Name: זיהוי לכל-כימית Polyfluorinated מינים בזרימת עבודה משולבת יישוב, שאינו ממוקד-סינון ברזולוציה גבוהה ספקטרומטר מסה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: חקור שיטה לזיהוי וכימות PFAS במי סביבה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטריית מסה. הפרוטוקול משלב גישות ממוקדות ולא ממוקדות לגילוי מזהמים ידועים וחדשים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ארצות הברית הסוכנות להגנת הסביבה, באמצעות Office של המחקר והפיתוח שלה, במימון וניהל את המחקר המתואר כאן. מסמך זה כולל נבדקו על ידי הסוכנות להגנת הסביבה של ארה ב, משרד של מחקר ופיתוח, ואף אושרו לפרסום. הדיעות במאמר זה הם אלה של המחברים, ואינן מייצגות בהכרח את ההשקפות או מדיניות של הסוכנות להגנת הסביבה ארה ב. מחקר זה נתמך בחלקה על ידי פעילות התוכנית מחקר פוסט-דוקטורט במעבדה הלאומית חשיפה המחקר מנוהל על ידי המכון אוק רידג מדע וחינוך דרך הסוכנויות DW89992431601 הסכם בין משרד האנרגיה האמריקני, הסוכנות להגנת הסביבה של ארה ב.

המחברים אין לחשוף.

