Name: בנייה ושימוש חדר גירוי חשמלי לשיפור Osteogenic התמיינות בתאי גזע Mesenchymal/סטרומה במבחנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: למדו לבנות חדר גירוי חשמלי לתרבית תאים לשיפור התמיינות האוסטאוגנית בתאי גזע מזנכימליים. שיטה זו פשוטה, בעלות נמוכה וניתנת לשימוש חוזר במחקר הנדסת רקמות עצם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמך בחלקה של אאו גרנט סטארט-אפ של קרן (S-14-03 H) ושל קרן Friedrichsheim (Stiftung Friedrichsheim) ב פרנקפורט, גרמניה.

1. בנייה לשכת התרבות של גירוי חשמלי תא
<ol><li>כדי לבנות תא EStim, לאסוף את העפעפיים שני לוחות תרבות תא 6-ובכן תקן; 99.99% פלטינה חוט, 60 ס"מ אורך בקוטר של 0.5-1 מ מ; חוט נחושת מצופה כסף, 70 ס מ אורך בקוטר 0.6 מ"מ; פלייר למהנדס חשמל; מלחם קיט; שפופרת אחת של דבק superconductive; חוט אחד מסוף לחסום מחבר, שישה קטנים 2.2 V נוריות (אופציונלי); שפופרת אחת של דבק סיליקון חלד ציפוי (אופציונלי); גליל אחד של סרט בידוד חשמלי שחור; תקן, גמיש, מבודדים נחושת חוט חשמלי (0.14 מ מ2), 2 מטר אורך (טבלה של חומרים).</li>
	<li>מכסה צלחת 6-ובכן, מארק, ואז תרגיל שני חורים (בקוטר של ~ 1 מ מ), 25 מ מ זו מזו, ליד הקצה החיצוני של כל אחד מששת בארות (12 חורים סה כ), כפי שמוצג איור 1A, B.</li>
	<li>חתך אורכי 12 5 ס מ של חוט פלטינה עם מגזריים. לכופף כל אחד החוטים ידנית לתוך צורת L, עוזב את קצה אחד ארוך 3 ס"מ וחותכים השני 2 ס מ. הכבל מצופים כסף לתוך שני אורכי 35 ס מ.</li>
	<li>להוסיף יותר זמן (3 ס"מ) כפוף סוף חוט פלטינה (מ פנימה להוציא) לתוך כל חור מסועף, להשאיר 1-2 מ מ בולטות מבחוץ של המכסה, לכופף אותו באמצעות מלקחיים. לאבטח את החוטים פלטינה החורים המכסה עם דבק superconductive ולהשאיר לו להתייבש במשך כ- 6 שעות.</li>
	<li>הלחמה קצות כל החוטים פלטינה 6 (זה מאוחר יותר לשמש cathodes, ראה איור 1A) מהעורקים עפעפיו לאחד החוטים מצופה כסף. חזור על הליך דומה הלחמה החוטים הנותרים פלטינה 6 (שישמש מאוחר יותר אנודות) לכבל אחרים מצופה כסף.<ol>
<li>הוסף נוריות במעגל בין כל אחת של שש אנודת-קטודה אלקטרודת פלטינה הזוגות, לאשר פונקציונליות במהלך הניסויים (אופציונלי). מניחים חתיכת סרט בידוד שחור תחת כל הוביל כדי למנוע חשיפת התאים צלחות תרבות נורית ה-LED (איור 1C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>הדבק המחבר מסוף לחסום תיל כדי לפינה השמאלית העליונה של המכסה 6-ובכן צלחת וחבר שני חוטים מצופים כסף המסופים קלט, כפי שמוצג באיור 1C.</li>
	<li>לגזור מקטע 20 מ מ x 20 מ מ מהפינה השמאלית העליונה של מכסה 6-ובכן צלחת השני (איור 1B, המכסה Nr. 2) כדי להכיל את המחבר מסוף לחסום את המכסה הראשון. מכסה את המכסה הראשון, מצויד האלקטרודות, עם המכסה השני, להדביק אותם ביחד עם סרט דביק.<ol>
<li>כדי לשפר את התקשרות של הכיסוי שני, השתמש דבק סיליקון ציפוי (אופציונלי). כדי לעשות זאת, מכסה את המכסה עם האלקטרודות כסף עם 3-5 מ מ שכבה של דבק סיליקון, ולכסות המכסה אחרים, ומאפשר 12 שעות על הדבק להתייבש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חבר קצה אחד שני רגיל החוטים נחושת מבודד המסופים פלט של המחבר תיל ומסתיים אחרים למחברים זכר בננה (4 מ מ). הערה: אורך החוטים האלה תלוי המרחק מן המדף בחממה, שבו התאים יישמר, לספק הכוח, מחוץ החממה (איור 1D).</li>
	<li>להתאים את המינון (מתח), משטר של EStim להעביר התאים על ידי ויסות אספקת חשמל DC.<ol>
<li>הפעל את אספקת החשמל על-ידי לחיצה על כפתור ON/OFF בלוח הקדמי. להפעיל ערוץ 1 על ידי לחיצה על לחצן 1.</li>
		<li>הקש על לחצן Nr. 4 (V-set) כדי להגדיר את המתח. עיתונות כפתורים 2, . ו- 5 כדי להגדיר את הפלט טען ב- 2.5 (פ') הקש Enter.</li>
		<li>להבטיח כי הפלט עומס של 2.5 V (2,500 mV) מקביל EStim mV/מ"מ, לפי המשוואה הבאה, פשוטה. V EStim = <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59127/59127eq1.jpg"> ; או V = VEStim × d . הנה, V = מתח פלט במילי-ואטים; d = המרחק בין האלקטרודות במילימטרים; V EStim = המתח גירוי במילי-ואטים לכל מילימטר. הערה: פישוט זה חלה רק במקרה של מתח DC מתמדת. ההתנגדות בין המדיום לבין התאים הוא זניח כמו אלקטרודות שאינם נמצאים במגע ישיר עם התאים; במקום זאת, EStim מועבר לתאים דרך המדיום.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. mesenchymal תא גזע תרבות osteogenic בינוני
