Name: האטא ק-seq Assay עם זיהום נמוכה דנ א מיטוכונדריאלי של ראשי האדם CD4 + לימפוציטים מסוג T (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: למדו פרוטוקול ATAC-seq משופר ללימפוציטים CD4+ אנושיים עם חיץ ליזה חדש שמפחית זיהום מיטוכונדריאלי מ-50% לפחות מ-3%. השיטה מגבירה את איכות הנתונים ומפחיתה בעלות הריצוף ב-50%.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים Atsede Siba לקבלת תמיכה טכנית. C.S.C. נתמך על ידי NIH גראנט 1R61DA047032.

פרוטוקול משופרת זה מספק הוראות מפורטות לביצוע האטא ק-seq של CD4 + לימפוציטים, מתוך החומר ההתחלתי של דם מלא באמצעות ניתוח נתונים (איור 1).
1. בידוד תאי CD4 + T של דם מלא
הערה: חומר המוצא עבור פרוטוקול זה הוא 15 מ"ל של דם מלא טריים נאסף באמצעות הליכים סטנדרטיים, לאפשר מקור חומר המוצא שייבחר בהתבסס על דרישות המחקר. קנה המידה הפרוטוקול כנדרש. לחמם buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) + סרום עגל העובר 2% (FCS) לטמפרטורת החדר (RT) ולהתאים לצנטריפוגה כדי RT לפני תחילת ההליך העשרה תאי CD4 + T.
<ol><li>להוסיף µL 750 האנושי CD4 + תא T העשרה קוקטייל 15 מ"ל של דם מלא צינור חרוטי 50 מ"ל ומערבבים בעדינות על-ידי היפוך. תקופת דגירה-RT של 20 דקות. בתום דגירה, להוסיף 15 מ"ל של PBS + 2% FCS הצינור ומערבבים בעדינות על-ידי היפוך.</li>
	<li>הכן צינור חרוטי מ"ל עם 15 מ"ל של צפיפות בינונית. שכבת בקפידה את דגימת הדם מדולל על החלק העליון של המדיום צפיפות, להיות בטוח שלא לשבש את הממשק צפיפות בינונית/דם צורות. צנטריפוגה במשך 20 דקות ב- 1,200 x g ו- RT עם האצת מוגדר 1 ובלם יורד את. הערה: זה חיוני כדי להגדיר את ההאצה בלם את 1 וירידה לצנטריפוגה כדי למנוע שיבוש שכבת תאים המדיום צפיפות.</li>
	<li>איסוף תאי CD4 + T מועשר מממשק בינוני/פלזמה צפיפות באמצעות פיפטה העברה של גזע צר. העבר את התאים שנאספו צינור חרוטי מ"ל. Centrifuge תאי CD4 + T שנאספו במשך 8 דקות ב- 423- g ו- RT. הערה: ודא לחזור ההאצה צנטריפוגה בלם 9 ו יורד כ- ON עבור שלב 1.3 ואת כל השלבים הבאים.</li>
	<li>למחוק את תגובת שיקוע לשטוף בגדר תא פעמיים עם 50 מ של PBS + 2% FCS, צריך שתוציאו במשך 8 דקות ב 423 x g ו- RT. להשליך את תגובת שיקוע הסופי וקונטה להשעות בגדר תא שטף ב 2 מ"ל של PBS + 2% FCS.</li>
	<li>ספירת תאים באמצעות של hemocytometer. כדי להמשיך עם האטא ק-seq, המשך לשלב 2.3. כדי להקפיא תאים עבור עיבוד מאוחר יותר, להמשיך לצעוד 1.6.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של מדיום קפוא טרי (FCS 90% + 10% דימתיל סולפוקסיד) לכל 1 מיליון תאים. Aliquot 1 מ"ל של תאים קפואים בינוני צינורות בטוח ההקפאה. הצב צינורות ב-80 מעלות צלזיוס למשך הלילה במיכל קירור איטי. למחרת, העברת צינורות חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. הערה: 1 מיליון תאי CD4 + T יהיה מבודד לכל 2 מיליליטר לאמצעי האחסון המקורי של דם מלא. הקפאת תאים 500,000 aliquots 1 מ"ל של מדיום מקפיא. הופך בינוני קפוא טרי-כל שימוש.</li>
</ol>2. להפעיל ולטהר CD4 + T תאים
הערה: פרוטוקול מהיר זה לשם הפעלת וטיהור תאי CD4 + T רק דורש 48 שעות ותוצאות 95% קיימא, מופעלים תאי CD4 + T. מגניב לצנטריפוגה עד 4 ° C לפני תחילת בפרוטוקול.
<ol><li>להפשיר את מבחנה 1 (500,000) של תאי CD4 + T באמבט מים 37 ° C עד הקרח נמס פשוט. בעדינות להעביר תאים צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 9 מיליליטר מראש ומחוממת מדיה רוזוול פארק אנדרטת המכון-1640 (RPMI-1640) בתוספת 10% FCS, ןלהל RPMI מלאה. הערה: אל תתנו תאים להפשיר לחלוטין כדי להימנע מחשיפה דימתיל סולפוקסיד.</li>
	<li>צנטריפוגה במשך 6 דקות ב-1500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע, בעדינות להשעות את צניפה ב 2 מ של RPMI מלאה. חזור על הספין למטה, למחוק את תגובת שיקוע ולאחר בעדינות להשעות את התאים ב- 0.5 מ של RPMI מלאה.</li>
	<li>לספור את התאים באמצעות hemocytometer. להתאים את הצפיפות של התליה תא עם RPMI מלאה על צלחת 50,000 תאים µL 200 לאדם טוב של צלחת תחתית עגולה 96-ובכן. הערה: מהצינור קפוא אחד של 500K CD4 + T תאים, צלחת 10 בארות של 50,000 CD4 + T תאים ב- µL 200 לכל טוב.</li>
	<li>
להכין beads מגנטי מצומדת עם נוגדנים אנטי CD3 ו- anti-CD28 T-מפעיל אנושי.
	<ol>
<li>µL 12.5 aliquot של חרוזים T-מפעיל CD3/CD28 אנושי לכל האטא ק-seq הדגימה כדי צינור 1.5 מ. לשטוף את החרוזים עם 1 מ"ל של 1 x PBS ומניחים את הצינורית על מגנט 1 דקות.</li>
		<li>בזהירות להסיר, למחוק את תגובת שיקוע ברורה להסיר את הצינורית של מגנט, להשעות את החרוזים 13 µL להשלים את RPMI עבור דגימה האטא ק-seq. הערה: לחשב את כמות החרוזים הדרושים לפי מספר דוגמאות האטא ק-seq המעובדות. פרוטוקול זה דורש µL 12.5 של CD3/CD28 חרוזים לכל התאים 500,000, המהווה דוגמא אחת האטא ק-seq.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להפעיל את תאי CD4 + T. איסוף תאים 500,000 מ 2.1 ל RPMI מלאה, במדיום צינור חרוטי 15 מ"ל ולהוסיף µL 12.5 של טרום שטף חרוזים T-מפעיל אנושי. מערבבים בעדינות על-ידי היפוך ברכבת התחתית.</li>
	<li>בעדינות העבר את התאים עם חרוזים סטרילי מאגר וצלחת 200 µL של תאים עם חרוזים לכל טוב של צלחת 96-ובכן התחתון עגול באמצעות פיפטה של רב ערוצית. תקופת דגירה של 48 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 מיכלים.</li>
	<li>פוסט דגירה, centrifuge את הצלחת 96-ובכן במשך 8 דקות ב- 423- g ו- 100 להסיר RT. µL בינוני לכל טוב מהצלחת 96-ובכן, איסוף זה צינור חרוטי לפני השלכת כדי להבטיח ללא אובדן חרוז. Resuspend בגדר תא ב µL 100 הנותרים ולאסוף כל בשפופרת 1.5 mL. הערה: בארות 10 תאי T מופעל ייאספו באמצעי אחסון 1 מ"ל.</li>
	<li>לבצע CD4 + בידוד. הוסף µL 50 של חרוזים CD4 מצומדת טרום שטף לתאים 500,000 מ 1 ל RPMI מלאה. לשלב חרוזים ותאים באמצעות פיפטה. תקופת דגירה של 20 דקות ב 4 ° C במקרר. להתסיס ושרשרות תא תערובת כל 6 דקות. הערה: פרוטוקול זה נועד לשמש דוגמא אחת של תאים 500,000. להתאים ככל הדרוש עבור שניים או יותר דוגמאות 500,000.</li>
	<li>עם השלמת הדגירה, מניחים את הצינורית על המגנט עבור 2 דק להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע כאשר ברור. לשטוף את התאים מאוגד-חרוז על ידי הסרת את הצינור המגנט, השעיית התאים חרוז מכורך 1 מ"ל של PBS + 2% FCS, החלפת הצינור על המגנט עבור 1 דקות השמטת את תגובת שיקוע ברורה. חזור על תהליך זה סה"כ 3 מנקי. הערה: יש להיזהר לא למחוק את כל החרוזים במהלך שוטף.</li>
	<li>לאחר השטיפה הסופית במקום הצינור על המגנט עבור 1 מינימלית להסיר, למחוק את תגובת שיקוע ומניחים על בגדר על קרח. המשך סעיף 3 (האטא ק-seq).</li>
</ol>3. האטא ק-seq
הערה: בשלב זה, גרעינים מבודדים מתאי CD4 + T מופעל עבור האטא ק-תת סעיף. המאגר פירוק בשימוש פרוטוקול זה שופר להיות עדינה על הגרעינים, וכתוצאה מכך לעיכול יעיל יותר, תוצאות באיכות גבוהה יותר. כל השלבים צנטריפוגה בסעיף 3 מבוצעות באמצעות צנטריפוגה קבוע-זווית ומתוחזק על 4 מעלות צלזיוס. מגניב לצנטריפוגה לפני תחילת פרוטוקול.