עקרונות הטיפול מדגם ההכללה של הפניה/ספייק סטנדרטים הם ערך עליון בכל ניתוח ממוקד, כפי שהם מספקים ויצא מהצד השני לבדיקת תוקף אנליטית. חוסר QC דגימות מונע כל הערכה של דיוק התוצאות; הטבע בכל מקום של fluorochemicals כלומר הסיכוי לזיהום של דגימות שדה, עיבוד חומרים, או LC-MS מערכת אינו נדיר חייב להיות אחראים. עוד, זה מאפשר האימות של פרוטוקול ללא קשר וריאציה במדגם היומיומית עיבוד, כפי שרבים מהשלבים יכול להיות משתנה מאוד, במיוחד את SPE והשלבים ריכוז לדוגמה. החילוץ של שני כימיקלים perfluorinated מדור קודם, רומן יכול להיות מושפע בכבדות על-ידי הבחירה של שלב נייח ריכוז והרכיבים של הדגימות מקור, כגון pH ומליחות46. יש לקחת בחשבון את ההשפעה של תנאי מדגם אם למחלקות של pefluorinated כימיקלים הם עניין. ניתן להשתמש ערכות הכנה אלטרנטיביים דוגמת מים תמציות אם מעבדה ההתקנה אינו זמין, ניתוח הנתונים במורד הזרם נשאר דומה.
ניתוח נתונים יישוב עבור תרכובות עם סטנדרטים הזמינים, איזוטופ מתאימים, יציב עם התווית סטנדרטים פנימיים, החשש העיקרי לניתוח נתונים הם פלייבק והנחישות של שיטת זיהוי גבולות ואת טווחי דיווח מתאים יכול להיקבע על מעבדה-מאת-מעבדה בסיס שימוש בגישות סטנדרטיים, כגון יחס אות לרעש סטנדרט ברמה נמוכה קוצים47. בהיעדר תואם סטנדרטים פנימיים שגיאות מתופעות לא תואמת מטריצה יכולות להתרחש, הגב-חיזוי מדויק של דגימות מחודדים יכול לשמש כדי להעריך את הדיוק של המדידות. כאשר חסר תקנים כדי להכין עקומה, הערכה כמותית של ידוע יכול להתבצע בכך שהוא מתייחס אליה באופן זהה סטנדרט שהותאמו באופן הדוק במתחם, אך טעויות בהערכת גודל 10 + קיפול מוגבלת היכולת לכמת את הוודאות, רואה מק'קורד, ניוטון, Strynar21. במקרים אלה, עדיין ניתן לאסוף נתוני המגמה, אבל ריכוז הערכות להסתמך.
ניתוח נתונים שאינם במיקוד הגדרות האיסוף שיא יש השפעה משמעותית על מספר תכונות כימיות מזוהה, אבל האיכות של בחירת תכונות מושפע גם בכבדות. ההחלטות של התעניינות שיא האיסוף הם 1) עוצמת בודדים גושים כלילה הסף שפע יון 2) את עוצמת שחולצו chromatogram פיקס כדי להיחשב תכונות, זיהוי 3) כוללים תכונת הסף שפע ספקטרה, תדירות, הסף שכפל ו- 4) וריאציה אנליטית, הסף CV (איור 10).
הגדרת סף נמוך unrealistically עבור שיא איסוף תוצאות גידול מעריכי לדוגמה זמן לפתור את תכונות נוספות של שפע יותר ויותר נמוך (טבלה מס ' 7). המסננים הסף יון-שפע המוניים תכונות ספקטרליות איפה מספיק abundances איזוטופ בודדים שאינם עוברים את הסף. פעולה זו בוחרת באופן אידיאלי רק עבור תכונות עם איכות MS ספקטרה, הבטחת שהם תכונות כימיות ממש במקום רעש פלייבק, ומאפשר לחיזוי נוסחה בעיבוד במורד הזרם. הסף המתאים מבוססת על רעש פלייבק, אידיאלי לפחות 3 x הסף רעש עבור MS1 סורק. תכונה שפע הסף מסנן תכונות כימיות המבוססת על עוצמת או אזור של התכונה כרומטוגרפי שחולצו. שלב זה מאפשר דחייה של פסגות שפע נמוכה, אשר בדרך כלל באיכות ירודה כרומטוגרפי, יש סטיות גבוהה או הם התוצאה של מיצוי המסכן תוכנה אחרים. הסף המתאים צריכה להיקבע לכל ניסוי, לכל מטריצה המבוססת על רמת הדור המסכן תכונה (למשל, תכונות מתחת כרומטוגרפיה בעלי המסכן התערוכה הסף). בהמשך QC אנליטית יכול להיות נהגה לדחות תכונות ברמת כרומטוגרפי המבוססת על זיהוי לא עקבי באנליטי ו/או הכנה משכפל (מפתן שכפל) או בהתבסס על הפארמצבטית המסכן מעבר משכפל (CV מפתן). רמות המתאים תלויות איכות שיא שילוב התוכנה ששימשה וישויות כימי תחת חקירה. עבור תרכובות perfluorinated מסיסים במים והפרוטוקולים שילוב אופטימיזציה בקלילות, תכונות צריך להיות מזוהה ב- 80 + % אנליטי משכפל ו CVs צפויים ליפול מתחת 30%, כמפורט בסעיף שיטות.
הפסגות זוהה מניתוח שאינן ממוקדות לא תשואה הערכות כמותיות של ריכוזי החומרים זוהה. יתר על כן, הזהות של אלמונים נכון יכול להיות קשה לאשר כי תרכובות הרומן נעדרים ממסדי נתונים זמין לציבור. נחישות מבניים הרומן דורש ניתוח מקיף עם שיטות מרובות ואינו דורש מומחיות ספקטרומטר מסה וכימיה. עם זאת, נרמול האזורים שיא של תכונות כימיות יכול לספק הערכות כמותיות למחצה של ריכוזי נעלמים מינים מוכרים21. אם הדגימה עקבי ושלבי ההכנה הם מועסקים, זמן מידע מגמה עבור מינים בודדים יכול להיווצר לפקח התמדתו של חומר כימי העתיד כמו התגובה מינים בודדים צריך להיות עקבי אלא אם כן יהיו גדולים וריאציות מטריקס21.
היתרון העיקרי של שיטה זו הוא ההרחבה של הטיפול הדגימה כדי לאפשר ניתוח ממוקד והן nontargeted. בעוד ניתוח יישוב מספק מידע כמותי מקביל או מעולה, היא מאוד חסרה ולרוחבה של ניתוח הרצוי בעת התמודדות עם חומרים חדשים ומתפתחים, כמו גם היחסים שלהם לחומרים מטריקס. החלת מתודולוגיה יישוב, או אפילו חשוד הקרנת שיטה מבוסס רק על חומרים הידועים, מסדי נתונים מוגבלים עיוור לחלוטין מינים unobserved בעבר, אפילו אם ייתכן שיש להם השפעות בריאותיות משמעותיות. משפר את התוכנה, מסדי נתונים הופכים עמידים יותר, דיוק הזיהוי לא ידוע תמשיך לגדול, עם ירידה הנוטלים הזמן וההשקעה ורמת המומחיות צורך לנתח את הנתונים רב-ממדי שנוצר על ידי זה הגישה. בכל זאת, נתונים שנוצרו כיום היא בעל ערך משמעותי בעתיד כי נתונים בנקאות מאפשר ניתוח פוסט-הוק עם התוכנה החדשה שפותחה ומאפשר השוואה לאורך זמן גם אם זהותו של תרכובת שזוהו אינו ידוע כיום.

