מדידת הסלולר העולמי מטריקס מטאלו-פרוטאינאז ופעילות מטבולית Hydrogels תלת-ממד

תרבות תלת-מימדית מקשה על מדידת תפקוד התאים, תוך שימוש במתקנים ביולוגיים סטנדרטיים. פרוטוקול זה מאפשר מדידה של פעילות תאית וסומטית ללא עיבוד מדגם נוסף, באמצעות חיישן פלואורסצנטי וקורא מיקרופלסטיק סטנדרטי. פרוטוקול זה מאפשר מספר יישומים חדשים, כולל סינון תרופות תפוקה גבוהה.

בנוסף, ניתן להחליף את חיישן הפלואורסצנט עם חיישן אחר כדי למדוד פרוטאזות או תפקודי תאים אחרים. חשוב לתכנן בזהירות את הניסוי מראש, להשלים את כל החישובים להכנת הידרוג'ל, ולהכשיר את כל הציוד והריאגנסים כדי למזער את תאי הזמן בהשעיה. ראשית, הכינו את המדיה עם 1%פחם מופשט סרום שור עוברי, שני mM L-גלוטמין, 10 יחידות לכל mL של פניצילין, ו 10 מיקרוגרם לכל mL של סטרפטומיצין.

אין להשתמש במדיה אדומה פנול, אשר יש יותר הפרעה פלואורסצנטיות. כדי להפוך פקדים חיוביים, להוסיף סוג אנזים קולגנז חיידקי אחד למדיה assay בריכוזים של 10 ו 1000 מיקרוגרם לכל mL. לאחר מכן, להכין את פתרון מבשר הידרוג'ל על ידי הוספת הריאגנס לצינור 1.5 מ"ל.

הקפד מערבולת לאחר תוספת של כל רכיב. לאחר מכן לחלק את הפתרון לצינורות 1.5 מ"ל מרובים עבור תנאים שונים. כדי אנקפסולציה תאים הידרוג'לים, תחילה להכין השעיה תא יחיד על ידי שטיפת צלחת 10 ס"מ של תאי מלנומה A375 עם 10 מ"ל של PBS.

לאחר מכן, להוסיף 0.05%trypsin לצלחת, כדי לנסות תאים. דגירה המנה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני, במשך שלוש דקות. לאחר הדגירה, לספור את התאים עם המוציטומטר.

לאחר מכן, צנטריפוגה פתרון התא ב 314 פעמים G במשך שלוש דקות. שאפו את מדיית התרבות, והתאי PBS יתווספו מחדש בערך פי שלושה מהצפיפות הסופית של העוטף. לספור את התאים שוב כדי להבטיח ריכוז תאים מדויק.

לאחר מכן, להוסיף תאים מושעים PBS לכל צינור של פתרון מבשר הידרוג'ל על פי צפיפות הזריעה הנדרשת, ומערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה. עבור תנאים מבוקרים, רק להוסיף PBS ומערבולת. לאחר מכן, פיפטה 10 microliters של פתרון מבשר הידרוג'ל לאמצע כל באר של סטרילי, שחור, עגול תחתית 96 צלחת היטב.

בדיקה ויזואלית של מיקום ההידרוגלים בתוך בארות. ניתן למקם מחדש הידרוג'לים שאינם ממורכזים באמצעות קצה פיפטה לפני פולמריזציה. כדי להפוך את פתרון מבשר הידרוג'ל, לחשוף את הצלחת לאור UV ב 4 מילי וואט לס"מ מרובע, במשך שלוש דקות.

לאחר מכן, הוסיפו 150 מיקרוליטרים של המדיה המוסווה לכל הבארות המכילות תאים אנקפסולציה, ו-150 מיקרוליטרים של תווי האנזים הקולגנאז ל הבארות של פקדים חיוביים. הוסף 150 microliters של חיץ PBS ל בארות החיצוניות של הצלחת כדי להפחית את האידוי במהלך הדגירה. השתמש בקורא מיקרופלאט כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנט של הצלחת בשעה אפס, מיד לאחר אנקפסולציה.

בחר את פרוטוקול הלוח אטום 96 היטב עם 494 ננומטר העירור, ו 521 אורכי גל פליטת ננומטר. לאחר מכן, הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני, במשך 18 שעות. לאחר מכן הוסיפו ריאגנטים של פעילות מטבולית ביחס נפח של 1 עד 10 לנפח ל- well עבור כל התנאים והפקדים.

דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, במשך שש שעות. לבסוף, למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות של הצלחת ב 24 שעות, לאחר אנקפסולציה. בחר את פרוטוקול לוחית הבאר אטום 96, עם 494 ננומטר העירור, ו 521 אורכי גל פליטת ננומטר, עבור פעילות MMP.

כדי למדוד את הפעילות המטבולית, בחר 560 ננומטר העירור, ו 590 אורכי גל פליטת ננומטר. במחקר זה, עם חשיפת החיישן הפלואורוגני לפרוטאז המתאים, quencher ו פלואורופור מופרדים, פלואורסצנטיות עולה. מדידות פלואורסצנטיות של הידרוג'לים דגירה עם סוג אנזים קולגנס חיידקי אחד, מראים כי האות שזוהה הנמוך ביותר הופק על ידי פקדים שליליים, ללא קולגן.

בעוד האות שזוהה הגבוה ביותר הופק על ידי 1000 מיקרוגרם לכל mL של קולגן ומעלה, כאשר האות מתחיל מישור. טווח העבודה המחושב היה בין 0.16 ל 474 מיקרוגרם לכל mL של קולגן. קריאות פלואורסצנטיות עבור קו התאים מלנומה A375, אנקפסולציה במגוון של צפיפות מיד לאחר אנקפסולציה, היו נמוכים על פני צפיפות זריעה, ובדומה ג'לים שליטה ללא תאים כצפוי.

24 שעות לאחר אנקפסולציה, פעילות MMP הייתה פרופורציונלית ישירות לצפיפות הזריעה, וצפיפות הזריעה במיליון תאים או יותר ממיליון תאים למ"ל, נמצאת בגבולות טווח העבודה. מדידות פעילות מטבולית של קו התאים A375, היו גם פרופורציונליות ישירות לצפיפות זריעת התאים. על ידי נרמול פעילות MMP לפעילות מטבולית, לא היה הבדל משמעותי בפעילות MMP לכל תא בצפיפות זריעה הגדולה מ -2 מיליון תאים ל- mL.

טכניקות צינורות נאותות חשובות. זה כולל טיפים הרטבה מראש כדי להשיג כמויות מדויקות של פתרונות צמיגים. כמו כן, מרכוג פתרון מבשר הידרוג'ל בתוך באר, הוא קריטי כדי להשיג מדידות מדויקות על ידי קורא הלוח.

כדי לזהות MMPs ספציפיים התורמים לפעילות MMP הנמדדת כאן, ניתן להשתמש בביטויים כגון כתם מערבי או PCR. השימוש בתאים חיים דורש הליך בטיחות ביולוגי תקין, טכניקה אספטית וארון בטיחות ביולוגי. אור UV הוא מסוכן, להשתמש במגן כדי להגן על המשתמש, ולא להסתכל ישירות לתוך האור.