בנייה ושימוש חדר גירוי חשמלי לשיפור Osteogenic התמיינות בתאי גזע Mesenchymal/סטרומה במבחנה
31 בינואר 2019
כאן אנו מציגים פרוטוקול להקמת תא התרבות תאים שנועדו לחשוף תאים לסוגים שונים של גירוי חשמלי, ושימוש בו בטיפול גזע mesenchymal כדי לשפר את הבידול osteogenic.
כאן, אנו מראים כיצד לבנות תא גירוי חשמלי באמצעות שש צלחות תרבות קיר נפוצות, וכיצד להשתמש בו על מנת לעורר בידול אוסטאוגני בתאי גזע mesenchymal. תא זה קל ולא יקר לבנייה, ו ניתן לעשות בו שימוש חוזר בניסויים מרובים. לאחר שטופלו מראש בגירוי חשמלי בתא שלנו, ניתן להשתמש בתאי גזע קסנצ'ימליים כדי לשפר את התוצאות בטיפולים בהנדסת רקמת עצם.
תא זה יכול לשמש גם כדי לחקור סוגי תאים אחרים והתנהגויות תאים רגישים אלקטרו כמו הגירה, התפשטות, שינויים בפוטנציאל הממברנה, אפופטוזיס, ו התקשרות זהירה. במכסה צלחת שש באר, לסמן ולאחר מכן לקדוח שני חורים בקוטר מילימטר אחד, 25 מילימטרים זה מזה, ליד הקצה החיצוני של כל אחת משש בארות. לאחר מכן, חותכים חוט פלטינה לחלקים באורך 125 ס"מ.
כופפו ידנית כל קטע באורך חמישה סנטימטרים לצורת L, והשאירו קצה אחד באורך שלושה סנטימטרים, ואת שני סנטימטרים נוספים. לאחר מכן, חותכים את החוט מצופה הכסף לשני אורכי 35 ס"מ. הכנס את הקצה הכפוף הארוך יותר של חוט פלטינה לתוך החור שנקדח, והשאיר אחד עד שני מילימטרים בולטים מהחוץ של המכסה.
לכופף אותו באמצעות מדפים. לאחר מכן, לאבטח את חוטי הפלטינה בחורי המכסה עם דבק מוליך סופר ולהשאיר אותם להתייבש במשך כשש שעות. כדי להכין את הקתודות, הלחים את קצות כל ששת חוטי הפלטינה הבולטים מהמכסה לאחד החוטים מצופים הכסף.
כדי להכין את האנודות, הלחים את ששת חוטי הפלטינה הנותרים לחוטים אחרים מצופים כסף. לאחר מכן, להוסיף נוריות במעגל בין כל אחד מששת זוגות אנודה-קתודה פלטינה אלקטרודה כדי לאשר את הפונקציונליות. מניחים פיסת סרט בידוד שחור מתחת לכל LED כדי למנוע חשיפת התאים בצלחות התרבות לאור LED.
לאחר מכן, הדבק את מחבר בלוק מסוף החוט לפינה השמאלית העליונה של מכסה הלוח בן ששת הבארים, וחבר את שני החוטים מצופים הכסף למסופי הקלט. לאחר מכן, לגזור 20 מילימטר על ידי 20 מילימטר מרובע קטע מהפינה השמאלית העליונה של מכסה צלחת שש באר השני, כדי להתאים את מחבר בלוק מסוף על המכסה הראשון. מכסים את המכסה הראשון, מצויד באלקטרודות, עם המכסה השני, וקלטת אותם יחד עם סרט דבק.
חבר קצה אחד של שני חוטי הנחושת המבודדים הסטנדרטיים למסופי הפלט של מחבר התיל, והשני מסתיים במחברים זכרי בננה. הפעל את ספק הכוח על-ידי לחיצה על לחצן כיבוי בלוח הקדמי. הפעל את ערוץ 1 על-ידי לחיצה על לחצן אחד.
לאחר מכן, לחץ על כפתור ארבע כדי להגדיר את המתח. הגדר את פלט העומס על 2.5 וולט. לאחר מכן הקש Enter.
ביום שבו התאים מטופלים בגזע E, מעקרים את האלקטרודות בתסכול 70%אתנול למשך 30 דקות. לאחר מכן, ייבשו אותם תחת אור UV בארון בטיחות למשך 30 דקות נוספות. במכסה המנוע של זרימה למינארית, מכסים את לוח שש הבאר המכיל את ה- MSCs התרבותיים עם המכסה המצויד באלקטרודות, ומוודאים כי האלקטרודות שקועות לחלוטין במדיום.
לאחר מכן, להעביר את צלחת שש באר מכוסה עם תאים לאנקובטור ולחבר את החוטים שלה לאספקת החשמל. לאחר מכן, הגדר את אספקת החשמל לתפוקת עומס של 2.5 וולט וטפל בתאים עם גזע E למשך שעה אחת. לאחר הגירוי, לנתק את אספקת החשמל ולהסיר את תא גזע E מהאינקובטור.