מחלקת לכל-חומרים polyfluoroalkyl (PFASs) הם מתמידים מזהמים אורגניים בדאגה לבריאות הציבור משמעותית. תרכובות ייעודיות perfluorooctanoic חומצה (PFOA) ואת perfluorooctanesulfonate (עמק חפר) יש מי שתייה בריאות המייעצת רמות שנקבעו על ידי המשרד לאיכות הסביבה1,2 , הייצור העיקריים שלהם בארה ב הפסיקה של שנות האלפיים3,4 . כדי להשיג הבנה משמעותית עבור המאפיינים של PFAS החומרים במוצר טקסטיל ומוצרי הצריכה ייצור הספירות, מאות, אם לא אלפים, של בדיקות PFAS חלופי, הביוכימיה פותחו כדי למלא נישות המוצר, כולל מחליפים תרכובות במצב deprecated5,6,7,8. יש צורך בניטור רמות איכות הסביבה של שרשרת ישר perfluorinated קרבוקסילית חומצות המתמשך, sulfonates כזה עמק חפר, PFOA, וסדרות שלהם קשורות הומולוגיים, אבל תרכובות כימיות המתעוררים שאינם מכוסים על ידי שיטות הוקמה כגון המשרד לאיכות הסביבה שיטת 5379 ולעיתים קרובות חוסר סטנדרטים אנליטיים לניתוח יישוב מסורתיים. כוונתו של פרוטוקול זה היא לפיכך כפולה. הוא מספק מסלול לניתוח LC-MS/MS יישוב של שטיח מינים במים שבו זמינות סטנדרטים אנליטיים, פרטים השילוב חלקה של שאינן ממוקדות ברזולוציה גבוהה מבוססי ספקטרומטר מסה גישה לניתוח נתונים המאפשרת זיהוי תרכובות לא ידוע או לא צפוי הדגימות באותו.
מיצוי מוצק-פאזי (SPE) היא טכניקת הוקמה כדי להפוך את הדגימה ניקוי ריכוז עם יישומים רבים analytes ודגימת מטריצות10,11. ניתוח PFAS, מרובות שלבים לפרטים מלאים כולל הלא קוטבי, functionalized הקוטב, יונים עמודות שימשו על היקף בדרגות שונות עבור מחלקות של מינים fluorinated במגוון רחב של מטריצות9,12, 13,14,15,16. ההתקדמות SPE דגימת באמצעות setups ופשוט מאוד להגדיל את התפוקה של הגישה ולשפר את הפארמצבטית הטיפול דגימה, אך התהליך הבסיסי נשאר עקבי17. גם שבוצעו ליצירת כמה ניסיונות כדי להסיר את ריכוז מנותק SPE באמצעות זריקות נפח גדול, אבל אלו דורשים שינויים כרומטוגרפיה שמעמידות אותם מחוץ לתחום ניתוח מזדמנים18,19 . ניתוח המדגם שלנו משתמשת שלב לפרטים של exchange (שעווה) אניון חלש פולימריים ביסודיות להפריד חומרים PFAS חומצי מזהמים אורגניים המסורתית תוך השגת דגימה משמעותי ריכוז גורמים. שלב שעווה זה חשוב ללכוד את חומצות perfluorinated קצרות שרשרת כגון perfluorobutane סולפונאט (PFBS) או קטונים perfluorinated כגון חומצה דיימר תחמוצת hexafluoropropylene (HFPO-DA) אשר הן פולריות יותר מאשר perfluorinated מדור קודם עוד השרשרת מינים20,21. כבר יש שינוי משמעותי לעבר אתר הכללה לנסתר fluorinated קצר יותר PFAS האחרונות כימיה5, זו בחירה שלב מאפשרת שחזור יסודית יותר של תרכובות הרומן לניתוח MS.
כימות LC-MS/MS ממוקד משתמש מאומת סטנדרטים, איזוטופ יציב עם התווית סטנדרטים פנימיים ומספק רמה ללא תחרות של ירידה לפרטים ורגישות לניתוח כמותי. גישה זו היא רצויה במצבים רבים, היא מעשית למצבים כל מדי נפוץ בניתוח. גישות יישוב עובד רק עבור מינים צפויים במדגם, ועבור אילו שיטות בעבר הוקמו. עבור תרכובות חדשים ומתפתחים, גישה זו הוא מסוגל אפילו גילוי מין זה יכול להיות מעניין, ללא קשר כימיה או ריכוז, ו ברזולוציה נמוכה ספקטרומטרים המוני אינם מסוגלים כמעט מתן מידע מספיק כדי לבצע חד-משמעית הקצאות הכימי של תרכובות לא ידוע. כתוצאה מכך, בתחום ניתוח שאינו ממוקד שצמחו, מינוף הכוח של ברזולוציה גבוהה ספקטרומטרים המונים מודרניים כדי לנתח דגימות ללא הנחה presupposed ולהקצות בדיעבד כימיקלים לתכונות לזיהוי במדגם. גישה זו כבר בשימוש נרחב בתחומי הביולוגיה22,23,24 ו מדעי הסביבה25,26,27 על שיעורים רבים של כימיקלים. Perfluorinated כימיקלים פשוטה במיוחד לזהות בשיטה זו עקב דפוסי המוני ספקטרלי הייחודי שלהם, מאות תרכובות תוארו רק העבר כמה שנים5,28.
פרוטוקול שנדונו כאן מיועדת ליישור כימות LC-MS/MS PFAS יישוב עם הצורך לזהות ולנטר באופן כמותי למחצה תרכובות המתעוררים עניין. השלב SPE מבחר, טכניקות להכנת הדגימה נועדו להבטיח לכידת של חומצות PFAS המתעוררים הידרופילית יותר מן המים, עשוי להיות פחות מתאים יותר שרשרת פולימריים מינים ומינים ללא יונית. עוד יותר, הנתונים שנוצרו על-ידי ניתוח שאינו ממוקד צפופה, של dimensionality גבוהה, אשר מחייבת שימוש תוכנה לניתוח נתונים. חבילות תוכנה כזו הם לעתים קרובות ספציפי לספק ודורשים שינוי לפעול בין פלטפורמות כלי נגינה. במידת האפשר, תהליך ניתוח שתיארנו באופן כללי מקור פתוח/freeware חלופות מוזכרים, אך היעילות והדיוק של כל גישה תוכנה חייב להיות מוערך על בסיס פרטני.

