 ל- 100%) 1 מ"ל נפח, ובמקום אותם ב- 70 מעלות צלזיוס רועד רשמים: צינור 1 = 100% Hyb-(1 מ"ל של Hyb-): צינור 2 = 25% 2 x SSC (250 µL של 2 x SSC, 750 µL של Hyb-); צינור האס 2 x 3 = 50% (500 µL של 2 x האס, 500 µL של Hyb-); צינור האס 2 x 4 = 75% (750 µL של 2 x האס, 250 µL של Hyb-); צינור האס 2 x 5 = 100% (1 מ"ל של האס x 2); צינור 6 = 100% 0.2 x האס (2 מ"ל של 0.2 x האס). הערה: לעמוד על המשמר של הריכוז של האס, כפי שהוא משתנה מ- 2 x 0.2 x.</li>
		<li>באמצעות 4 להפריד בין צינורות להכין סדרת דילולים PBT, האס באמצעי אחסון 1 מ"ל הבאים, במקום בגיל RT: צינור 1 = 25% PBT (250 µL של PBT, µL 750 של 0.2 x SSC); צינור PBT 2 = 50% (500 µL של PBT, µL 500 של 0.2 x האס); צינור 3 = 75% PBT (750 µL של PBT, 250 µL של 0.2 x האס); צינור 4 = 100% PBT (1 מ"ל של PBT).</li>
		<li>הכן צינור 2 מ ל חומצה maleic מאגר המכיל הפתרון עובד Tween 20 (MABT).</li>
		<li>להכין שני צינורות חרוט 15 מ"ל של חסימת פתרון. כל צינור, להוסיף 0.2 גר' ריאגנט חסימה 10 מ"ל של MABT (ראה 4 קובץ משלים). מקום שני צינורות על מיקסר nutating (או פלטפורמה שאכר) עד התפרקה לחלוטין בתמיסה (עד 3 h).</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. יום 3: בדיקה להסרת
<ol><li>לצייר את Hyb + (עם המכשיר) פתרון עם זכוכית פיפטה פסטר והנח אותו לתוך סטרילי, הנקרא צינור microcentrifuge. שומרים על הצינורית הזאת במקפיא-20 ° C לשימוש עתידי (אם תיוג-בדיקה מוצלחת).</li>
	<li>להוסיף בזהירות µL 500 של חמה האס/Hyb-דילולים (מסומן להלן). דגירה בכל הפתרונות הבאים למשך 10 דקות כל באמבט מים חזק 70 מעלות צלזיוס.<ol>
<li>דגירה ברצף עם 100% Hyb-(1 מ"ל של Hyb-), 25% 2 x SSC (250 µL של 2 x SSC, 750 µL של Hyb-), 50% 2 x SSC (500 µL של 2 x SSC, 500 µL של Hyb-), 75% 2 x SSC (750 µL של 2 x SSC, 250 µL של Hyb-), 100% 2 x SSC (1 מ"ל של 2 x SSC) , 100% 0.2 x SSC (2 מ של 0.2 x SSC).</li>
	</ol>
</li>
	<li>בעקבות הצעד האחרון, דגירה בכל הפתרונות הבאים למשך 10 דקות. כל incubations הבא יתקיים ב RT על פלטפורמה ניעור: 25% PBT (250 µL של PBT, µL 750 של 0.2 x SSC), 50% PBT (500 µL של PBT, µL 500 של 0.2 x SSC), 75% PBT (750 µL של PBT, 250 µL של 0.2 x SSC) , 100% PBT (1 מ"ל של PBT).</li>
	<li>לאחר דגירה 10 דקות, להסיר את 100% PBT, ולהוסיף 500 µL של MABT לתוך כל מבחנה. חזור על שלב זה פעמיים במשך 5 דקות.</li>
</ol>9. יום 3: חסימת
<ol><li>הסר MABT כל מבחנה, הצפה עם פתרון חסימה מעורבבים מראש מאחד הצינורות (להכין בשלב 7.1.4). במקום המבחנה על מיקסר nutating עבור ~ 4 h-RT.</li>
	<li>להוסיף 2 µL של אנטי-DIG-AP Fab קטעים למבחנה השני של 10 מ"ל חסימת פתרון (להכין בשלב 7.1.4) ו בקצרה מערבולת.</li>
	<li>למלא כל בקבוקון כמעט לחלוטין עם חסימת פתרון (~ 5 מ"ל) ומניחים על מיקסר nutating בין לילה במקרר-4 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>10. יום ד'-MABT שטיפות
<ol><li>להכין בקבוקון מניות של 10% עז נורמלית בסרום (הגדרות) ב MABT (להוסיף 100 µL של המיתרים µL 900 של MABT).</li>
	<li>להרחיק את הפתרון חסימה ב כל בקבוקון ולהוסיף 500 µL תערובת המיתרים/MABT לתוך כל מבחנה. לאפשר את העוברים על תקופת דגירה של 25 דקות ב RT על פלטפורמה ניעור.</li>