<ol><li>לבצע בידוד רב-קוטבי. Resuspend חרוזים והתאים עם פירוק קר מאגר (10 מ מ טריס-HCl, pH 7.4, 10 מ מ NaCl, 3 מ מ MgCl2, polysorbate 0.03% 20). צנטריפוגה מיד ב x 500 g 10 דקות ב 4 º C. להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>לבצע את התגובה transposase. להשעות בגדר גרעינים מבודד עם 50 µL של Tn5 transposase מיקס (טבלה 1). דגירה ב thermocycler במשך 30 דקות ב 37 ° C עם מכסה 40 ° צלזיוס, מחזיק ב 4 ° C בסיום.</li>
	<li>לאחר thermocycling, מיד לבצע סיבוב צנטריפוגה מהירה benchtop למטה ומניחים את הצינורית על המגנט עבור 1 דקות להסיר את החרוזים של המוצר.</li>
	<li>העבר את תגובת שיקוע ברור מהצינור על המגנט על עמודה טיהור DNA. לשטוף את העמודה פעם 250 µL של המאגר PB, פעמיים עם 750 µL של המאגר PE. Elute הדגימה ב µL 10 • תנאי המאגר. המשך ישירות לשלב 3.5. הערה: שלב זה מגביר את שברי DNA עם מתאמים מחוברים, המכונים כאן הספרייה האטא ק-seq. כדי מגה-פלקס מספר ספריות האטא ק-seq להתנהל אחד המיתרים ליין, להשתמש מדד פריימר 1 עבור כל דוגמאות ו- 2 פריימר אינדקס שונים לקבלת דוגמאות בודדות (טבלה 2). תחל משמשים עובד ריכוזים של 1.25 מיקרומטר.</li>
	<li>להגדיר את התגובה הראשונית של הגברה PCR בשפופרת נטולת נוקלאז PCR, שילוב הרכיבים השונים ההזמנה ואת אמצעי האחסון שצוין ב- טבלה 3- למקם את צינור ה-PCR thermocycler ולהפעיל את התוכנית הגברה PCR עם תנאי הרכיבה כמפורט בטבלה4.</li>
	<li>
נטר את התגובה על ידי qPCR. להגדיר את התגובה qPCR בשפופרת נטולת נוקלאז PCR, שילוב הרכיבים השונים ההזמנה ואת הסכום הנקוב בטבלה 5. המקום המכונה qPCR, מחזור כמו שצוין ב טבלה 6.
	<ol>
<li>כדי לקבוע את שהמספר האופטימלי של הגברה נוספת מחזורים עבור התגובה 45 µL הנותרים, ליצור מגרש עם מחזור מספר על ציר ה-x ואת יחסי קרינה פלואורסצנטית (RFU) בציר ה-y. המספר האופטימלי של מחזורים נוספים הגברה הוא שליש מספר מחזורים שלוקח את התגובה qPCR להגיע אל הרמה. הערה: ניטור התגובה על ידי qPCR מאפשרת קביעה של מספר מחזורים PCR הרצוי כדי לקבל הגברה פרגמנט ספריית אופטימלית תוך מזעור GC תוכן ודעות קדומות גודל אופטימלי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להשלים הגברה PCR הסופי של µL 45 הנותרים של תגובת ה-PCR. מקום ברכבת התחתית PCR עם התגובה הגברה מהשלב 3.5 חזרה thermocycler ולהפעיל את התוכנית כפי שמתואר בטבלה 7. הערה: לקבלת דוגמאות מעובד כפי שמתואר פרוטוקול זה, המספר הכולל אופטימלית של PCR הגברה מחזורים היה נחוש בדעתו להיות 12.</li>
	<li>בתום ההגברה, לטהר את ספריות באמצעות ערכת ניקוי PCR הפרוטוקול של היצרן, eluting ב- 25 µL של המאגר • תנאי. הערה: ספריות מוגבר יכול להיות מאוחסן ב 4 ° C עבור עד 48 שעות או קפוא ב-20 ° C לאחסון לטווח ארוך.</li>
</ol>4. האטא ק-seq ספריית ותמרוקים
הערה: חשוב לאמת את האיכות והכמות של ספריות האטא ק-seq לפני הדור הבא רצפי. וצריך להעריך את האיכות והכמות של הספריות באמצעות ערכות זמינים מסחרית (ראו טבלה של חומרים).
<ol><li>להעריך את האיכות והכמות של ספריות האטא ק-seq באמצעות פלטפורמה מבוססת מיקרופלואידיקה אחיזה לשינוי גודל, כימות של בקרת איכות של ה-DNA. ראה איור 2 תוצאות הערכת איכות נציג. הערה: בטח הריכוז ATAC-seq ספריות > 1 ng/µL כדי להשיג תוצאות איכותיות רצף. בממוצע, 30 nM, 25 µL הושג.</li>
</ol>5. רצף וניתוח נתונים
הערה: צינור ניתוח זה מאפשר למשתמשים לשלוט באיכות של קריאות מיפוי הליך, להתאים את קואורדינטות עבור תכנון ניסויים, אקרא פסגות לניתוח במורד הזרם. להלן פקודות קווים והסבר על ביצוע. חבילת ניתוח הנתונים זמין (https://github.com/s18692001/bulk_ATAC_seq).
<ol><li>רצף של ספריות מוכן על ברצף הדור הבא עומק קריאה ממוצע של 42 מיליון קריאות עבור דגימה.</li>
	<li>להעריך את האיכות של רצף פעולות הקריאה על-ידי בדיקת קבצים שנוצרו על ידי FastQC12 חבילת תוכנה באמצעות הפקודה: fastqc -o < output_directory >< fastq_file ></li>
	<li>לקצץ הבסיסים של קריאות על ידי תוכנה13 Trimmomatic, אם יש צורך, כפי שנקבע על ידי בדיקת איכות FastQC, בעזרת הפקודה ' ' (עבור זוג הסתיימה): java-צנצנת < נתיב לקובץ jar trimmomatic > PE < input1 >< input2 >< output1 לזווג >< אינטראקצית output1 >< לזווג output2 >< output2 אינטראקצית > HEADCROP: < לחתוך בסיסים ></li>
	<li>ליישר שאוחזרו כדי הגנום האנושי הפניה (hg38) על-ידי תוכנת14 Bowtie2: bowtie2 - x < הפניה הגנום >-1 < קלט זוג 1 >< קלט זוג 2 > -S < קובץ הפלט סאם > הערה: ארגומנט ה - x עבור basename של האינדקס עבור הגנום הפניה, -S לפלט בתבנית סם.</li>
	<li>בדוק ופיתחתיאיכות הקריאות ממופים באמצעות Samtools15 flagstat החבילה: samtools flagstat < באם הקובץ ></li>
	<li>למיין את קובץ ממופה קריאות, להסרת כפילויות בכלי16 פיקרד: java-ג'אר picard.jar SortSam קלט = < שם קובץ סאם קלט > פלט = < שם קובץ באם פלט ממוין > SORT_ORDER = קואורדינטות "ו" java-ג'אר picard.jar MarkDuplicates קלט = < ממוינים באם קובץ > פלט = < באם פלט קובץ ללא כפילויות > REMOVE_DUPLICATES = TRUE</li>
	<li>קובץ אינדקס בם, לקצץ את קריאות כרומוזום שאינם בשימוש ולהזיז את הקואורדינטות מהסיבה ניסיוני האטא ק-seq17: java-ג'אר picard.jar BuildBamIndex קלט = < באם הקובץ > samtools idxstats < Input באם קובץ > | לחתוך -f 1 | grep - v chrY | grep - v chrM | grep - v chrUn | xargs samtools להציג -b < קובץ הקלט BAM >>< פלט גזוז באם הקובץ > bedtools bamtobed -i < Input גזוז באם הקובץ >>< פלט גזוז מיטה קובץ > אתה תקבל את המגיע ' להתחיל {שבטוב = "\t"}; {אם (6 דולר = = "+") הדפס $1, 2 + 4 דולר, 3 + 4 דולר, 4 דולר, 5, 6; הדפסה אחר $1, 2-5, 3-5, 4 דולר, 5 דולר, 6 דולר}' < Input גזוז מיטה קובץ >< Trimmed העביר את המיטה קובץ ></li>
	<li>מחק את הקורא את יוזזו כדי תיאום שלילי: אתה תקבל את המגיע '{אם (2 דולר > 0) הדפסה $1 "\t" 2 "\t" 3 דולר "\t" 4 דולר "\t" 5 "\t" 6 דולר}' < Input מיטה קובץ >< קובץ הפלט לא שלילי תיאום מיטה >.</li>
	<li>להמיר את הקובץ מיטה לקובץ באם לניתוח18 DiffBind הבאים: bedtools bedtobam -i < קובץ הקלט מיטה > -g < הפניה הגנום >< באם פלט קובץ ></li>
	<li>לבצע שיא הביקור על-ידי חבילת תוכנה18 DiffBind: macs2 callpeak -t < Input באם קובץ > -f בום -g hs - nomodel - nolambda - שמור-dup כל - קריאה-פסגות - outdir < נתיב הספריה פלט > - n < שם פלט > -B - q 0.01..--bdg - shift-100 - extsize 200 הערה: לאחר סינון, מצפה החציוני של 37 מליון קריאות עבור דגימה. זיהום דנ א מיטוכונדריאלי ינוע מ 0.30% – 5.39% (1.96% בממוצע). יהיו קצב נמוך של קריאות להכפיל ממופה (6.7% – 56%, 19% בממוצע) וקורא אחוז גבוה יחסית של שמיש גרעינית (60% – 92%, 79% בממוצע).</li>
</ol>