בתנאים סטריליים, החליפו את המכסה, המצויד באלקטרודות, במכסה לוח סטנדרטי של שש בארות. לאחר מכן, להחזיר את התאים לאנקובטור, ולהשאיר אותם לילה. נקה את האלקטרודות, תחילה עם PBS, ולאחר מכן עם 70%פתרון אתנול.
לאחר מכן, לנקות את מוצרי קורוזיה שנצברו מפני השטח אלקטרודה עם נייר זכוכית עדין. חזור על הטיפול בגזע E במשך שישה ימים רצופים. ביום הרביעי, לפני החלת גירוי חשמלי, ובתנאים סטריליים, לשנות את מדיום התרבות על ידי שאיפה 1.5 מיליליטר של בינוני והחלפתו עם 1.5 מיליליטר של מדיום בידול אוסטאוגני מחומם מראש, טרי.
לאחר החלת גירוי חשמלי במשך שבעה ימים רצופים, לשמור על התאים בתרבות במשך שבעה ימים נוספים, החלפת המדיום כל שלושה עד ארבעה ימים. כאשר הטיפול הושלם, לנתח את השינויים מורפולוגיה התא תחת מיקרוסקופ. כדי להעריך את ההשפעה של גירוי חשמלי על בידול אוסטאוגני MSC, למדוד תצהיר סידן, פעילות phosphatase אלקליין, ביטוי גנים סמן osteogenic, כמתואר במקומות אחרים.
כדי להעריך את ההשפעה של 100 מילי-וולט למילימטר של גירוי חשמלי על ההתברלות האוסטאוגנית MSC, תאים שטופלו בגירוי חשמלי במשך שלושה, שבעה ו -14 ימים ותאים שאינם מטופלים, נותחו ביום 14 של התרבות על ידי הערכת שינויים מורפולוגיים ותצהיר סידן. שינויים משמעותיים במורפולוגיה של התאים ובפיקדונות הסידן נראו בתאים שטופלו בגירוי חשמלי במשך שבעה ו-14 ימים. ניתוח מפורט של שינויים בביטוי גנים של סמן אוסטאוגני בוצע בימים 3, 7 ו-14 של תרבות.
ביום השביעי לתרבות, הביטוי RunX2 היה גבוה משמעותית בתאים שטופלו בגירוי חשמלי במשך שבעה ימים. בעוד ביטוי Colla1 היה גבוה משמעותית בתאים שטופלו במשך שבעה ימים, נמדד ביום 14 של התרבות. הביטוי של אוסטאופונטין גדל באופן משמעותי בתאים מגורה חשמלית בימים שלוש, שבע, ו 14 של תרבות.
ביטוי אוסטריקס נעדר בתאי בקרה בכל נקודות הזמן, ונראינו רק בשבעה ו -14 ימים של תרבות בתאים שנחשפו לגירוי חשמלי. תא הגירוי החשמלי קל יחסית לבנייה. עם זאת, יש לדאוג במיוחד בעת טיפול בחוילי הפלטינה, וגם בעת ניקוי ועיקור האלקטרודות.
תאים שטופלו מראש בחשמל בתא שלנו, לבד או יושבים על חומר פיגומים, יכולים להיות מושתלים במודלים של בעלי חיים, כדי לחקור כיצד ההשפעה החיובית של גירוי חשמלי נמשכת במבחנה. טכניקה זו מספקת כלי פשוט אך רב עוצמה ללמוד את המנגנון שבאמצעותו גירוי חשמלי מווסת את תפקודי התאים. ידע זה יכול להיות זמין בתאי רפואה רגנרטיבית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לבניית תא גירוי חשמלי לתרביות תאים, שנועד במיוחד לשפר דיפרנציאציה אוסטאוגנית בתאי גזע מזנכימליים. התא הוא יעיל מבחינה כלכלית, ניתן לשימוש חוזר, וניתן להעמידו לשימוש במגוון ניסויים העוסקים בהתנהגויות של תאים הרגישים לחשמל.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- תרבית תאים
- גירוי חשמלי
- דיפרנציאציה של תאי גזע
רקע
- ניתן להשפיע על תאי גזע מזנכימליים באמצעות גרייה חשמלית.
- דיפרנציאציה אוסטאוגנית היא קריטית להנדסת רקמות עצם.
- שיטות קיימות לגרייה עשויות להיות מורכבות או יקרות.
- פרוטוקול זה נועד לפשט את התהליך של החלת גרייה חשמלית.
מטרת המחקר
- לבנות תא גירוי חשמלי פשוט ובעל אפשרות לשימוש חוזר.
- להגביר דיפרנציאציה אוסטאוגנית בתאי גזע מזנכימליים.
- לספק כלי למחקר של התנהגויות תאיות שונות הרגישות לחשמל.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בניית תא גרייה באמצעות שש פלטות תרבית בעלות דפנות.