<ol><li>לרכוש ולאחסן MSCs עכברוש זמינים מסחרית (ראו טבלה של חומרים) בחנקן נוזלי עד היום של הניסוי. לחלופין, בידוד MSCs מבעלי חיים אחרים על פי פרוטוקולים שפורסם במקומות אחרים7,8 על פי תקנות מוסדיים מקומיים לשימוש של חיות ניסוי.</li>
	<li>ביום של הניסוי, להסיר את בקבוקון אחד (1 x 106 תאים) של MSCs האחסון חנקן נוזלי, במהירות (תוך 1 דקות) והפשרה של התאים בתוך אמבט מים טרופה על 37 מעלות צלזיוס.<ol>
<li>בתנאים סטריליים ב תא למינארי, pipette את התוכן המבחנה לתוך צינור בז ' 50 מל ' ולהוסיף 9 מיליליטר בינונית רגילה (ננומטר) prewarmed עד 37 ° C, המורכב בינוני הנשר של Dulbecco ששונתה (DMEM; 1 x) עם 10% לא פעיל חום העובר שור סרום (FBS) ו- 1% פתרון פניצילין/סטרפטומיצין. גלולה את התאים עבור 5 דקות על ידי צנטריפוגה ב x 300 גרם.</li>
		<li>תא למינארי, להסיר את תגובת שיקוע, בזהירות resuspend בגדר תא ב 12 מ של NM prewarmed ל- 37 מעלות צלזיוס. העבר את התאים resuspended בקבוקון התרבות של תאים T-75.</li>
	</ol>
</li>
	<li>התרבות התאים 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 עד שיגיעו למפגש של 80% – 90% (לאחר כ 3-5 ימים).</li>
	<li>המעבר את התאים. הערה: ביצוע כל הפעולות מלבד צנטריפוגה הדגירה בתנאים סטריליים תא למינארי.<ol>
<li>כשמגיעים זרימה של 80% – 90%, לאחזר את התאים עם פתרון ניתוק התא. תשאף המדיום התרבות תאים, לשטוף 2 x עם 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), הוסף 5 מ של 1 x פתרון ניתוק התא, וחוזרים התאים החממה במשך 5 דקות.</li>
		<li>ברגע התאים מנותקים, להוסיף כמות שווה של תרבות בינוני כדי להשבית את הפתרון ניתוק. לאסוף את התאים בשפופרת בז 50 מ ל, לסובב אותם ב 300 x גרם במשך 5 דקות.</li>
		<li>למחוק את המדיום, resuspend תאים 1 מ"ל של מדיום נורמלי טריים. להעריך את מספר התאים קיימא עם הכתם trypan blue.</li>
		<li>זרע עונה 1 פרק 106 תאים בבקבוקון T-75 חדש עם 12 מ של prewarmed ננומטר. התרבות התאים 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 עד שיגיעו למפגש של 80% – 90%. הערה: תא passaging (צעדים 2.4.1–2.4.4) יכול לחזור כמה פעמים עד המספר הדרוש של תאים מתקבל. אל תשתמש שגילן עולה על המעבר 8 תאים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>זרע 9 x 104 תאים ב- 3 מ"ל של NM (10% לא פעיל חום העובר שור סרום, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, DMEM), כל טוב של צלחת 6-ובכן תרבות. דגירה התאים ליום 1-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, 5% O2.</li>
	<li>למחרת, תשאף תרבות בינוני ולהחיל 3 מ"ל של בידול osteogenic בינוני (אום; בינונית רגילה בתוספת 10-7 מ' דקסמטסון 10 מ מ β-glycerophosphate, מ מ 0.05 חומצה אסקורבית-2-פוספט).</li>
	<li>מקום 6-ובכן לצלחת עם תאים בחממה, דגירה 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 בן לילה.</li>
</ol>3. טיפול MSCs עם EStim
<ol><li>ביום שהתאים מטופלים עם EStim, לעקר את האלקטרודות בפתרון אתנול 70% למשך 30 דקות; לאחר מכן, יבש אותם תחת אולטרא סגול בבטיחות בארון למשך 30 דקות נוספות.</li>
	<li>ב תא למינארי, לכסות את הצלחת 6-ובכן המכיל את MSCs תרבותי עם המכסה מצויד האלקטרודות, מוודא כי האלקטרודות לחלוטין טובע בינוני (אם יש צורך, להוסיף בינוני). להעביר את הצלחת 6-ובכן מקורה (EStim קאמרית) עם תאי החממה וחבר שלה חוטים לספק הכוח.</li>
	<li>הגדר את אספקת החשמל 2.5 V פלט טעינה ולפנק את התאים עם EStim עבור 1 h3,9.</li>
	<li>לאחר גירוי, נתק את אספקת החשמל, להסיר את התא EStim החממה. תחת תנאים סטריליים, להחליף את המכסה מצויד עם אלקטרודות עם מכסה תקן 6-ובכן צלחת.</li>
	<li>להחזיר את התאים החממה ולהשאיר אותם בן לילה. לנקות את האלקטרודות, תחילה עם PBS ולאחר מכן עם 70% אתנול פתרון. לנקות את המוצרים קורוזיה שהצטברו מהמשטח אלקטרודה עם נייר זכוכית עדין.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.1 – 3.5 6 ימים רצופים. יום 4, לפני החלת EStim, תחת תנאים סטריליים, לשנות המדיום תרבות על-ידי כ רפה בעברית 1.5 מיליליטר בינוני והחלפתו 1.5 מיליליטר המפרך טרי prewarmed</li>
	<li>לאחר החלת EStim 7 ימים רצופים, לשמר את התאים בתרבות 7 ימים נוספים, להחלפת המדיום כל 3-4 ימים.</li>
</ol>4. מדידות בידול osteogenic
<ol><li>לנתח את השינויים מורפולוגיה תאים במיקרוסקופ.</li>
	<li>כדי להעריך את השפעת EStim על MSC בידול osteogenic, מדד סידן התצהיר, פעילות פוספטאז אלקליין osteogenic סמן ביטוי גנים, כפי שתואר במקומות אחרים3,9.</li>
</ol>