	<li>החלף את התערובת המיתרים/MABT µL 500 של 100% MABT. תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT-ניעור פלטפורמה. לבצע שטיפה זו 11 פעמים נוספות במהלך היום כל 30 דקות.</li>
	<li>ממלאים את הצנצנת עם 100% MABT, ובמקום על מיקסר nutating לילה ב תא במקרר או ללא הזמנה ב 4 º C.</li>
</ol>11. יום 5: בדיקה ויזואליזציה
<ol><li>להכין את aliquot 50 מ של מאגר phosphatase אלקליין (AP) (ראה 5 קובץ משלים). לשלב הבא 50 מ ל צינור חרוטי עטוף בנייר אלומיניום להגביל את החשיפה אור: 5 מ של 1 מ' טריס (pH 9.5), 5 מ של 50 מ מ MgCl2, 5 מ של 1% Tween 20, 5 מ של 1 M NaCl, 30 מ של ddH2O.</li>
	<li>להסיר MABT והחלף 1 מ"ל של מאגר AP (הצינור עטופה בנייר כסף). . תן לזה להציף במשך 5 דקות. עושים זאת פעמיים כדי להבטיח הסרה מלאה של MABT.</li>
	<li>להסיר את מאגר AP והחלף 1 מ"ל של AP מאגר עם 3.5 μL 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate (BCIP) ו 4.5 μL של ניטרו-כחול tetrazolium (NBT). החלף הטרי AP מאגר/NBT/BCIP לאחר סיום כל שעה עד התגובה. לפקח מקרוב, בדיקת כל 15 דקות, כדי לאפשר את התגובה הגיוון להתקיים עד הרמה הרצויה של צביעת הושגה. אם התמיסה מתחילה להיווצר, להחליף את הפתרון מוקדם יותר.</li>
	<li>לעצור את התגובה הגיוון על ידי שטיפה העוברים במאגר AP 100% טריים (ללא NBT/BCIP) 5 דק המשך שטיפות ב- PBT עד רמות אופטימלית של האות (עם כמות מינימלית של צביעת הרקע) מושגות. ממשיכים לשטוף דגימות עם הגדלת דילולים של PBT במאגר AP כדלקמן: 25% PBT (250 μL של PBT, μL 750 מאגר AP), שטיפה עבור 5 דקות; 50% PBT (500 μL של PBT, 500 μL מאגר AP), שטיפה עבור 5 דקות; 75% PBT (750 μL של PBT, μL 250 מאגר AP), לשטוף במשך 5 דקות.</li>
	<li>לשטוף עוברי ב ~ 5 מ ל 100% PBT-nutating מיקסר עד רצוי רקע מינימלי מכתים מתמלאת. מעבר החוצה עם PBT טרי מספר פעמים. זה יכול לקחת מספר ימים.</li>
	<li>כאשר שטיפה מלאה, תשטוף עוברי ב μL 500 ל- PBS סטרילי על פלטפורמה מטרף. לבצע שטיפה זו פעמיים במשך 5 דקות. לאחר PBS שוטפים, פוסט-לתקן את דגימות μL 500 של 4% מחברים עבור h 1 RT על פלטפורמה מטרף. לחלופין, את בן לילה ב 1 מ"ל של 4% PFA במקרר-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>החלף מקבע את רענן, PBS סטרילי. לבצע שטיפה זו לפחות פעמיים במשך 5 דק המקום העוברים ב ~ 4 מ ל 100% PBS סטרילי, ולאחסן לטווח ארוך ב 4 º C.</li>
</ol>12. הדמיה
<ol><li>לפצות צלחת הדמיה בצלחת פטרי באמצעות 3% agarose וטה מאגר. הערה: כמויות תלוי כמה לוחות הדרושים. צלחות חוזר מספר פעמים. מומלץ כי תבנית מלבנית רדוד ימוקם הפטרי בזמן הג'ל הוא קירור על מנת ליצור גומה להכללת העוברים על הצלחת.</li>
	<li>מקם את העוברים על הצלחת ב-, טוב, מגניב. הערה: מומלץ לשפוך בעדינות העוברים על צלחת במקום pipetting אותם כי זה נמצא כי הם ידבק הפנימי של פיפטות פלסטיק.</li>
	<li>השתמש מיקרוסקופ אור על מנת להמחיש כל העובר. השתמש בדיקה בוטה לתמרן עוברי למיקום הרצוי.</li>
	<li>לקחת תמונה כאשר העובר נמצא במיקום הרצוי. שימו לב כי חשוב לקחת תמונות של העוברים בתוך כמה שבועות של צביעת שהושלמו כדי למנוע השפלה פוטנציאלי של כתם.</li>
</ol>