<ol><li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin%2C+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).</li>
<li>Song, L., Crawford, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNase-seq%3A+a+high-resolution+technique+for+mapping+active+gene+regulatory+elements+across+the+genome+from+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2010).</li>
<li>Pajoro, A., Muiño, J. M., Angenent, G. C., Kaufmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+Nucleosome+Occupancy+by+MNase-seq%3A+Experimental+Protocol+and+Computational+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1675, 167-181 (2018).</li>
<li>Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAIRE+%28Formaldehyde-Assisted+Isolation+of+Regulatory+Elements%29+isolates+active+regulatory+elements+from+human+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin.</a> Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).</li>
<li>Rosenberg, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+profiling+of+the+developing+mouse+brain+and+spinal+cord+with+split-pool+barcoding%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding.</a> Science. 360 (6385), 176-182 (2018).</li>
<li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage-specific+and+single-cell+chromatin+accessibility+charts+human+hematopoiesis+and+leukemia+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution.</a> Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).</li>
<li>Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+ATAC-seq+with+nuclei+sorting+for+discovery+of+cis-regulatory+regions+in+plant+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes.</a> Nucleic Acids Research. 45 (6), e41(2017).</li>
<li>Lara-Astiaso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+state+dynamics+during+blood+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin state dynamics during blood formation.</a> Science. 345 (6199), 943-949 (2014).</li>
<li>Gate, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+determinants+of+co-accessible+chromatin+regions+in+activated+T+cells+across+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic determinants of co-accessible chromatin regions in activated T cells across humans.</a> Nature Genetics. , (2018).</li>
<li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+interrogation+of+functional+elements+in+the+noncoding+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome.</a> Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).</li>
<li>Andrews, S. FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. Babraham Bioinformatics. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc</a> (2018).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Broad Institute. Picard Tools. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://broadinstitute.github.io/picard/">http://broadinstitute.github.io/picard/</a> (2018).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Stark, R., Brown, G. DiffBind: Differential Binding Analysis of ChIP-Seq Peak Data. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://bioconductor.org/packages/devel/bioc/vignettes/DiffBind/inst/doc/DiffBind.pdf">http://bioconductor.org/packages/devel/bioc/vignettes/DiffBind/inst/doc/DiffBind.pdf</a> (2018).</li>
<li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+ATAC-seq+protocol+reduces+background+and+enables+interrogation+of+frozen+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues.</a> Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+accessible+chromatin+in+mammalian+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos.</a> Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול האטא ק-seq ששונה שהוצגו במאמר זה מספק תוצאות לשחזור עם זיהום דנ א מיטוכונדריאלי מינימלי. הפרוטוקול כבר להתרגל בהצלחה לאפיין כרומטין הארכיטקטורה של האדם העיקרי PBMCs10, ומונוציטים אנושי, העכבר תאים דנדריטים (לא פורסם), ו מלנומה בתרבית תאים קווים מספר11. אנו צופים זה פירוק משופרת מצב יש פוטנציאל לעבוד עבור סוגי תאים אחרים גם כן. זה צפוי גם כי פרוטוקול בידוד זה גרעינים יהיה תואם עם גרעינים יחיד האטא ק-seq פרוטוקולים, צמצום זיהום דנ א מיטוכונדריאלי לשיפור רצף תוצאות.</...