<ol><li>Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Regenerative+Medicine%3A+What+Is+the+Evidence%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%2C+Tissues%2C+Organs%22%5BJournal%5D)">Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence?</a> Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).</li>
<li>Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Adult+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Tissue+Engineering+Applications%3A+Current+Status+and+Future+Prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects.</a> Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).</li>
<li>Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+effect+of+direct+current+electrical+stimulation+on+rat+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells.</a> PeerJ. 5, e2821(2017).</li>
<li>Leppik, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+electrical+stimulation+and+tissue+engineering+to+treat+large+bone+defects+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model.</a> Scientific Reports. 8 (1), S1(2018).</li>
<li>Song, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).</li>
<li>Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+responses+of+two-+and+three-dimensional+engineered+tissues+to+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+B%2C+Reviews%22%5BJournal%5D)">A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Translation%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).</li>
<li>Nau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineered+vascularized+periosteal+flap+enriched+with+MSC%2FEPCs+for+the+treatment+of+large+bone+defects+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).</li>
<li>Eischen-Loges, M., Oliveira, K. M. C., Bhavsar, M. B., Barker, J. H., Leppik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreating+mesenchymal+stem+cells+with+electrical+stimulation+causes+sustained+long-lasting+pro-osteogenic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Pretreating mesenchymal stem cells with electrical stimulation causes sustained long-lasting pro-osteogenic effects.</a> PeerJ. 6, 4959(2018).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), San Diego, CA. 402-408 (2001).</li>
<li>Curtis, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EF1alpha+and+RPL13a+represent+normalization+genes+suitable+for+RT-qPCR+analysis+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells.</a> BMC Molecular Biology. 11, 61(2010).</li>
<li>Wang, L., Li, Z. -y, Wang, Y. -p, Wu, Z. -h, Yu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Expression+Profiles+of+Marker+Genes+in+Osteogenic+Differentiation+of+Human+Bone+Marrow-derived+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Medical+Sciences+Journal+%28Chung-kuo+i+hsueh+k%27o+hsueh+tsa+chih%29%22%5BJournal%5D)">Dynamic Expression Profiles of Marker Genes in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Chinese Medical Sciences Journal (Chung-kuo i hsueh k'o hsueh tsa chih). 30 (2), 108-113 (2015).</li>
<li>Kim, H. B., Ahn, S., Jang, H. J., Sim, S. B., Kim, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+corrosion+behaviors+and+surface+profiles+of+platinum-coated+electrodes+by+electrochemistry+and+complementary+microscopy%3A+biomedical+implications+for+anticancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Evaluation of corrosion behaviors and surface profiles of platinum-coated electrodes by electrochemistry and complementary microscopy: biomedical implications for anticancer therapy.</a> Micron. 38 (7), Oxford, UK. 747-753 (2007).</li>
<li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. , mbcE18010077(2018).</li>
<li>Tai, G., Tai, M., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrically+stimulated+cell+migration+and+its+contribution+to+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Burns+%26+Trauma%22%5BJournal%5D)">Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing.</a> Burns & Trauma. 6, 20(2018).</li>
<li>Love, M. R., Palee, S., Chattipakorn, S. C., Chattipakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+electrical+stimulation+on+cell+proliferation+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1860-1876 (2018).</li>
<li>Adams, D. S., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+principles+for+measuring+resting+membrane+potential+and+ion+concentration+using+fluorescent+bioelectricity+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 385-397 (2012).</li>
<li>Jin, G., Li, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electrically+conductive+scaffold+as+the+skeleton+of+stem+cell+niche+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+%26+Engineering.+C%2C+Materials+for+Biological+Applications%22%5BJournal%5D)">The electrically conductive scaffold as the skeleton of stem cell niche in regenerative medicine.</a> Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 45, 671-681 (2014).</li>
<li>Hronik-Tupaj, M., Rice, W. L., Cronin-Golomb, M., Kaplan, D. L., Georgakoudi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+differentiation+and+stress+response+of+human+mesenchymal+stem+cells+exposed+to+alternating+current+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic differentiation and stress response of human mesenchymal stem cells exposed to alternating current electric fields.</a> Biomedical Engineering Online. 10, 9(2011).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן נתאר הקמת תא, שיטה לטיפול בבעיות גזע mesenchymal עם EStim כי התוצאות התמיינות משופרת osteogenic.
הגדרת EStim שהוצגו לא דורשת ציוד/ידע מיוחד, יכול להתבצע בתוך מעבדה ביולוגיה/ביוכימיה סטנדרטי בתאי גזע על ידי החוקרים הצעירים. עם זאת, כאשר בונים ומפעילים תא EStim, טיפול מיוחד חייב להילקח מספר שלבים קריטיים. בעת טיפול האלקטרודות פלטינה, יש לקחת טיפול נוסף כמו המתכת הזאת הוא מאוד נזיל, עדין. בעוד מתכות אחרות, כגון פלדה או טונגסטן, יכול לשמש, אלה אינם מומלצים כפי שהם נוטים קורוזיה, אשר יכול להיות...