<ol><li>Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aValentino%2C+KL+%22In+situ+hybridization%3A+Application+to+neurobiology%22">In situ hybridization: Application to neurobiology</a>. , Oxford University Press. Oxford. (1987).</li>
<li>Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-myc+proto-oncogene+expression+during+organogenesis+in+the+developing+mouse+as+revealed+by+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).</li>
<li>Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cranial+patterning+in+the+direct%E2%80%90developing+frog+Eleutherodactylus+coqui+revealed+through+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Early cranial patterning in the direct‐developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression.</a> Evolution & Development. 12 (4), 373-382 (2010).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li>
<li>Cheung, M., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+development+is+regulated+by+the+transcription+factor+Sox9%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9.</a> Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).</li>
<li>Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lockjaw+encodes+a+zebrafish+tfap2a+required+for+early+neural+crest+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development.</a> Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).</li>
<li>Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHF20+positively+regulates+osteoblast+differentiation+via+increasing+the+expression+and+activation+of+Runx2+with+enrichment+of+H3K4me3%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8060(2017).</li>
<li>Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%CE%B1-chemokine%2C+stromal+cell-derived+factor-1%CE%B1%2C+binds+to+the+transmembrane+G-protein-coupled+CXCR-4+receptor+and+activates+multiple+signal+transduction+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The α-chemokine, stromal cell-derived factor-1α, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).</li>
<li>Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignments+of+the+genes+for+rat+pituitary+adenylate+cyclase+activating+polypeptide+%28Adcyap1%29+and+its+receptor+subtypes+%28Adcyap1r1%2C+Adcyap1r2%2C+and+Adcyap1r3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3).</a> Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).</li>
<li>Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+differentiation+of+myelin-forming+oligodendrocytes+depends+on+the+transcription+factor+Sox10%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10.</a> Genes & Development. 16 (2), 165-170 (2002).</li>
<li>Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pnp4a+is+the+causal+gene+of+the+Medaka+Iridophore+mutant+guanineless%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).</li>
<li>Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+protocol+for+whole-mount+in+situ+hybridization+on+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809(2007).</li>
<li>Schulz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+to+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization to Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764(2007).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