וזמינותו של כרומטין transposase נגיש רצף (האטא ק-seq) הפך במהירות השיטה המובילה עבור חקירת ארכיטקטורת כרומטין. האטא ק-seq ניתן לזהות אזורים של כרומטין נגיש באמצעות התהליך של tagmentation מזימות, תיוג של ה-DNA על ידי האנזים, כדי לייצר ספריות אשר הרצף ניתן לקבוע כרומטין נגישות מעבר הגנום כולו. תהליך זה tagmentation מתווך על ידי היפראקטיבי Tn5 transposase, אשר רק חותך אזורים פתוחים של כרומטין עקב מכשול הסטריים nucleosomic. בזמן שזה חותך, transposase Tn5 מוסיף גם מתאמים רצף המאפשרים בנייה מהירה ספריה על ידי ה-PCR ורצף הדור הבא של הגנום כולו נגיש כרומטין1,2.
האטא ק-seq הפכה השיטה המועדפת כדי לקבוע אזורים של כרומטין נגישות עקב פרוטוקול יחסית פשוטה ומהירה, איכות ומגוון של מידע יכול להיקבע מן התוצאות שלה, ואת כמות קטנה של החל החומר הנדרש. בהשוואה DNase-seq3 (אשר גם מודד את נגישות כרומטין הגנום כולו), MNase-seq4 (הקובע נוקלאוזום עמדות באזורים פתוחים גנום), בתיווך פורמלדהיד שלהם-seq5, האטא ק-seq הוא מהיר יותר, יותר זול, יותר לשחזור1. זה גם יותר רגיש, עבודה עם החל חומר של מעטים כמו גרעינים 500, לעומת 50 מיליון גרעינים הדרושות DNase-seq3. האטא ק-seq יש גם את היכולת לספק מידע נוסף אודות אדריכלות כרומטין מאשר בשיטות אחרות, כולל אזורים של איגוד פקטור שעתוק, מיצוב נוקלאוזום כרומטין פתוח אזורים1. פרוטוקולים האטא ק-seq יעיל, תא בודד יש מאומת, המספקים מידע על האדריכלות כרומטין החד-תאיים ברמה6,7.
האטא ק-seq שימש לאפיון אדריכלות כרומטין על פני קשת רחבה של סוגי תאים ומחקר, כולל צמחים8, בני9ו רבים אורגניזמים אחרים. הוא גם היה קריטי בזיהוי epigenetic רגולציה של המחלה הברית7. עם זאת, פרוטוקול האטא ק-seq הנפוצה ביותר כולל את החיסרון העיקרי של זיהום קריאות רצף של דנ א מיטוכונדריאלי. כמה ערכות נתונים, רמת זיהום יכול להיות גבוה ככל 60% של רצף תוצאות1. יש מאמץ בשדה כדי להפחית את קריאות מיטוכונדריאלי מזהמים אלה על מנת לאפשר ליישום יעיל יותר האטא ק-seq7,10,11. כאן אנו מציגים פרוטוקול seq האטא ק משופר אשר מפחית את שיעור הזיהום דנ א מיטוכונדריאלי רק 3%, המאפשר צמצום של-50% תוך רצף עולה10. זה התאפשר על ידי תהליך מיועל של לימפוציטים בידוד CD4 + ואת הפעלת מאגר פירוק משופרת שחיוני במטרה למזער את הזיהום דנ א מיטוכונדריאלי.
פרוטוקול modifiedATAC-seq זה אומתה עם מגוון רחב של ראשי תאים, כולל דם היקפיים ראשי אדם תאי תאים (PBMCs)10, ומונוציטים ראשי האדם העכבר תאים דנדריטים (לא פורסם). הוא גם שימש בהצלחה לחקור מלנומה שורות תאים במסך חזרה palindromic קצר באופן קבוע interspaced (CRISPR) באשכולות של רכיבים ללא קידוד11. בנוסף, חבילת ניתוח הנתונים המתוארים פרוטוקול זה וסיפק על GitHub מספק חוקרים חדשים ומנוסה עם כלים לניתוח נתונים האטא ק-seq. האטא ק-seq וזמינותו היעיל ביותר כדי למפות כרומטין נגישות מעבר הגנום כולו, שינויים בפרוטוקול הקיים אשר הציג כאן יאפשר החוקרים להפיק נתונים באיכות גבוהה עם זיהום נמוכה דנ א מיטוכונדריאלי, צמצום עלויות רצף ושיפור תפוקת האטא ק-seq.