עלייה טראומה ו/או פגמים הנוצרות על-ידי מחלת עצם מטופלים באמצעות צירופים שונים של טיפול בתאי וטכנולוגיות רפואה רגנרטיבית. MSCs הם התא לפי בחירה, טיפולים כאלה, בשל פעילות osteogenic יחסית גבוהה, בידוד, הרחבת והיעילות, בטיחות1. על מנת למקסם את הפעילות osteogenic שלהם, לכן, למטב את האפקטיביות הטיפולית שלהם, הוכנסו מספר שיטות לטיפול MSCs לפני השימוש בטיפולים אלה (כפי שנסקרו על ידי Mauney et al.2). שיטה אחת כזאת היא EStim, אשר הוכח לשפר MSC בידול osteogenic חוץ גופית3 ולקדם את עצם ריפוי ויוו4. למרות המספר הגדל והולך של לימודי התמקדות בטיפול MSCs עם EStim, משטר אופטימלית עבור למקסם את אפקט pro-osteogenic של EStim טרם מוגדר.
שיטות הפריה אחרות באמצעות EStim לנצל את גשרי מלח בתוך המדיום תרבות, המפריד בין תאים אלקטרודות מתכתי5. היתרון של זה היא כי אספקת EStim באמצעות גשרים מלח מבטלת המבוא של לוואי כימיות (למשל, קורוזיה של אלקטרודות מתכתי) שעשויים להיות ציטוטוקסיות. למרות יתרון זה, גשרי מלח הם מסורבלים כדי לעבוד עם, EStim הם מספקים שונה כי מודלים ויוו ונמסרו ב, ולכן קשה לתאם את התוצאות המתקבלות בעת שימוש את שתי המערכות. כיוונוני לספק EStim באמצעות אלקטרודות מתכתי או פחמן קבוע בתוך הבארות התרבות התא (כפי שנסקרו על ידי Hronik-Tupaj, קפלן6) כדאי לדמות התקנים המשמשים ויוו; עם זאת, התקנים אלה שקשה לנקות/לחטא בין שימושים, מספר התאים שניתן ללמוד לכל ניסוי מוגבל. תיכננו תא EStim המובאים כאן במיוחד כדי לטפל המגבלות של אלה כיוונונים אחרים. בעוד רוב הניסיון שלנו באמצעות לשכת EStim הזה כבר עם 2D ו 3D תרבויות המכיל מח עצם ושומן-רקמה-נגזר MSCs3,4, אחד היתרונות המרכזיים של החדר הזה זה תכליתי והוא, עם יחסית מינורי שינויים, ניתן להתאים ללמוד את סוגי תאים אחרים תחת מגוון תנאים שונים.
כאן נתאר את בניית חדר תרבות תא EStim; לאחר מכן, נדגים את השימוש בו על ידי MSCs בטיפול עם משטרי שונים של EStim ומדידת האפקט המתקבל על בידול osteogenic. בידול osteogenic MSC מוערך באמצעות התצהיר סידן פעילות פוספטאז אלקליין, ביטוי גנים סמן osteogenic. חשוב, ב עבר ניסויים בשימוש תוכנית התקנה זו, הבחנו כי השפעות פרו-osteogenic אלו נמשכות זמן רב לאחר הטיפול EStim הופסק.