<table><tbody><tr><td>מערכת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד של Acqity&nbsp;</td>תאגיד <td></td><td>ווטרס</td><td>שונה עם ערכת ניתוח PFCs (176001744); מערכת UPLC מקבילה מקובלת אם רקע PFAS נבדק ואושר כנמוך</td></tr><tr><td>אמוניום אצטט</td><td>Fluka</td><td>17836</td><td>ספקטרומטריית מסה דרגה >99%</td></tr><tr><td>אמוניום הידרוקסיד</td> טהור <td>Sigma-Aldrich</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler</td><td>AB204S</td><td></td></tr><tr><td>BEH C18 עמודת UPLC שלב הפוך, 2.1 ופעמים; 50&nbsp; מ"מ, 1.7&nbsp; &mu; מ&nbsp;</td><td>תאגיד ווטרס</td><td>186002350</td><td></td></tr><tr><td>משאבת מזרק בוכנה כפולה&nbsp;</td><td>תאגיד ווטרס</td><td>SPC10-C</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>ARK2183&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מסנני מיקרופייבר זכוכית</td><td>Whatman</td><td>1820-070</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק מדגם פוליאתלי בצפיפות גבוהה&nbsp;</td><td>נלג'ין</td><td>2189-0032&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה</td> ספקטרומטר מסה <td>שונים</td><td></td><td>צריך להיות מסוגל לספק מסה מדויקת ל-< 10 דפים לדקה ואיסוף נתוני MS/MS.&nbsp; Agilent 6530 qTOF ו-Thermo Fisher Orbitrap Fusion שימשו בעבודה זו</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומצה חנקתית (35% w/w)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SVCN-5-1</td><td>ניתן להכין בבית באמצעות חומצה חנקתית מרוכזת ומי ריאגנט</td></tr><tr><td>משפך פוליפרופילן בוכנר</td><td>ACE Glass</td><td>12557-09&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>צינור וכובע צניטרפוגה מפוליפרופילן</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק ואקום פוליפרופילן (1 ליטר)</td><td>Nalgene</td><td>DS4101-1000</td><td></td></tr><tr><td>Quattro Premier XE ספקטרומטר מסה מרובע משולש&nbsp;</td><td>במקום זאת ניתן להשתמש במערכת מקבילה לשלושה קוואדרופול או טובה יותר, אמורה לספק רגישות ויציבות גבוהות</td><td></td><td></td> לניתוח ממוקד</tr><tr><td>מים</td><td></td><td></td> ריאגנטים <td>כל מקור שנקבע כנטול PFAS</td></tr><tr><td>נתרן אצטט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>W302406</td><td></td></tr><tr><td>מאייד חנקן TurboVap&nbsp;</td>ניתן <td></td><td>להשתמש במקום זאת במערכות שוות ערך ל 103198 מדעי החיים של קליפר או מאייד ואקום סיבובי</td><td></td></tr> <tr><td>מחסנית SPE להחלפת אניונים חלשה (Oasis WAX Plus)</td><td>Waters Corporation</td><td>186003519</td><td></td></tr><tr><td><פתרונות חזקים>סטנדרטיים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,3,3,3-Tetrafluoro-2-(1,1,2,2,3,3,3,3-heptafluoropropoxy)חומצה פרופנואית (HFPO-DA)</td><td>וולינגטון</td><td>HFPO-DA</td><td></td></tr><tr><td>תקני תרכובות ממוקדים</td><td></td><td></td> נוספים <td>שייקבעו על סמך ניתוח ראשוני וזמינות סטנדרטית</td></tr> תערובת PFCA/PFAS <tr><td>מקורית HFPO-DA</td><td>Wellington</td><td>M2HFPO-DA</td><td></td></tr><tr><td>(2 ug/mL)</td> <td>Wellington</td><td>PFAC-MXA</td><td>או PFAC-MXB; או תערובת שהוכנה בנפרד המכילה תרכובות מעניינות</td></tr><tr><td>איזוטופ יציב עם תווית PFCA/PFAS תערובת (2 ug/mL)</td> <td>Wellington</td><td>MPFAC-MXA</td><td>או MPFAC-MXB; או תערובת שהוכנה בנפרד המכילה תרכובות מעניינות בהתאם ל-PFAS מקוריים</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mass Profiler Professional</td><td>Agilent</td><td></td><td>או חבילות תוכנה בקוד פתוח</td></tr><tr><td>Profinder</td><td>Agilent</td><td></td><td>או חבילות תוכנה בקוד פתוח</td></tr></tbody></table>