<table><tbody><tr><td>1x PBS,</td><td>גיבקו</td> סטרילי <td>10010023</td><td>יכול להשתמש במוצרים דומים אחרים.</td></tr><tr><td>5810/5810&nbsp; R דלי נדנדה צנטריפוגה מקוררת עם דליי צינור של 50 מ"ל, 15 מ"ל ו-1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>22625501</td><td>יכול להשתמש במוצרים דומים אחרים.</td></tr><tr><td>96 צלחת תחתונה עגולה היטב</td><td>Thermo Scientific</td><td>163320</td><td>יכול להשתמש במוצרים דומים אחרים.</td></tr><tr><td>Agilent 4200 Tape Station System</td><td>Agilent</td><td>G2991AA</td><td>מוצע להערכת איכות.</td></tr><tr><td>Cryotubes</td><td>Thermo Scientific</td><td>374081</td><td>יכול להשתמש במוצרים דומים אחרים.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>יכול להשתמש במוצרים דומים אחרים.</td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11131D</td><td>רכיב קריטי</td></tr><tr><td>Dynabeads ערכת תאי CD4 T אנושיים שלא נגעו</td><td>בהם Invitrogen Life Technologies</td><td>11346D</td><td>רכיב קריטי</td></tr><tr><td>Dynamagnet</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>12321D</td><td>רכיב קריטי</td></tr><tr><td>FCS</td><td>מוצרי ביו Gemini</td><td>100-500</td><td>יכול להשתמש באחרים דומים מוצרים.</td></tr><tr><td>ערכת DNA ברגישות גבוהה</td><td>Agilent</td><td>50674626</td><td>מוצעת להערכת איכות.</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד, הקסהידרט, ביולוגיה מולקולרית כיתה</td><td>סיגמא</td><td>M2393</td><td>יכול להשתמש במוצרים דומים אחרים.</td></tr><tr><td>ערכת טיהור PCR MinElute (מאגר PB, מאגר PE, מאגר אלוטיון)</td> <td>Qiagen</td><td>28004</td><td>רכיב קריטי</td></tr><tr><td>מר פרוסטי</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>5100-0001</td><td>יכול להשתמש במוצרים דומים אחרים.</td></tr><tr><td>NaCl, ביולוגיה מולקולרית בדרגה</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>יכול להשתמש במוצרים דומים אחרים.</td></tr><tr><td>NEBNext High Fidelity 2x PCR Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0541</td> ערכת הכנת <td>ספריית DNA Nextera Critical Component</td></tr><tr><td>(2x TD Buffer, Tn5 Enzyme)</td><td>Illumina</td><td>FC1211030</td><td>רכיב קריטי</td></tr><tr><td>ללא נוקלאז dH20</td><td>Gibco</td><td>10977015</td><td>יכול להשתמש במוצרים דומים אחרים.</td></tr><tr><td>פוליסורבט 20 (Tween20)</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>יכול להשתמש במוצרים דומים אחרים.</td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25780</td><td>רכיב קריטי</td></tr><tr><td>אמבט מים מדויק</td><td>Thermo Scientific</td><td>TSGP02</td><td>יכול להשתמש במוצרים דומים אחרים.</td></tr><tr><td>ערכת טיהור PCR מהירה QIAGEN</td><td></td><td>28104</td> ערכת בדיקה של <td>רכיב קריטי</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Invitrogen</td><td>Life Technologies</td><td>Q32851</td><td>מוצעת להערכת איכות.</td></tr><tr><td>Qubit FlouroMeter</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>Q33226</td><td>מוצע להערכת איכות.</td></tr><tr><td>רוזטה ספטמבר אנושי CD4+ צפיפות</td><td>בינונית טכנולוגיות תאי גזע</td><td>15705</td><td>רכיב קריטי</td></tr><tr><td>רוזטה ספטמבר אנושית CD4+ העשרה קוקטייל</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>15022</td><td>רכיב קריטי</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>יכול להשתמש במוצרים דומים אחרים.</td></tr><tr><td>Sterile Resevoir</td><td>Thermo Scientific</td><td>8096-11</td><td>יכול להשתמש במוצרים דומים אחרים.</td></tr><tr><td>T100 Thermocycler עם מכסה מחומם</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td>יכול להשתמש במוצרים דומים אחרים.</td></tr><tr><td>Tris-HCL</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>יכול להשתמש במוצרים דומים אחרים.</td></tr></tbody></table>