בשל הפגיעות של RNA כדי השפלה, אחד הצעדים הקריטיים ביותר בפרוטוקול נוגע הסינתזה סטרילי של החללית ה-RNA. עם זאת, אם בדיקה מופק היטב, מספק תוצאות טובות, זה יכול לעשות שימוש חוזר בתגובות מכתימים עוקבות. צעד מכריע השני הוא ייצור זהיר של כל ריאגנטים בשימוש בכל רחבי בפרוטוקול. מאז פרוטוקול זה כרוך מספר ימים של צעדים קטנים רבים, זה הכרחי כי כל ריאגנטים במדויק המיוצרים הינם מאוחסנים באופן סטרילי. יתר על כן, חשוב באופן מהותי כי החוקר ממשיך בזהירות אחר כל שלב בפרוטוקול. מצאנו כי הרשימה שסופקה מדרגות יכול להיות שימושי ביותר להבטיח ה...

היברידיזציה באתר היא שיטה נפוצה עבור צביעת רקמות קבוע להמחיש דפוסי ביטוי גנים1. טכניקה זו בוצעה שנים אחרים מסורתי2 שגרתיים3 דגם מערכות, למגוון רחב של מחקרים ביולוגיים. עם זאת, מספר צעדים, ריאגנטים נחוצים לבצע הליך זה בהצלחה. עבור חוקרים אשר מעולם לא ביצע בטכניקה זו, מפעיל את התהליך יכולה להיות מאיימת בשל הצעדים רבים הכרוכים עוד יותר, מהות ההליך ממושך משאיל את עצמו על שגיאות טכניות, אשר עשויה להיות מאתגרת כדי לפתור בעיות.
המטרה הכוללת של מאמר זה היא להציג שיטה פשוטה שיעבד טכניקה זו הכלאה נגיש לקהל רחב. כדי לצמצם את המבוא של שגיאות, אנו מציגים בגישה ישירה התשואות באיכות גבוהה ג'ין ביטוי מכתים, ממזער את האות רקע שאינם ספציפיים. הליך זה דומה גישות אחרות שפותחה במערכות דגם מסורתיים, כגון רזבורה rerio4. כאן, אנו שואפים לקדם יישום זהיר של כל שלב באמצעות רשימת פעולות לביצוע להורדה (1 קובץ משלים), כדי לקדם את יישום זהיר של הפרוטוקול. הרציונל לביצוע פעולה זו היא להקל על הארגון בשלבים רבים הכרוכים בהליך זה. מאמר זה מתאים מהחוקרים המעוניינים בביצוע היברידיזציה כולה-הר בפיתוח עוברי, אך עדיין לא ביצעתי את ההליך. היתרון של הגישה שבחרת עבור חוקרים Astyanax הוא כי זה יש נבדק והוכח cavefish והן morphs דגים השטח, ובכך להקל ביטוי השוואתי ניתוחים. ניתן להשתמש בשיטת שהוצגו על ידי חוקרים מחקרים על Astyanax ומערכות אחרות.

<table><tbody><tr><td>10 מ"ל פיפטה סרולוגית</td><td>VWR</td><td>89130-888</td><td></td></tr><tr><td>יחידת סינון 1000 מ"ל</td><td>VWR</td><td>89220-698</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל פיפטה חרוטית</td><td>VWR-Greiner</td><td>82050-278</td><td></td></tr><tr><td>25 מ"ל פיפטה סרולוגית</td><td>VWR</td><td>89130-890</td><td></td></tr><tr><td>יחידת סינון 250 מ"ל</td><td>VWR</td><td>89220-694</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל פיפטה סרולוגית</td><td>VWR</td><td>89130-886</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל חרוטי</td><td>VWR-Falcon</td><td>21008-940</td><td></td></tr><tr><td>יחידת סינון 500 מ"ל</td><td>VWR</td><td>89220-696</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-דיגוקסיגנין-AP, שברי פאב</td><td>סיגמא-רוש</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>BCIP</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B8503-1G</td><td>1 גרם</td></tr><tr><td>תמיסת חסימה</td><td>סיגמא-רוש</td><td>11 096 176 001</td><td>50 גרם</td></tr><tr><td>חומצת לימון</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A104-500</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>DIG RNA ערכת תיוג (SP6 / T7)</td> <td>צינורות סיגמא-רוש</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>אפנדורף</td><td>VWR</td><td>20170-577</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>פישר-דקון</td><td>04-355-223</td><td>1 גל</td></tr><tr><td>פורממיד</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>17899</td> בקבוקוני דראם זכוכית <td>100 מ"ל</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>66011-041</td><td>1 ד"ר</td></tr><tr><td>זכוכית פיפטס</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-678-8A</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>תרמי-מדעיפארמקו-AAPER</td><td>284000ACS</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>הפרין</td><td>סיגמא</td><td>H3393-25KU</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד-גבישי</td><td>פישר מדעי</td><td>M33-500 500</td><td>גרם</td></tr><tr><td>חומצה מאלית</td><td>סיגמא</td><td>M0375-100</td><td>גרם 100 גרם</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A452-4</td><td>4 ליטר</td></tr><tr><td>מים בדרגה מולקולרית (ללא RNase)</td> <td>VWR</td><td>7732-18-5</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>3 ק"ג</td></tr><tr><td>כדורי NaOH</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S318-500 500</td><td>גרם</td></tr><tr><td>אבקת מצע NBT</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34035</td><td>1 גרם</td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>Fisher-Invitrogen</td><td>31873</td><td></td></tr><tr><td>מערבל אגוזים</td><td>VWR</td><td>82007-202</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>158127-500 גרם</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-20</td><td>20L</td></tr><tr><td>Proteinase K (200 מ"ג/10 מ"ל)</td> <td>Qiagen</td><td>19133</td><td>10 מ"ל</td></tr><tr><td>פיפטות פלסטיק</td><td>VWR-Samco</td><td>14670-147</td><td></td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Sigma</td><td>R2020-250 מ"ל</td><td>250 מ"ל</td></tr><tr><td>אמבט מים רועדים 12 ליטר</td><td>VWR</td><td>10128-126</td><td>12 ליטר</td></tr><tr><td>שייקר אנלוגי סטנדרטי</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Millipore-OmniPur</td><td>9210-500GM</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>tRNA שמרים</td><td>פישר-Invitrogen</td><td>15401011</td><td>25 מ"ג</td></tr><tr><td>טווין 20</td><td>סיגמא</td><td>P9416-50 מ"ל</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>פישר תעשיות מדעיות-מדעיות, בע"מ</td><td>50-728-002</td><td></td></tr><tr><td>ליתיום כלוריד (LiCl)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>203637-10G</td><td>10 גרם</td></tr></tbody></table>