- סימון וקידוח חורים במכסה פלטת התרבית עבור גישה חשמלית.
- שימוש בחוטי פלטינה עבור גרייה חשמלית.
- החלת גרייה חשמלית על תאי גזע מזנכימליים.
תוצאות עיקריות
- בנייה מוצלחת של תא גירוי חשמלי בעלות נמוכה.
- הבחנה בדיפרנציאציה אוסטאוגנית מוגברת בתאי גזע מזנכימליים שעברו טיפול.
- פוטנציאל לשימוש חוזר במספר ניסויים.
- ניתנות ליישום בסוגי תאים ובהתנהגויות תאיות אחרות.
מסקנות
- תא הגירוי החשמלי הוא כלי יעיל למחקר.
- הוא יכול לשפר תוצאות בהנדסת רקמת עצם.
- מחקרים נוספים יכולים לבחון את השימוש בו עם סוגי תאים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
תאי גירוי חשמלי עבור תאי גזע/סטרומה מזנכיים (MSCs) מציעים פלטפורמה ניתנת להרחבה ולשחזור לבחינת מנגנוני גization אוסטאוגנית הרלוונטיים להנדסת רקמות עצם. יכולת זו מאפשרת הפחתת סיכונים בשלבים מוקדמים של אסטרטגיות רגנרטיביות מבוססות תאים ותומכת בביטחון ניבוי בתהליכי עבודה תרגומיים. הגישה מקלה על קבלת החלטות לגבי תיקי פיתוח על ידי אספקת תוצאים כמותיים וסטנדרטיים של פוטנציאל אוסטאוגני של MSCs תחת תנאי גירוי מוגדרים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הערכה שיטתית של רמזים חשמליים על נתיבי התמיינות של MSCs.
- תומך בהפחתת סיכונים מנגזונית על ידי בידוד ההשפעה של גירוי חשמלי על ביטוי של סממנים אוסטאוגניים.
- מספק תיקוף תפקודי של MSCs כמקור תאים ליישומים של רגנרציית עצם.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מקל על הכנת אוכלוסיות MSC עם התנייה חשמלית מוקדמת הניתנות לשחזור עבור בדיקות המשך.
- מבצע סטנדרטיזציה של פרמטרי הגירוי כדי להבטיח השוואתיות בין הבדיקות ותוצאה כמותית.
- מאפשר סריקה ניתנת להרחבה של חומרי פיגום או תרכובות בשילוב עם גירוי חשמלי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה תוצאות של בידול in vitro למודלים פרה-קליניים של ריפוי עצם על ידי חיקוי סביבות חשמליות פיזיולוגיות.
- תומכת ברציפות משלב התנאה של תאים בשלב הגילוי ועד למחקרי השתלה פרה-קליניים.
- מספקת פלטפורמה להערכת ההמשכיות של השפעות פרו-אוסטאוגניות לאחר הגירוי.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
תא גירוי חשמלי זה משתלב ברצף השלב שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לבדיקה מונחית-השערות שלהבדלה אוסטאוגנית של MSC, ותמיכה בבחירת מועמדים מובילים עבור תוכניות לרפואה רגנרטיבית.
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשרת בדיקה מבוקרת של השערת האפס לגבי השפעות של גרייה חשמלית על החלטות הגורל של MSC.
- סריקה: מספקת מדידות כמותיות הניתנות לשחזור של שיקיעת סידן וביטוי גנים אוסטאוגניים.
- אנליטיקה: תומכת בהשוואה סטטיסטית בין קבוצות טיפול לקבוצות ביקורת לצורך פרשנות נתונים חסונה.
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאים in vitro למודלים של תיקון עצם in vivo באמצעות התנעלות מוקדמת של תאים לפני השתלה.
- שימוש חוזר ארגוני: עיצוב התא הוא חסכוני, ניתן לשימוש חוזר וניתן להתאמה למגוון מחקרים של תאים רגישים לחשמל.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי באסטרטגיות ל재גנרציה של עצם המבוססות על MSC.
- ערך תפעולי: מאפשר תהליכי עבודה סטנדרטיים, ניתנים להרחבה ולשחזור עבור התניית תאים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות של go/no-go עבור מועמדים לטיפול תאי על ידי אספקת נתונים תפקודיים חסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של נכסים ברפואה רגנרטיבית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות תאים, בפרוטוקולים של גירוי חשמלי ובניתוח בדיקות כמותיות.
- נדרשת גישה לתשתית סטנדרטית לתרביות תאים ולמכשור חשמלי בסיסי.
- נדרש ניקוי ועיקור קפדניים של האלקטרודות כדי להבטיח הדירות.
- ניתן להתאים את הפרוטוקול למקורות שונים של MSC ולחומרי פיגום באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- טיפול זהיר בחוטי פלטינה ותיקוף של פרמטרי הגירוי חיוניים לקבלת תוצאות עקביות.