האטא ק-seq assay עם זיהום נמוכה דנ א מיטוכונדריאלי של ראשי האדם cd4 + לימפוציטים מסוג t

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

האטא ק-seq הפך מתודולוגיה בשימוש נרחב במחקר של אפיגנטיקה בשל גישתה מהירה ופשוטה מיפוי הגנום כולו נגיש כרומטין. במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול seq האטא ק משופר אשר מפחית את זיהום קריאות דנ א מיטוכונדריאלי. בעוד פרוטוקולים האטא ק-seq הקודם נאבקו עם קורא ממוצע של 50% מזהמות דנ א מיטוכונדריאלי, המאגר פירוק ממוטבת הציג פרוטוקול זה מפחית את זיהום דנ א מיטוכונדריאלי ממוצע של 3%. פרוטוקול זה seq האטא ק משופר מאפשר ירידה 50% ליד העלות רצף. נדגים כיצד ניתן להכין ספריות האטא ק-seq אלה באיכות גבוהה מופעל CD4 + לימפוציטים, מתן הוראות שלב אחר שלב של CD4 + בידוד לימפוציט של דם דרך ניתוח נתונים. פרוטוקול seq האטא ק משופר זה אומתה במגוון רחב של סוגי תאים ויהיה תועלת מיידית והטייפונים נגישות כרומטין.

מ- 15 מ"ל של דם טרי, פרוטוקול זה יוצר ממוצע של 1 מיליון תאי CD4 + T. אלה יכולים להיות קפוא לעיבוד מאוחר יותר או שימוש באופן מיידי. הכדאיות של תאי CD4 + T, טריים או המופשרים, היה עקבי &gt; 95%. שיטה זו של בידוד תאי CD4 + T מאפשר גמישות בזמן חומר ואוסף מקור. פרוטוקול seq האטא ק משופר זה מייצר ספרייה הסופי של יותר מ 1 ng/µL עבור רצף. בקרת איכות המבוצעת באמצעות מערכות זמינים מסחרית צריך להפגין שברי DNA בין 200 ל 1,000 bp (איור 2). רצף צריכה להתבצע רק עם ספריות בא...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע וזמינותו של כרומטין transposase נגיש רצף (האטא ק-seq)-מופעל CD4 + האדם לימפוציטים. הפרוטוקול שונתה כדי למזער מזהמים קריאות דנ א מיטוכונדריאלי מ 50% ל-3% דרך המבוא של מאגר פירוק חדש.

האטא ק-seq Assay עם זיהום נמוכה דנ א מיטוכונדריאלי של ראשי האדם CD4 + לימפוציטים מסוג T