<table><tbody><tr><td><ייצור חזק>Estim< / מחבר ></td><td></td><td></td><td></td>בננה חזק</tr> <tr><td>/ מתאם ג'ק</td><td>Poppstars</td><td></td><td>1008554 2 חלקים</td></tr><tr><td>צבת חיתוך</td><td>Knipex</td><td>78 03 125</td><td></td></tr><tr><td>ספק כוח DC (0-30V / 0-3A)</td> <td>B& K Precision</td><td>דגם 9130B</td><td>ניתן להשתמש בכל דגם סימולרי ניתן להשתמש</td></tr><tr><td>בחוטים גמישים מבודדים (0.14 מ"מ2)</td> <td>Conrad Electronic International</td><td>604794, 604093</td><td>2 חלקים</td></tr><tr><td>גומי סיליקון לא קורוזיבי</td><td>Dow Corning</td><td>3140 RTV</td><td>*ניתן לרכוש על ידי חנויות רבות</td></tr><tr><td>חוט פלטינה (999,5/1000; 1 מ"מ &oslash;)</td><td>Junker Edelmetalle</td><td>00D-3010</td><td>0.6 מ' דרוש עבור 1 תא אסים</td></tr><tr><td>70% תמיסת אתנול</td><td>כל</td><td></td><td>עיקור של תא אסים</td></tr><tr><td>חוט נחושת מצופה כסף (0.6 מ"מ &oslash;)</td><td>קונרד אלקטרוניק אינטרנשיונל</td><td>409334 - 62</td><td>&asymp; 70 ס"מ דרוש עבור 1 מכשיר Estim</td></tr><tr><td>סט ברזל הלחמה</td><td>Conrad Electronic International</td><td>1611410 - 62</td><td>ניתן להשתמש בכל דגם סימולרי</td></tr><tr><td>TPP מכסה צלחת 6 בארות</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707759-126EA</td><td>2 מכסים לתא Estim</td></tr><tr><td>2.2V נוריות LED עגולות חוטיות</td><td>Conrad Electronic International</td><td>599525 - 62</td><td>6 חתיכות</td></tr><tr><td>UHU סופר דבק</td><td>UHU GmbH & Co. KG</td><td>n/a</td><td>*ניתן לרכוש בחנויות רבות</td></tr><tr><td>תרבית MSC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-גליצרופוספט מלח דיסודיום הידרט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td>תרבית תאים אוסטאוגנית</td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז נמוך, תוסף GlutaMAX, פירובט</td><td>תרמו-פישר תרבית תאים מדעית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>21885025 DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיום</td><td>תרמו-פישר </td><td></td><td>תרבית תאים</td>מדעית</tr><tr><td>14190144 דקסמתזון</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D4902</td><td>תרבית תאים אוסטאוגנית</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>תרמו-פישר תרבית</td><td>תאים</td><td>10500064</td> מדעית</tr><tr><td>50 מ"ל שפופרת פלקון</td><td>Sarstedt</td><td>62,547,004</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>L-אסקורבית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A4544</td><td>תרבית</td></tr> <tr>תאים אוסטאוגנית<td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>תרמו-פישר תרבית תאים מדעית</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>תאי גזע מזנכימליים של חולדות Sprague-Dawley (SD), מקור מח עצם</td><td>Cyagen</td><td>RASMX-01001</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>תמיסת ניתוק תאים</td><td>תרמו-פישר</td><td>A1110501</td><td>תרבית תאים מדעית, ניתוק תאים</td></tr><tr><td>TC Flask, T75</td><td>Sarstedt</td><td>833911302</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>TPP 6 בארות</td><td>תרבית תאים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707759-126EA</td></tr><tr><td>צבע כחול טריפאן, תמיסה של 0.4%</td><td>Bio-Rad</td><td>1450021</td><td>ספירת תאים</td></tr></tbody></table>

בנייה ושימוש חדר גירוי חשמלי לשיפור osteogenic התמיינות בתאי גזע mesenchymal/סטרומה במבחנה

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

תאי גזע mesenchymal/סטרומה (MSCs) נעשה שימוש נרחב כדי לקדם את עצם ריפוי ברקמות הנדסה גישות. גירוי חשמלי (EStim) הוכח להגדיל MSC בידול osteogenic במבחנה, לקדם את עצם ריפוי בהגדרות קליניים. כאן נתאר הקמת חדר תרבות תא EStim ואלשין השימוש בטיפול עצמות מח-נגזר MSC כדי לשפר את הבידול osteogenic. מצאנו כי בטיפול MSCs עם EStim במשך 7 ימים גורמת לעליה משמעותית הבידול osteogenic, חשוב, אפקט pro-osteogenic זה נמשכת זמן רב לאחר (7 ימים) EStim הוא הופסק. גישה זו של pretreating MSCs עם EStim כדי לשפר את הבידול osteogenic יכול לשמש כדי למטב את רקמת העצם הנדסה תוצאות הטיפול, לפיכך, לסייע להם לממש את הפוטנציאל הטיפולי מלאה שלהם. בנוסף יישום זה, הזה EStim תא תרבות קאמרית, פרוטוקול יכול לשמש גם כדי לחקור התנהגויות תא רגיש EStim אחרות, כגון העברה, התפשטות, אפופטוזיס מצורף לגרדום.