זיהוי לכל-כימית polyfluorinated מינים בזרימת עבודה משולבת יישוב, שאינו ממוקד-סינון ברזולוציה גבוהה ספקטרומטר מסה

Identifying Per- and Polyfluorinated Chemical Species with a Combined Targeted and Non-Targeted-Screening High-Resolution Mass Spectrometry Workflow

היסטורית והעתידיים לאדם-, חומרים polyfluoroalkyl (PFASs) משכו עניין משמעותי ציבוריים, ממשלתיים סוכנויות הנסיעות מ המקומי לרמות הפדרלי. ההתפתחות המתמשכת של בדיקות PFAS, הביוכימיה מציג לאתגר ניטור סביבתי, איפה פיתוח מתמשך של שיטות יישוב בהכרח ומהפיתוח הגילוי של תרכובות כימיות חדשות. יש צורך, לכן, יש מתודולוגיות שפניה לעתיד יכולים לזהות תרכובות המתעוררים ובלתי צפויה, לפקח המינים הללו לאורך זמן, ולא לפתור את הפרטים של המבנה הכימי שלהם כדי לאפשר בעתיד לעבוד על בריאות האדם. למטרה זו, ממוקדות ללא ניתוח באמצעות ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה מציעה גישה זיהוי בסיס רחב זה יכול להיות משולב עם ערכת הכנה כמעט כל מדגם ומספק יכולות משמעותיות עבור זיהוי המורכב לאחר גילוי. במסמך זה, אנחנו תארו שיטה מדגם מיצוי מוצק-פאזי (SPE) המבוסס על ריכוז מכוון עבור שרשרת קצרה יותר, יותר הידרופילית PFAS בדיקות, הביוכימיה, כגון חומצות אתר fluorinated ו sulfonates,. ומתארות ניתוח לדוגמאות שהוכנו בצורה הזאת ב מצבי יישוב והן שאינן ממוקדות. שיטות יישוב לספק כימות מעולה בעת הפניה סטנדרטים זמינים אך מוגבלות מהותית לתרכובות הצפוי בעת ביצוע ניתוח. לעומת זאת, בגישה ממוקדות שאינם יכולים לזהות הנוכחות של תרכובות בלתי צפוי, לספק מידע מסוים אודות המבנה הכימי שלהם. מידע אודות תכונות כימיות ניתן לתאם תרכובות על פני מיקומי הדגימה ולעקוב אחר לשפע, מופע לאורך זמן.

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול כימות יישוב רציף וניתוח שאינן ממוקדות של תרכובות fluorinated במים באמצעות ספקטרומטר מסה. מתודולוגיה זו מספק רמות כמותית של תרכובות שטיח ידוע ומזהה כימיקלים לא ידוע בדגימות קשורים עם הערכות כמותיות למחצה של שפע שלהם.

זיהוי לכל-כימית Polyfluorinated מינים בזרימת עבודה משולבת יישוב, שאינו ממוקד-סינון ברזולוציה גבוהה ספקטרומטר מסה

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the ...