wholemount ב באתרו הכלאה עבור עוברי astyanax

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

בשנים האחרונות, גנום טיוטה עבור מקסיקני עיוור cavefish (Astyanax mexicanus) שוחררה, לחשוף את זהותם רצף אלפי גנים. מחקר קודם במערכת מודל המתעוררים הזאת באותיות רישיות על חקירות הגנום כולו מקיף זיהו אינספור אתרים תכונה כמותית כמותיים המשויך פנוטיפים שונים הקשורים המערה. עם זאת, היכולת להתחבר הגנים של ריבית הבסיס heritable לשינוי פנוטיפי נשאר אתגר משמעותי. טכניקה אחת זה יכול להקל על הבנה עמוקה יותר של התפקיד של פיתוח באבולוציה troglomorphic הוא היברידיזציה כולה-הר. ניתן ליישם טכניקה זו כדי להשוות בין גנים בין המערה - ואת משטח המגורים טפסים, למנות מועמד גנים שבבסיס QTL הוקמה, לזהות את הגנים של עניין ממחקרים הדור הבא רצפי או לפתח את זה ישירות גישות מבוססות-גילוי. בדו ח זה, אנו מציגים פרוטוקול פשוט, הנתמך על-ידי רשימת תיוג גמיש, אשר ניתן להתאים באופן נרחב לשימוש הרבה מעבר למערכת המחקר הציג. יש לקוות כי פרוטוקול זה יכול לשמש משאב רחבה למען הקהילה Astyanax ומעבר.

בדו ח זה, אנו מספקים גישה פשוטה וישירה לביצוע תיוג של דגימות Astyanax עובריים לניתוח ביטוי גנים איכותיים. טכניקה זו יכולה להתבצע או ארבעה או חמישה ימים, כל שלב העיקריות בהליך מיוצג בתרשים זרימה מקודדות לפי צבעים (איור 1). עם סיום, מוכתם עוברי צריך הנמל תווית כרומטית סגול כהה ברקמות לבטא את גן מסוים של עניין. בהצלחה יישמנו פרוטוקול זה Pachón cavefish (איור 2A–B, E) והן עוברי דגים פני השטח...

פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של ביטוי גנים בעובריים Astyanax cavefish. גישה זו פותחה במטרה למקסם את אות של ביטוי גנים, תוך מזעור צביעת הרקע לא ספציפית.