כדי להעריך את ההשפעה של 100 mV/מ מ EStim על הבידול osteogenic של MSCs, תאים שטופלו EStim עבור 3, 7, ו 14 ימים או nontreated (בקרה) נותחו ביום 14 של culturing על-ידי הערכת שינויים מורפולוגיים ומשקעים סידן (איור 2 ). הדבר נעשה על-ידי הדמיה תאים באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר (מורפולוגיה שינויים) או תיקון התאים בפתרון paraformaldehyde 4%, מכתימה אותם עם פתרון alizarin אדום 0.02%, לאחר מכן הדמיה אותם באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר (סידן התצהיר ניתוח).
<p class=...

כאן אנו מציגים פרוטוקול להקמת תא התרבות תאים שנועדו לחשוף תאים לסוגים שונים של גירוי חשמלי, ושימוש בו בטיפול גזע mesenchymal כדי לשפר את הבידול osteogenic.

בנייה ושימוש חדר גירוי חשמלי לשיפור Osteogenic התמיינות בתאי גזע Mesenchymal/סטרומה במבחנה

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

כאן, אנו מראים כיצד לבנות תא גירוי חשמלי באמצעות שש צלחות תרבות קיר נפוצות, וכיצד להשתמש בו על מנת לעורר בידול אוסטאוגני בתאי גזע mesenchymal. תא זה קל ולא יקר לבנייה, ו ניתן לעשות בו שימוש חוזר בניסויים מרובים. לאחר שטופלו מראש בגירוי חשמלי בתא שלנו, ניתן להשתמש בתאי גזע קסנצ'ימליים כדי לשפר את התוצאות בטיפולים בהנדסת רקמת עצם.תא זה יכול לשמש גם כדי לחקור סוגי תאים אחרים והתנהגויות תאים רגישים אלקטרו כמו הגירה, התפשטות, שינויים בפוטנציאל הממברנה, אפופטוזיס, ו התקשרות זהירה. במכסה צלחת שש באר, לסמן ולאחר מכן לקדוח שני חורים בקוטר מילימטר אחד, 25 מילימטרים זה מזה, ליד הקצה החיצוני של כל אחת משש בארות. לאחר מכן, חותכים חוט פלטינה לחלקים באורך 125 ס"מ.כופפו ידנית כל קטע באורך חמישה סנטימטרים לצורת L, והשאירו קצה אחד באורך שלושה סנטימטרים, ואת שני סנטימטרים נוספים. לאחר מכן, חותכים את החוט מצופה הכסף לשני אורכי 35 ס"מ. הכנס את הקצה הכפוף הארוך יותר של חוט פלטינה לתוך החור שנקדח, והשאיר אחד עד שני מילימטרים בולטים מהחוץ של המכסה.לכופף אותו באמצעות מדפים. לאחר מכן, לאבטח את חוטי הפלטינה בחורי המכסה עם דבק מוליך סופר ולהשאיר אותם להתייבש במשך כשש שעות. כדי להכין את הקתודות, הלחים את קצות כל ששת חוטי הפלטינה הבולטים מהמכסה לאחד החוטים מצופים הכסף.כדי להכין את האנודות, הלחים את ששת חוטי הפלטינה הנותרים לחוטים אחרים מצופים כסף. לאחר מכן, להוסיף נוריות במעגל בין כל אחד מששת זוגות אנודה-קתודה פלטינה אלקטרודה כדי לאשר את הפונקציונליות. מניחים פיסת סרט בידוד שחור מתחת לכל LED כדי למנוע חשיפת התאים בצלחות התרבות לאור LED.לאחר מכן, הדבק את מחבר בלוק מסוף החוט לפינה השמאלית העליונה של מכסה הלוח בן ששת הבארים, וחבר את שני החוטים מצופים הכסף למסופי הקלט. לאחר מכן, לגזור 20 מילימטר על ידי 20 מילימטר מרובע קטע מהפינה השמאלית העליונה של מכסה צלחת שש באר השני, כדי להתאים את מחבר בלוק מסוף על המכסה הראשון. מכסים את המכסה הראשון, מצויד באלקטרודות, עם המכסה השני, וקלטת אותם יחד עם סרט דבק.חבר קצה אחד של שני חוטי הנחושת המבודדים הסטנדרטיים למסופי הפלט של מחבר התיל, והשני מסתיים במחברים זכרי בננה. הפעל את ספק הכוח על-ידי לחיצה על לחצן כיבוי בלוח הקדמי. הפעל את ערוץ 1 על-ידי לחיצה על לחצן אחד.לאחר מכן, לחץ על כפתור ארבע כדי להגדיר את המתח. הגדר את פלט העומס על 2.5 וולט. לאחר מכן הקש Enter.