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

פרוטוקול ATAC-seq שונה זה מציג מאגר תזהמה חדש המפחית קריאות מיטוכונדריות מזהמים מ 50% לפחות מ 3%הזיהום המיטוכונדריאלי ירד יאפשר לחוקרים לבצע יעיל יותר ATAC-seq עם ירידה של 50% בעלויות רצף. אמתנו פרוטוקול ATAC-seq חדש זה במחשבים אישיים ראשוניים אנושיים, מונוציטים ראשוניים אנושיים, תאים דנדריטיים של עכברים וקווי תאים מלנומה. אנו מאמינים שזה יהיה יעיל במגוון רחב של סוגי תאים.מזעור אובדן הדגימה במהלך תהליך ההפעלה והבחירה של התא הוא קריטי להשגת תוצאות באיכות גבוהה באמצעות ATAC-seq. אנו נדגים כיצד לטפל במספר קטן של תאים מדגימות יקרות באמצעות ציוד מעבדה בסיסי. כדי להתחיל, להפשיר בקבוקון אחד של תאי CD4 + T מבודדים בעבר באמבט מים צלזיוס 37 מעלות עד הקרח רק נמס.ואז בעדינות להעביר את התאים לצינור חרוט 15 מיליליטר המכיל תשעה מיליליטר של RPMI מלא מחומם מראש. צנטריפוגה התאים ב 1, 500 פעמים G, וארבע מעלות צלזיוס, במשך שש דקות. ואז להשליך את supernatant, בעדינות resuspend את גלולה בשני מיליליטר של RPMI מלא.לאחר חזרה על הצנטריפוגה, השלך את העל-טבעי, ולחץ בעדינות על התאים ב- 0.5 מיליליטר של RPMI מלא. השתמש בהמוציטומטר כדי לספור את התאים. באמצעות RPMI מלא, להתאים את צפיפות מתלי התא לצלחת 50, 000 CD4 + תאים ב 200 microliters ל הבאר של צלחת 96 גם עגול למטה.לאחר מכן, כדי להכין חרוזים מגנטיים, aliquot 12.5 microliters של גם T-Activator אנושי CD3/CD28 חרוזים לכל מדגם ATAC-seq לצינור 1.5 מיליליטר. מוסיפים מיליליטר אחד של 1x PBS לצינור, וממקמים אותו על מגנט למשך דקה אחת כדי לשטוף את חרוזים. בזהירות להסיר ולהשליך את העל טבעי ברור, ולהסיר את הצינור מן המגנט.יש למצות את חרוזים ב-13 מיקרוליטרים של דגימת RPMI מלאה לדגימה של ATAC-seq. כדי להפעיל את תאי CD4+T עם הריכוז המותאם, לאסוף 500, 000 תאים ב 2.1 מיליליטר של מדיום RPMI מלא בצינור חרוט 15 מיליליטר. הוסיפו 12.5 מיקרוליטרים של גם בחנוזי T-Activator אנושיים, שהוכנו ונשטפו בשלבים קודמים, ומערבבים בעדינות על ידי היפוך הצינור.לאחר מכן מעבירים בעדינות את התאים, עם חרוזים, למאגר סטרילי. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, צלחת 200 מיקרוליטרים של תאים עם חרוזים ל הבאר של צלחת עגולה 96 באר, וחנקובות ב 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2 אינקובטור במשך 48 שעות. לאחר הדגירה המלאה, צנטריפוגה הצלחת ב 423 פעמים G, וטמפרטורת החדר, במשך שמונה דקות.הסר 100 microliters של בינוני מכל באר, ולאסוף אותו בצינור חרוט לפני השלכת, על מנת לאשר שום אובדן חרוזים. ואז תן שימוש חוזר לכדור התא ב-100 המיקרוליטרים הנותרים של המדיום, ואאסוף הכל בצינור של 1.5 מיליליטר. כדי לבודד CD4+תאים, הוסף 50 מיקרוליטרים של חרוזים מצומדים CD4 שנשטפו מראש ל- 500, 000 תאים במיליליטר אחד של RPMI מלא, והתהפך כדי לערבב.דגירה במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס, תוך כדי תנועה ידנית כל שש דקות כדי לערבב. מניחים את הצינור על המגנט במשך שתי דקות, עד על טבעי ברור, ולאחר מכן להסיר ולהשליך. הסר את הצינור מהמגנט.לשטוף את התאים כבול חרוזים על ידי שימוש חוזר אותם במיליליטר אחד של PBS, בתוספת 2% FCS, ולמקם את הצינור בחזרה על המגנט במשך דקה אחת. השלך את העל-טבעי הברור, וחזור על תהליך זה במשך שלוש שטיפות בסך הכל. לאחר הכביסה הסופית, מניחים את הצינור על המגנט למשך דקה אחת.מוציאים אותו, משליכים את העל-טבעי, ומ מניחים את גלולת הקרח על הקרח. לאחר מכן, כדי לבצע בידוד גרעיני, תן שימוש חוזר חרוזי ותאים ב 50 microliters של חיץ תמוגה קרה, וצנטריפוגה מיד ב 500 G, ארבע מעלות צלזיוס, במשך 10 דקות. הסר והשליך את העל-טבעי.כדי לבצע את תגובת transposase, תן שימוש חוזר גלולת הגרעינים המבודדים עם 50 microliters של Tn5 טרנספוזאז לערבב. דגירה בתרמוציקלר במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, עם המכסה להגדיר 40 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להחזיק בארבע מעלות צלזיוס כאשר הושלמה. מיד לאחר התרמוצ'ילי, בצעו ספין-למטה מהיר של צנטריפוגה על הספסל.מניחים את הצינור על המגנט למשך דקה אחת כדי להסיר את חרוזים מהמוצר. מבלי להסיר את הצינור מהמגנט, העבר את העל-טבעי הברור לעמוד טיהור דנ"א. לשטוף את העמודה פעם אחת עם 250 microliters של מאגר PB, ופעמיים עם 750 microliters של מאגר PE.לאחר מכן הוסיפו 10 מיקרוליטרים של מאגר אלוטיון כדי לחמק מהדגימה. הגדר את תגובת ההגברה הראשונית של PCR בצינור PCR ללא גרעין. מקם את צינור PCR לתוך התרמוצ'יקלר והפעל את תוכנית ההגברה של PCR.לאחר מכן השלימו את הגברה הסופית של PCR של 45 המיקרוליטרים הנותרים של תגובת PCR, כמתואר בכתב היד. מקם את צינור PCR בתרמוציקלר והפעל את התוכנית. לאחר הגברה מלאה, לטהר את הספריות באמצעות ערכת ניקוי PCR, בעקבות פרוטוקול היצרן, eluting ב 25 microliters של מאגר elution.רצף הספריות המוכנות ברצף הדור הבא לעומק קריאה ממוצע של 42 מיליון קריאות לכל מדגם. פרוטוקול ATAC-seq משופר זה הפיק ספריה סופית של יותר מננוגרם אחד לכל מיקרוליטר לתהפה. בקרת איכות הראתה שברי דנ"א בין 200 ל-1,000 זוגות בסיסים, ותבוצע רצף נוסף עם ספריות איכותיות אלה.ספריות שהוכנו בעקבות פרוטוקול זה הראו זיהום מיטוכונדריאלי של 3% בלבד. האחוז הגבוה של קריאות שמיש הוא קבוע מספיק על פני שכפולים ביולוגיים. פרוטוקול זה סיפק תוצאות הניתנות לשחזור רב על-פני שכפולים טכניים, כמו גם שכפולים ביולוגיים.בנוסף, פרוטוקול זה לקח 48 שעות, במקום שבוע אחד או יותר כפי שתואר קודם לכן, וכתוצאה מכך הפעלה עקבית ויעילה, כפי שהוכח על ידי תוצאות רצף לשחזור. יתר על כן, פסגות ATAC-seq חזוי נקראו במדויק על ידי צינור הניתוח. ניתוח תוצאות רצף גילה שינויים ברורים במצב כרומטין במהלך הפעלת תא T אנושי.אזורים נגישים להבחנה של כרומטין פתוח זוהו בין שש דגימות לפני ו 48 שעות לאחר ההפעלה. ודא שתגובת תות הגרעין מבוצעת עם ריאגנטים וחומרים צוננים, על מנת למקסם את ההתאוששות של גרעינים שלמים. מאגר תות הגרעינים שלנו שונה עדין יותר על התאים, וממזער דנ"א מיטוכונדריאלי מזהם.אנו מצפים לכך שמאגר תזה שונה זה יוחל גם על ATAC-seq בגרעין יחיד. אנו יודעים שפרוטוקול זה יאפשר לחוקרים לייצר נתוני ATAC-seq באיכות גבוהה יותר בעלות מופחתת, ויעזור להעביר את השדה האפיגנטי. הפרוטוקול הוא פשוט, מהיר, ואינו דורש כל reagents מסוכן או מכשירים, מה שהופך אותו נגיש בקלות עבור אלה חדשים ATAC-seq.

atac-seq-assay-with-low-mitochondrial-dna-contamination-from-primary

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

וזמינותו של כרומטין נגיש Transposase בשילוב עם תפוקה גבוהה רצף (האטא ק-seq) היא שיטה הגנום כולו לחשוף כרומטין נגיש. זהו פרוטוקול האטא ק-seq צעד אחר צעד, ממולקולרית לניתוח הסופי חישובית, אופטימיזציה עבור האדם לימפוציטים (Th1/Th2). פרוטוקול זה יכול להיות מאומץ על ידי חוקרים ללא ניסיון קודם בשיטות הדור הבא רצפי.