Wholemount ב באתרו הכלאה עבור עוברי Astyanax

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

פרוטוקול in situ שלנו הוא משמעותי כי הוא מספק דרך פשוטה לדמיין דפוסי ביטוי גנים עם כתמי רקע מינימליים. טכניקה זו הופכת פרוטוקול מסובך וממושך לקל יחסית לביצוע. Benchtop להגדיר הצעות ורשימות פעולות לביצוע בתנאי להפוך פרוטוקול זה אפילו קל יותר לבצע כראוי לשכפל.בעוד הטכניקות המוצגות כאן הוא ספציפי Astyanax mexicanus, זה יכול להיות מותאם למערכות אחרות של אנשים בגודל יחסית עם התאמות קטנות לפרוטוקול. ראשית, השתמש בקלטת מעבדה צבעונית כדי לייעד בקבוקונים ופיפטות עבור כל גן. באמצעות פיפטה פסטר, למיין את העוברים.בדרך כלל יש לא יותר מ 12 עוברים לכל בקבוקון, פעם מיון. לאחר מכן, להגדיר אמבט מים רועדים ל 70 מעלות צלזיוס. משוך בזהירות את המתנול בבקבוקונים של עוברים ממוינים, והחלף אותו ב-500 מיקרוליטרים של מתנול טרי של 100%.לשטוף את העוברים לזמן קצר במשך כדקה על שייקר פלטפורמה. לאחר מכן, rehydrate העוברים בריכוז הולך וגדל של 1x PBS עם Tween 20 על שייקר פלטפורמה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להתחיל, מניחים אטם קטן עם תחתית רשת לתוך אמבט המים המסתובב שחומם מראש ל 70 מעלות צלזיוס.מניחים aliquots של חיץ הכלאה מינוס ומאגר הכלאה בתוספת לתוך אטם. הוסיפו בעדינות פתרון PK מוכן לבקבוקונים של עוברים המבטיחים שכל הרקמות מכוסות לחלוטין בתסיסה. מעבירים את הבקבוקונים לשייקר פלטפורמה ותנו להם לעכל את פתרון העבודה של proteinase K במשך כ-12 דקות.לאחר מכן, משוך בעדינות את פתרון ה- PK והציף בקצרה את הבקבוקון ב- PBT כדי לדלל את ה- PK הנותר. החלף את פתרון PBT עם 500 microliters של PBT טרי ולתת את הפתרון לשטוף על שייקר פלטפורמה במשך חמש דקות. לאחר מכן החלף את פתרון PBT ב-500 מיקרוליטרים של 4%PFA מופשרים. תן לעוברים דגירה על שייקר הרציף בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.כדי להתחיל בהכלאה מראש, הוסף 500 מיקרוליטרים של חיץ הכלאה טרום המלחמה מינוס פתרון לבקבוקונים המכילים עוברים. בזהירות למקם את הבקבוקונים לתוך אטם באמבט המים ב 70 מעלות צלזיוס מבלי לרעוד במשך חמש דקות. הבא למשוך את חיץ ההכלאה מינוס פתרון להציף את הבקבוקונים עם 500 microliters של מאגר הכלאה מראש המלחמה בתוספת פתרון.מניחים את הבקבוקונים בחזרה לתוך אטם באמבט המים דגירה עם רועד או במשך ארבע שעות או לילה. כדי להתחיל בהכלאה, משוך את מאגר ההכלאה פלוס מתוך הבקבוקונים והחלף אותו ב-500 מיקרוליטרים של מאגר הכלאה טרי לפני המלחמה פלוס. בזהירות להוסיף שני microliters של בדיקה RNA לכל בקבוקון בעדינות מערבולת כדי להבטיח הפצה שווה של החללית.דגירה באמבט המים ב 70 מעלות צלזיוס לילה תוך כדי רעידות ב 40 סל"ד. כדי להתחיל, להכין צינורות microcentrifuge שכותרתו מאגר הכלאה פלוס עם הגן של בדיקה RNA עניין כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הגדר שני צינורות חרוט 15 מיליליטר ולהוסיף 0.2 גרם של reagent חסימה ו 10 מיליליטר של MABT.מניחים את שני הצינורות על מערבל אגוזים עד שהריג'נט מומס לחלוטין בתמיסה. באמצעות פיפטה פסטר זכוכית לצייר את חיץ הכלאה פלוס פתרון בדיקה ולמקום אותו לתוך צינור microcentrifuge סטרילי שכותרתו. אחסן צינור זה במקפיא במינוס 20 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.