ביום שבו התאים מטופלים בגזע E, מעקרים את האלקטרודות בתסכול 70%אתנול למשך 30 דקות. לאחר מכן, ייבשו אותם תחת אור UV בארון בטיחות למשך 30 דקות נוספות. במכסה המנוע של זרימה למינארית, מכסים את לוח שש הבאר המכיל את ה- MSCs התרבותיים עם המכסה המצויד באלקטרודות, ומוודאים כי האלקטרודות שקועות לחלוטין במדיום.לאחר מכן, להעביר את צלחת שש באר מכוסה עם תאים לאנקובטור ולחבר את החוטים שלה לאספקת החשמל. לאחר מכן, הגדר את אספקת החשמל לתפוקת עומס של 2.5 וולט וטפל בתאים עם גזע E למשך שעה אחת. לאחר הגירוי, לנתק את אספקת החשמל ולהסיר את תא גזע E מהאינקובטור.בתנאים סטריליים, החליפו את המכסה, המצויד באלקטרודות, במכסה לוח סטנדרטי של שש בארות. לאחר מכן, להחזיר את התאים לאנקובטור, ולהשאיר אותם לילה. נקה את האלקטרודות, תחילה עם PBS, ולאחר מכן עם 70%פתרון אתנול.לאחר מכן, לנקות את מוצרי קורוזיה שנצברו מפני השטח אלקטרודה עם נייר זכוכית עדין. חזור על הטיפול בגזע E במשך שישה ימים רצופים. ביום הרביעי, לפני החלת גירוי חשמלי, ובתנאים סטריליים, לשנות את מדיום התרבות על ידי שאיפה 1.5 מיליליטר של בינוני והחלפתו עם 1.5 מיליליטר של מדיום בידול אוסטאוגני מחומם מראש, טרי.לאחר החלת גירוי חשמלי במשך שבעה ימים רצופים, לשמור על התאים בתרבות במשך שבעה ימים נוספים, החלפת המדיום כל שלושה עד ארבעה ימים. כאשר הטיפול הושלם, לנתח את השינויים מורפולוגיה התא תחת מיקרוסקופ. כדי להעריך את ההשפעה של גירוי חשמלי על בידול אוסטאוגני MSC, למדוד תצהיר סידן, פעילות phosphatase אלקליין, ביטוי גנים סמן osteogenic, כמתואר במקומות אחרים.כדי להעריך את ההשפעה של 100 מילי-וולט למילימטר של גירוי חשמלי על ההתברלות האוסטאוגנית MSC, תאים שטופלו בגירוי חשמלי במשך שלושה, שבעה ו -14 ימים ותאים שאינם מטופלים, נותחו ביום 14 של התרבות על ידי הערכת שינויים מורפולוגיים ותצהיר סידן. שינויים משמעותיים במורפולוגיה של התאים ובפיקדונות הסידן נראו בתאים שטופלו בגירוי חשמלי במשך שבעה ו-14 ימים. ניתוח מפורט של שינויים בביטוי גנים של סמן אוסטאוגני בוצע בימים 3, 7 ו-14 של תרבות.ביום השביעי לתרבות, הביטוי RunX2 היה גבוה משמעותית בתאים שטופלו בגירוי חשמלי במשך שבעה ימים. בעוד ביטוי Colla1 היה גבוה משמעותית בתאים שטופלו במשך שבעה ימים, נמדד ביום 14 של התרבות. הביטוי של אוסטאופונטין גדל באופן משמעותי בתאים מגורה חשמלית בימים שלוש, שבע, ו 14 של תרבות.ביטוי אוסטריקס נעדר בתאי בקרה בכל נקודות הזמן, ונראינו רק בשבעה ו -14 ימים של תרבות בתאים שנחשפו לגירוי חשמלי. תא הגירוי החשמלי קל יחסית לבנייה. עם זאת, יש לדאוג במיוחד בעת טיפול בחוילי הפלטינה, וגם בעת ניקוי ועיקור האלקטרודות.תאים שטופלו מראש בחשמל בתא שלנו, לבד או יושבים על חומר פיגומים, יכולים להיות מושתלים במודלים של בעלי חיים, כדי לחקור כיצד ההשפעה החיובית של גירוי חשמלי נמשכת במבחנה. טכניקה זו מספקת כלי פשוט אך רב עוצמה ללמוד את המנגנון שבאמצעותו גירוי חשמלי מווסת את תפקודי התאים. ידע זה יכול להיות זמין בתאי רפואה רגנרטיבית.

construction-use-an-electrical-stimulation-chamber-for-enhancing

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

הוא הבין נרחב כי כוחות מכניים בגוף יכול להשפיע על התמיינות תאים ושגשוגם. כאן אנו מציגים פרוטוקול וידאו הממחיש את השימוש bioreactor שהותקן עבור אספקת המתח uniaxial מתיחה מחזורית לתאי גזע בתרבית על מצעים גמישים micropatterned.