גישה זו מאפשרת כימות של PFAS ידוע וגילוי של חומרים חדשים באותן דגימות, בהשוואה לגישות ממוקדות בלבד המפספסות תרכובות מתעוררות של דאגה. פרוטוקול זה מתמקד במגוון רחב יותר של תרכובות PFAS, המייצגות את הכימיקלים החדשים המתעוררים. אם שלב הריכוז מותאם לתרכובות, שיטות המדידה המשמשות כאן יכולות להיות מיושמות על כל סוג של כימיקלים.כדי לאסוף מדגם מהשדה, ללבוש כפפות ניטריל ולאסוף 500 עד 1,000 מיליליטר של מים ממיקום השדה בבקבוק פוליאתילן נקי בצפיפות גבוהה, HDPE או פוליפרופילן. הוסיפו חמישה מיליליטר של חומר משמר 35% חומצה חנקתית לבקבוק הדגימה ולשדה ריק, והעברו את הדגימות בחזרה למעבדה. יוצקים כל דגימה לתוך בודדים, מראש ניקה, ליטר אחד, פוליפרופילן בצפיפות גבוהה מדורגים צילינדרים, ולתקליט את הנפח המדויק של הדגימות.מוסיפים 10 מיליליטר של מתנול לכל בקבוק מדגם מרוקן לפני המכסה ורועדים במרץ כדי לשטוף חומרים נספגים לכל ופוליפלואורואלקיל, או PFAS, מפנים הבקבוק. לאחר מכן, להחזיר את דגימת המים נמדד לבקבוק שטף עם שטיפה מתנולית. כדי להשיג עקומה סטנדרטית לכמותה, מלאו שמונה בקבוקי דגימה ריקים בליטר אחד במים נטולי PFAS, ותייגו את הבקבוקים בשמונה ריכוזים במטווח שווה המכסים את טווח הכימות הרצוי.לאחר מכן, הוסיפו כמות של תערובת PFAS מקורית לכל בקבוק כדי להניב את ריכוזי PFAS המתאימים, והוסיפו את תערובת ה- PFAS הסטנדרטית הפנימית לכל מדגם בריכוז המשוער לנקודת האמצע של עקומת הכיול. לאחר מכן, לסנן את הדגימות דרך סיבי זכוכית מסננים תחת ואקום עדין לתוך בודדים, ניקה מראש, בקבוקונים בצפיפות גבוהה פוליפרופילן ואקום. אם חומר חלקיקי נשאר בתוך הבקבוק, לשטוף את המים deionized נוספים, ולסנן את לשטוף לתוך הבקבוק.עבור מיצוי שלב מוצק, להחזיר את המים המסוננים לבקבוק מדגם, ולהניח חילופי אניון חלש, או שעווה, מחסנית עם 25 מיליליטר של מתנול ו 25 מיליליטר נוספים של מים deionized. מקם את צינורות המשאבה בתוך בקבוקי הדגימה המסוננים, ותיוג מיצוי בשלב מלא, או SPE, מחסניות עם שמות המדגם המתאימים. לשאוב 500 מיליליטר של כל מדגם דרך כל מחסנית בקצב זרימה קבוע של 10 מיליליטר לדקה, השלכת זרימה דרך.הסר את מחסניות ה- WAX SPE ממשאבות הבוכנה והעבר את מחסנית ה- SPE לסעפת ואקום, המצוידת במאגרי זכוכית חיצוניים. שטפו כל מחסנית SPE עם ארבעה מיליליטר של חיץ נתרן אצטט 25 מילימולר, pH 4 תחת ואקום עדין, ואחריו לשטוף מתנול ניטרלי ארבעה מיליליטר. בסוף הכביסה, מניחים צינור פוליפרופילן 15 מיליליטר צנטריפוגה מתחת לכל מחסנית SPE כדי לאסוף את eluent, ולהטמיע את הדגימות עם ארבעה מיליליטר של 0.1% אמוניום הידרוקסיד במתנול.לאחר מכן, להסיר את צינורות elution, ולהפחית את נפח eluate ל 500 כדי 1,000 microliters על ידי אידוי תחת זרם חנקן יבש באמבט מים ב 40 מעלות צלזיוס. עבור כרומטוגרפיה נוזלית ממוקדת עם ספקטרומטריית מסה טנדם, לדלל 100 microliters של תמצית מדגם עם 300 microliters של שני מילימולר אמוניום אצטט מאגר בבקבוקון מדגם כרומטוגרפיה נוזלי בלחץ גבוה, ולהכין רשימת עבודה אנליטית המורכבת העקומה הסטנדרטית, דגימות, שכפול נוסף של העקומה הסטנדרטית כדי להעריך להיסחף אינסטרומנטלי על פני הריצה. לנתח את הדגימות באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית סטנדרטית ושיטות ספקטרומטריית מסה שנקבעו עבור תרכובות ממוקדות של עניין.בסוף הניתוח, ליצור עקומה סטנדרטית מן הדגימות הסטנדרטיות באמצעות יחס אזור השיא של analyte לסטנדרט הפנימי לעומת ריכוז של analyte, וליצור נוסחת רגרסיה מרובעת עם אחד מעל x שקלול עבור חיזוי ריכוז. מכמתים את האנליטים הממוקדים בכל דגימה באמצעות העקומות הסטנדרטיות המוכנות ויחס השטח עבור כל מדידה. אם הריכוז חורג מטווח הכיול, מדללים את המדגם המקורי במים מיונים עם הריכוז הסטנדרטי הפנימי המתאים, ומוציאים מחדש כדי להביא את הריכוז לטווח המתאים.עבור כרומטוגרפיה נוזלית לא ממוקדת עם ספקטרומטריית מסה טנדם, לדלל 100 microliters של תמצית מדגם עם 300 microliters של מאגר אמוניום אצטט שני מילימולרים לתוך בקבוקון מדגם כרומטוגרפיה נוזלי בלחץ גבוה. לאחר הגדרת רשימת עבודה כפי שהוכח, השתמש בתוכנת המכשיר כדי לאסוף נתוני ספקטרומטריית מסת כרומטוגרפיה נוזלית עם סריקה רחבה במצב תלוי נתונים. לעיבוד נתונים לא ממוקד, פתחו את חבילת התוכנה המתאימה לחילוץ תכונות מולקולריות ובחרו 'הוספה/הסרה של קבצים לדוגמה' ו'הוספת קבצים', ובחרו את הנתונים הגולמיים מהניסוי הלא ממוקד.לחצו על הלחצן 'אשר' ובחרו 'חילוץ תכונות רקורסיביות באצווה' ו'פתח שיטה' כדי לטעון שיטה שנקבעה מראש או כדי לערוך ידנית את הגדרות התוכנה. עבור כל תכונה שנותרה לאחר הסינון, צור נוסחאות כימיות חזויות מהספקטרום המסה והמרוכב המדויק, ופתח את כלי החיפוש של לוח המחוונים של CompTox Chemicals של הסוכנות להגנת הסביבה. כדי לחפש בנוסחאות הכימיות החזויות או בהמונים הניטרליים, כדי להחזיר מבנים כימיים פוטנציאליים, בחר את סוג המזהה והדבק את רשימת המזהים בתיבת המזהה.בחר הורד נתונים כימיים וכל נתונים פיזיים, כימיים או רעילים הרצויים עבור התאמות פוטנציאליות מהתפריט הנפתח. לאחר מכן, אשר את המבנים באמצעות הסטנדרטים הזמינים ו / או ממוקד ספקטרומטריית מסה טנדם ברזולוציה גבוהה התאמת שברים נגד הספקטרום מתוך מסדי הנתונים, בספקטרום תיאורטי silico, או אוצרות ידנית. כרומטוגרפיה נוזלית כמותית עם תוצאות ספקטרומטריית מסת טנדם מוצגות בצורה של כרומטוגרמות יון עבור כרומטוגרמת היונים הכוללת וכרומטוגרמות היונים המופקות של מעברים כימיים ספציפיים לכימיקלים נמדדים.אזור השיא המשולב של מעבר כימי קשור לשפע המורכב ונוהג לשמש לחישוב הריכוז המדויק באמצעות עקומת כיול מנורמלת לסטנדרט פנימי. ניתוח לא ממוקד באמצעות סריקת טרשת נפוצה מלאה מניב כרומטוגרמת יון כוללת לדגימות, המאפשרת יצירת אד הוק של כרומטוגרמות יון שחולצו עבור יונים בודדים. תרכובות PFAS יש פגמים במסה שלילית בשל preponderance שלהם של אטומי פלואור, ותרכובות פוליפלואורין יש פגמים חיוביים אך קטנים משמעותית מסה מאשר חומרים אורגניים הומולוגיים.שלב נוסף בסינון השיטה הוא לזהות סדרות הומולוגיות המכילות יחידות חוזרות המשותפות למינים של PFAS באמצעות חבילת תוכנה מתאימה. מנתוני טרשת נפוצה ברזולוציה גבוהה, ניתן להתאים פורמולה כימית פואטית אחת או יותר לטביעת האצבע איזוטופית של ספקטרום המסה ולהבקיע. נוסחאות כימיות ניתן לאשר עוד יותר, וכמה מידע מבני ניתן לצבור מנתוני ספקטרומטריית מסה טנדם.ניתן להשתמש בניסויים נוספים בספקטרומטריית מסה כדי לאשר את זהותם של תרכובות חדשות, והשוואות מדגם יכולות לתת מידע על השכיחות והכמות היחסית של כימיקלים. חשוב מאוד שיהיו ריקים מתאימים ודגימות בקרת איכות עבור המטריצה כדי לאמת את המדידות הכמותיות והבלתי ממוקדות. האסטרטגיות המוצגות הפכו לגישה החדשה לסינון סביבתי עבור PFAS על ידי מתן אפשרות לגילוי אלמונים וחיזוי זהותם.