בזהירות להוסיף 500 microliters של ציטראט נתרן מלוחים חמים חיץ הכלאה מינוס דילול. דגירה בפתרונות רציפים במשך 10 דקות כל אחד באמבט המים הרועדים, ולאחר מכן בטמפרטורת החדר על שייקר פלטפורמה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר הדגירה האחרונה, החלף את ה- PBT של 100% מכל בקבוקון ב- 500 מיקרוליטרים של MABT.חזור על תהליך זה פעמיים במשך חמש דקות כל אחד. ראשית, להסיר את MABT מכל בקבוקון ולהציף אותו עם פתרון חסימה premixed מאחד צינורות חרוט 15 מיליליטר. מניחים את שני הבקבוקונים על מערבל האגוזים במשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר.מוסיפים שני מיקרוליטרים של שברי הנוגדנים לצינור השני של פתרון חסימה מוכן ומערבולת לזמן קצר. לאחר מכן ממלאים כל בקבוקון כמעט לחלוטין בתווית חסימה ומכניסים אותם על מערבל אגוזים לילה במקרר בארבע מעלות צלזיוס. כדי להתחיל, להכין בקבוקון מניות של 10%NGS ב MABT.החלף את פתרון החסימה בכל בקבוקון ב- 500 מיקרוליטרים של פתרון NGS זה. דגירה בטמפרטורת החדר על שייקר הרציף במשך 25 דקות. לאחר מכן, החלף את תערובת ה- NGS ב- 500 מיקרוליטרים של 100% MABT.דגירה על שייקר פלטפורמה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. חזור על שטיפה זו 11 פעמים נוספות לאורך כל היום, כל 30 דקות. לאחר מכן ממלאים כל בקבוקון ב-100% MABT ומכניסים אותו למיקסר אגוזי לילה במקרר ב-4 מעלות צלזיוס.ראשית, החלף את MABT בכל בקבוקון עם מיליליטר אחד של חיץ AP ולתת לו לשטוף במשך חמש דקות. חזור על שטיפה זו פעמיים כדי להסיר לחלוטין את MABT. לאחר מכן החלף את מאגר AP במיליליטר אחד של מאגר AP טרי המכיל 3.5 מיקרוליטר של BCIP ו- 4.5 מיקרוליטר של MBT.החלף זאת בתערובת טרייה של מאגר AP המכיל את BCIP ו- MBT כל שעה עד להשלמת התגובה, הקפד לעקוב מקרוב אחר התגובה ולבדוק כל 15 דקות עד לרמת הכתמים הרצויה. עצור את תגובת הצבע על ידי שטיפת העוברים בריכוז הולך וגדל של PBT 1X במאגר AP כמתואר בפרוטוקול. שוטפים את העוברים בכ-5 מיליליטר של 100%PBT על מערבל אגוזים עד להכתמת הרקע המינימלית הרצויה.כאשר השטיפה הושלמה, לשטוף את העוברים ב 500 microliters של PBS סטרילי על שייקר פלטפורמה ו postfix הדגימות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר שטיפה העוברים, מניחים אותם בארבעה מיליליטר של 100% PBS סטרילי ואם יש צורך לאחסן אותם לטווח ארוך בארבע מעלות צלזיוס. במחקר זה דגימות Astyanax עובריות מסומנות לניתוח ביטוי גנים באיכות גבוהה.תהליך זה יושם בהצלחה הן בעוברים של דגי מערות פקון והן בעוברים של דגי שטח. עוברי דגי מערות המסומן בביטוי Sox9 מדגימים תיוג ברור בקשתות הענפיות המתפתחות ובסנפיר החזה. שים לב כי הכתמים נעדרים כמעט בוואק החלמון או בסומיטים המתפתחים באגף.באופן דומה, ביטוי Tfap2a ניכר בחלקים של הראש המתפתח כמו תאים סמל עצבי הגירה מוקדמת לאורך אזור האגף הגבי של העובר. הגן השלישי המוצג לעוברים של דגי מערות, Phf20a, נראה בחלקים של מסודרם סומטי וראש אחורי שנועדו ללדת רקמה גרמית. עוברי דג פני השטח המסווים ב- CXCR מראים תיוג חיובי באזורים מבודדים של הראש והאגף, כמו גם כמה תאים בודדים המגזים בשי החלמון.הגן Adcyap1a בא לידי ביטוי באזורים של מערכת העצבים המרכזית כולל תאי יותרת המוח. שים לב לביטוי הספציפי ביותר באשכולות דו-צדדיים משויך של תאים בהיבט הגבי של העובר, כמו גם אזור גדול יותר של ביטוי קו האמצע. הגן האחרון שנבדק לעוברים של דגי מערות, Sox10, ניכר כסמן מוקדם של סמל עצבי בצד שמאל וימין של העובר הגבי.לאחר השלמת situ, אנחנו בדרך כלל תמונה התוצאות שלנו באמצעות מיקרוסקופ אור. עדיף לעשות זאת בתוך שבועיים לאחר השלמת על מנת למנוע השפלה של כתמים.