גירוי מכני של גזע תאים באמצעות מסננים uniaxial מחזורי

סרטון זה מדגים את השימוש בשבב מיקרופלואידי חוץ-תאי מצופה מטריצה כדי להבדיל תאי גזע עצביים ותאי אב או NPCs באמצעות גירוי חשמלי. לאחר הזריעה וההיצמדות לאזור המצופה, NPCs גדלים, ויישום זרם ישיר מעורר את התמיינותם לנוירונים, אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים.

התמיינות הנגרמת על ידי גירוי חשמלי של תאי גזע עצביים ותאי אב

לתאי גזע מזנכימליים (MSCs) יש פוטנציאל התמיינות לקראת שושלת אוסטאובלסטית כאשר הם מגורים עם גורמים מסיסים או ביו-חומרים ספציפיים. עבודה זו מציגה אפשרות חדשה להעברת MSCs מקרום מי השפיר האנושי (AM-hMSCs) המעסיק את מטריצת עצם הבקר Nukbone (NKB) כפיגום.

בידוד של תאי גזע mesenchymal האדם והטיפוח שלהם על עצם מטריקס הנקבובי

Culturing תאי mesenchymal סטרומה אדם (hMSCs) עם סרום אוטולוגי, מפחית את הסיכונים של דחייה על ידי חומר xenogeneic והשפעות שליליות אחרות. זה גם מאפשר ההתאוששות של תת-קבוצה של אבות mesodermal, אשר יכול לספק hMSCs הטרי. Embedding hMSCs ב קריש הפיברין עצמי מאפשר טיפול קל והשתלת כירורגים יעילה.

תרבות משלוח Cell mesenchymal סטרומה ב עצמי תנאים: גישה חכמה עבור יישומים אורתופדיות

Chondrogenesis מתאי גזע דורש כוונון עדין תנאי התרבות. כאן, אנו מציגים גישה מגנטית עבור עיבוי תאים, צעד חיוני ליזום chondrogenesis. בנוסף, אנו מראים כי התבגרות דינמית בתוך bioreactor חלה גירוי מכאני כדי המבנים הסלולר ומשפרת ייצור תאי מטריקס סחוסים.

צבירת Cell מגנטי גזע 3D והתבגרות Bioreactor להתחדשות סחוס

פרוטוקול זה מתאר פבריקציה נוספת של מערכת התרבות התא כדי לאפשר זריעה של תאי גזע על גרדום פולימר מוליך ועבור במבחנה גירוי חשמלי העוקבים ויוו השרשה של לגרדום נזרע תאי הגזע באמצעות...

מוליכות חשמלית לגרדום לווסת ולהעביר תאי גזע

כאן אנו מציגים פרוטוקול על הדרכת אוכלוסיה התא באמצעות גירויים חשמליים ומכניים הדמיית פיזיולוגיה של הלב. גירוי מכאני חשמלי זה משפר את הפוטנציאל cardiomyogenic של תאים שטופלו, אסטרטגיה מבטיח טיפול בתאי נוספת, מידול המחלה, והתרופות הקרנה.

גירויים חשמליים ומכניים בו זמנית כדי לשפר את פוטנציאל Cardiomyogenic של תאים

פרוטוקול זה מתאר את התהליך שלב אחר שלב לבניית גירויים חשמליים ומגנטיים המשמשים להמרצת רקמות ביולוגיות. הפרוטוקול כולל קו מנחה לדמות שדות חשמליים ומגנטיים חישוביים וייצור התקני גירוי.

התקני שדה חשמליים ומגנטיים לגירוי רקמות ביולוגיות

לטיפול בעצם באמצעות אוסיפיקציה אנדוכונדרלית על ידי השתלת רקמת סחוס מלאכותית המיוצרת מתאי גזע מזנכימליים יש פוטנציאל לעקוף את החסרונות של טיפולים קונבנציונליים. הידרוג'ל חומצה היאלורונית יעיל בהגדלת שתלי סחוס ממוינים באופן אחיד, כמו גם ביצירת עצם משולבת עם כלי דם בין שתלים מאוחים in vivo.

היווצרות עצם משולבת באמצעות אוסיפיקציה אנדוכונדרלית in vivo באמצעות תאי גזע מזנכימליים

פיתחנו מבחן גירוי בעיניים אשר מנצל מודל רקמת האפיתל שלושה כמו קרנית-ממדי משוחזר אנושי (RHCE). המבחן הוא מסוגל להבחין בין גירוי העיני וחומרים מאכלים (קטגוריות GHS 1 ו -2 משולבים) ואלה שאינם דורשים תיוג (GHS אין קטגוריה).

גירוי מבחן העין (EIT) לסיכוני זיהוי כימיקלים עיניים מעצבנים באמצעות אפיתל דגם רקמות כמו-קרנית משוחזר אדם (RHCE)

למדו לבנות חדר גירוי חשמלי לתרבית תאים לשיפור התמיינות האוסטאוגנית בתאי גזע מזנכימליים. שיטה זו פשוטה, בעלות נמוכה וניתנת לשימוש חוזר במחקר הנדסת רקמות עצם.

בנייה ושימוש חדר גירוי חשמלי לשיפור Osteogenic התמיינות בתאי גזע Mesenchymal/סטרומה במבחנה

גלה סרטונים נוספים