מיפוי הגנום כולו נגיש כרומטין של לימפוציטים מסוג T אנושי ראשוני על ידי האטא ק-Seq

כאן נתאר שיטה לבצע בו זמנית quantitate ואת ribonucleotides מפה הגנום כולו ב- DNA מאוד שלם ברזולוציה נוקלאוטיד יחיד, המשלב המחשוף אנזימטי של דנ א גנומי עם הידרוליזה אלקליין שלה סוף-5´ הבאים . רצף.

מיפוי בו זמנית, כימות של Ribonucleotides ב- DNA מיטוכונדריאלי אנושי

הסתגלות מטבולית היא בסיסית עבור תאי T כפי שהיא מכתיבה בידול, התמדה, וציטוטוקסיות. כאן, פרוטוקול ממוטב לניטור נשימה מיטוכונדריאלית בתאי T ראשוניים אנושיים מובחנים ex vivo .

ניטור בזמן אמת של נשימה מיטוכונדריאלית בתאי T ראשוניים אנושיים מובחנים בציטוקינים

כאן אנו מציגים פרוטוקול למדידת מספר עותק דנ"א מיטוכונדריאלי מוחלט (mt)DNA ורמות הטרופלזמה של מחיקת mtDNA בתאים בודדים.

מדידת מספר עותק דנ"א מיטוכונדריאלי חד-תאי והטרופלזמה באמצעות תגובת שרשרת דיגיטלית של טיפות פולימראז

ATAC-seq היא שיטת ריצוף DNA המשתמשת בטרנספוזאז מוטנטי היפראקטיבי, Tn5, כדי למפות שינויים בנגישות הכרומטין המתווכים על ידי גורמי שעתוק. ATAC-seq מאפשר לגלות את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס שינויים פנוטיפיים בתאים סרטניים. פרוטוקול זה מתווה הליכי אופטימיזציה עבור ATAC-seq בסוגי תאי אפיתל, כולל תאים סרטניים.

אופטימיזציה של ATAC-Seq לחקר אפיגנטיקה של סרטן

מבחני Pyrosequencing מאפשרים גנוטיפ חזק ומהיר של DNA מיטוכונדריאלי, פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים בתאים או רקמות הטרופלזמיים.

גנוטיפ פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים בגנום המיטוכונדריאלי על ידי Pyrosequencing

פרוטוקול זה מתאר טכניקה ליצירת ציבריד מתאי סרטן הגדלים בתרחיף ככלי לחקר תפקיד המיטוכונדריה בתהליך הגידולי.

יצירת ציבריד טרנסוכונדריאלי באמצעות קווי תאים סרטניים

מתואר הליך לחקר הדינמיקה של מטבוליזם של דנ"א מיטוכונדריאלי (mtDNA) בתאים באמצעות פורמט צלחת מרובת בארות והדמיה אימונופלואורסצנטית אוטומטית כדי לזהות ולכמת סינתזה והפצה של mtDNA. זה יכול לשמש גם כדי לחקור את ההשפעות של מעכבים שונים, לחצים תאיים והשתקת גנים על חילוף החומרים mtDNA.

כימות מבוסס תמונה בתפוקה גבוהה של סינתזה והפצה של DNA מיטוכונדריאלי

ניתן לחקור ביו-אנרגטיקה של תאי CD8 T באמצעות מבחן מאמץ מיטו. ניתן להשתמש במתודולוגיה זו כדי לחקור תכנות מטבולי אקוטי וכרוני. פרוטוקול זה מתאר גישות לבחינת הקשרים בין ביולוגיה של קולטני תאי T לניתוח ביו-אנרגטי.

מדידת תפקוד מיטוכונדריאלי של תאי CD8 T נאיביים ואפקטורים

השיטות לחקר ביו-אנרגטיקה מיטוכונדריאלית תחת ריכוזי מצע רלוונטיים פיזיולוגית בתאי מערכת החיסון מוגבלות. אנו מספקים פרוטוקול מפורט המשתמש בפלואורספירומטריה ברזולוציה גבוהה כדי להעריך שינויים בתגובה של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית לדרישת אנרגיה בתאי T אנושיים, מונוציטים ותאים חד-גרעיניים היקפיים.

פלואורספירומטריה ברזולוציה גבוהה להערכת שינויים דינמיים בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית בתאי מערכת החיסון האנושית

כתב יד זה מתאר פרוטוקול להכנת ספריית ATAC-seq של נויטרופילים ממח עצם עכבר, במטרה להבטיח כדאיות אופטימלית של נויטרופילים ואיכות ספרייה גבוהה. הוא מציע הוראות שלב אחר שלב על הכנת BMC, מיון אימונומגנטי ובניית ספרייה, ומשמש כמדריך רב ערך, במיוחד עבור מצטרפים חדשים לחקר נויטרופילים.

הכנת ספריית ATAC-Seq של נויטרופילים שמקורם במח עצם עכברים

למדו פרוטוקול ATAC-seq משופר ללימפוציטים CD4+ אנושיים עם חיץ ליזה חדש שמפחית זיהום מיטוכונדריאלי מ-50% לפחות מ-3%. השיטה מגבירה את איכות הנתונים ומפחיתה בעלות הריצוף ב-50%.

האטא ק-seq Assay עם זיהום נמוכה דנ א מיטוכונדריאלי של ראשי האדם CD4 + לימפוציטים מסוג T

גלה סרטונים נוספים