wholemount-in-situ-hybridization-for-astyanax-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

סרט הווידאו הזה מדגים 2 צבעים הר שלם הכלאה באתרו, שיטה שבאמצעותה דפוס ביטוי במרחב ובזמן של 2 גנים שונים יכולים להיות דמיינו בעוברים אפרוח צעיר. שיטה זו הוצגה לראשונה על ידי דייוויד וילקינסון, דומינגוס אנריקה, פיל אינגהם ודוד איש-Horowicz.

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

וידאו זה מדגים כל הר אימונוהיסטוכימיה, שיטה שבאמצעותה דפוס ביטוי במרחב ובזמן של אנטיגן ניתן דמיינו בעוברים אפרוח צעיר. שיטה זו הוצגה לראשונה על ידי ג'יין דוד וטום Jessell.

שיטת מכתים נוגדן שלם הר ב צ&#39;יק

שימוש הר שלם באתרו הכלאה קישור לביולוגיה מולקולרית האורגניזם

הר שלם<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של E8.5 לעוברי E11.5 עכבר

על ידי שילוב של כל שיטות להר...

רנ&quot;א<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה בעוברי הר שלמים והיסטולוגיה הסלולרית מותאמת לElasmobranchs הימי

דג הזברה, דגים טרופיים קטנים, הפכה לדגם פופולרי ללימוד תפקוד גן במהלך התפתחות מחלה וחוליות. הביטוי של הזמן ומרחב של גני המטרה יכול להיקבע על...

הר שלם ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה בתוך עוברי דג הזברה לחקר ביטוי גנים ותפקוד

עובר Xenopus laevis ממשיך להיות שימושי במיוחד בחקר ההתפתחות המוקדמת בשל גודלו הגדול וקלות המניפולציה שלו.   מסופק פרוטוקול פשוט לפרוטוקול הכלאה של הרכבה שלמה באתרו שניתן להשתמש בו בזיהוי איברים ספציפיים במערכת מודל זו.

הבנת organogenesis המוקדם שימוש פשוטה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאת פרוטוקול ב<em&gt; Xenopus</em

עובר דג הזברה הוא מודל מצוין למחקר בביולוגיה התפתחותית. במהלך עובר, דג הזברה מתפתחת עם מסת חלמון, אשר מציבה אתגרים תלת ממדים לתצפית מדגם וניתוח. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור הכנות הר שטוחות דו ממדים של הר שלם באתרם דגימות (לוואי) מוכתמות דג הזברה עובר.

הר הכנה שטוחה לתצפית וניתוח של עובר דג הזברה דוגמאות ויטראז בהר שלם<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

אנו מציגים כאן פרוטוקול אופטימלי לגנוטיפ, צביעה והכנה של עכברים עובריים להדמיה של הקרנות אקסון נוציספטור היקפיות בבעל החיים כולו, כשיטה יעילה להערכת פנוטיפים של צמיחת אקסונים חושיים בפיתוח עכברים מהונדסים גנטית.

הדמיה הר-כל תחזיות החושיות אקסון העובר העכבר

צומת וצלחת notochordal בארעיותם איתות המארגנים בפיתוח עוברי העכבר זה ניתן לאבחן באמצעות מספר טכניקות. כאן נתאר בפירוט כיצד לבצע את שתי הטכניקות כדי ללמוד את המבנה ואת מורפוגנזה: 1) סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM); ו- 2) כל הר immunofluorescence (WMIF).

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור כל הר באתרו הכלאה של RNA ניתוח ב-דג זברה והיווצרות שפופרת שיטת החולה-נגזר המושרה תא גזע מתאים הנגזר ללמוד את התפקיד של אנגלין במערך כלי הדם.

הר שלם בתוך היברידיזציה ב-Zebrafish עוברים ושיטת היווצרות צינור ב-iPSC-ECs ללמוד את התפקיד של אנגלין בפיתוח כלי דם

למדו את פרוטוקול הכלאה באתרו לכל הרקמה לצפייה בביטוי גנים בעוברי Astyanax mexicanus עם רקע מינימלי. השיטה מפשטת תהליך מורכב ומספקת רשימות בקרה לשחזוריות.

Wholemount ב באתרו הכלאה עבור עוברי Astyanax

גלה סרטונים נוספים