identifying-per-polyfluorinated-chemical-species-with-combined

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

תרכובות לכידת הם מולקולות קטנות trifunctional כדי להפחית את המורכבות של proteome על ידי תפקודית אינטראקציה הפיך מולקולות חלבון קטן ואחריו crosslinking-צילום טיהור. כאן אנו משתמשים מתחם לכידת...

פרופיל של Methyltransferases ועל אחרים S-Adenosyl- L-הומוציסטאין מחייב חלבונים על ידי ספקטרומטריית מתחם המיסה לכידה (CCMS)

פרופיל מטבוליט לא ממוקד על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (UPLC-MS) היא טכניקה רבת עוצמה לחקירת חילוף החומרים.  מאמר זה מתאר זרימת עבודה טיפוסית המשמשת לפרופיל מטבוליט לא ממוקד של סרום, כולל ארגון והכנת דגימות, רכישת נתונים, ניתוח נתונים, בקרת איכות וזיהוי מטבוליטים.

בקנה מידה גדול Profiling metabolomic ללא ממוקד של סרום על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים-Mass ספקטרומטריית Ultra (UPLC-MS)

לא ממוקד metabolomics מספק השערת יצירת תמונת מצב של פרופיל מטבולי. פרוטוקול זה יהיה להדגים את המיצוי והניתוח של מטבוליטים מתאי, סרום, או רקמות. מגוון המטבוליטים סקר באמצעות מיצוי שלב נוזלי נוזלי, microflow ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית / רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS) מצמידים את תוכנת ניתוח ההפרש.

Metabolomics לא ממוקדים ממקורות ביולוגיים באמצעות Ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית-רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS)

זמן תגובה להעברת פרוטונים של ספקטרומטריית מסה של טיסה מאפשרת ניתוח רגיש גבוה, מהיר ולא פולשני של תרכובות אורגניות נדיפות. כדי להדגים את הפוטנציאל שלו, אנו נותנים שלוש דוגמאות: תסיסה של חומצת חלב של יוגורט (ניטור ביולוגי מקוון), גנוטיפים שונים של תפוחים (סינון בקנה מידה גדול) וחלל רטרו-אף לאחר שתיית קפה (ניתוח חלל האף).

PTR-ToF-MS יחד עם מערכת הדגימה אוטומטית וניתוח נתונים מותאמים למחקרים על מזון: ניטור Bioprocess, הקרנה וניתוח שטח האף

אנו מציגים פרוטוקול לניתוח שאינן ממוקדות באמצעות שעת הטיסה ספקטרומטר מסה כמו הכלי המושלם כדי לזהות תרופות במים. נדגים את היישום של הקרנת UV לחיסול שלהם. ניתוח מעורבים הקרנה, מתחם בידוד, זיהוי, דגמי קינטי של הפרופילים השפלה מודגם.

זיהוי של תרופות בסביבה המימית באמצעות HPLC-ESI-Q-תוף-MS וחיסול של אריתרומיצין דרך צילום-Induced השפלה

פרוטוקול זה מתאר תפוקת יחיד של שיטות אנליטיות, טכנולוגיות משלימים לשיאה אפיון מלא-זוגי של חומר אורגני טבעי, פרוטאומיקס מיקרוביאלית של מערכות אקולוגיות. גישה זו מאפשרת השוואות חזקים לזיהוי מסלולים מטבוליים והעתקות חשוב המתאר הפקת גז חממה, חיזוי תגובות השינוי הסביבתי.

יחיד-תפוקה משלימים שיטות אנליטיות ברזולוציה גבוהה עבור אפיון תערובות מורכבות חומר אורגני טבעי

מתוארים היא זרימת עבודה פרוטאומניקה לזיהוי שותפים אינטראקציה חלבונים מתוך שבר גרעיני subcellular באמצעות העשרת זיקה חיסונית של חלבון נתון של ריבית ותוויות המסה חינם התווית. זרימת העבודה כוללת שבירה תת-תאית, immunoprecipitation, סינון הכנה לדוגמה, ניקוי לא מקוון, ספקטרומטר מסה וצינור ביואינפורמטיקה במורד הזרם.

Immunoprecipitation ללא תווית של זרימת עבודה בהיקפים גדולים של החברה ליצירת פרופיל רב-ממדי של Interactome גרעינית

פרוטוקול זה מכסה ניתוח מפורט של הרכב פפטידוגליקן באמצעות ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם מיצוי תכונות מתקדם ותוכנת ניתוח ביואינפורמטיקה.

ניתוח כמותי למחצה של פפטידוגליקן על ידי כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית מסה וביואינפורמטיקה

מטרת פרוטוקול זה היא לזהות מטבוליטים פנוליים בפלזמה באמצעות שיטת ספקטרומטריה כרומטוגרפיה-מסה ממוקדת למחצה.

כרומטוגרפיה אולטרה-גבוהה ממוקדת למחצה בשילוב ניתוח ספקטרומטריה המונית של מטבוליטים פנוליים בפלזמה של קשישים

בנינו זרימת עבודה מטבולית לא ממוקדת ששילבה את XY-Meta ו-metaX יחד. בפרוטוקול זה, הצגנו כיצד להשתמש ב- XY-Meta כדי ליצור ספרייה ספקטרלית מתוך הפניה לספקטרה בגישה פתוחה, ולאחר מכן ביצענו בקרת FDR והשתמשנו במטה-X כדי להגדיל את המטבוליטים לאחר זיהוי ספקטרום המטבולומיקה.

זרימת עבודה משולבת של זיהוי וכימות במטבולום לא ממוקד מבוסס בקרת FDR

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה פשוטה ויעילה להובלה למרחקים ארוכים של חומצות פרפלואורואלקיל בחיטה.

חקירת הובלה למרחקים ארוכים של חומצות פרפלואורואלקיל בחיטה באמצעות טכניקת חשיפה לשורש מפוצל

חקור שיטה לזיהוי וכימות PFAS במי סביבה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטריית מסה. הפרוטוקול משלב גישות ממוקדות ולא ממוקדות לגילוי מזהמים ידועים וחדשים.

זיהוי לכל-כימית Polyfluorinated מינים בזרימת עבודה משולבת יישוב, שאינו ממוקד-סינון ברזולוציה גבוהה ספקטרומטר מסה

גלה סרטונים נוספים