Name: תפוקה גבוהה הנועד להעריך ולכמת את היווצרות נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: למד שיטה רגישה להערכת היווצרות נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית (NETs) באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקל תלת-ממדית. פרוטוקול זה מאפשר מחקר מדויק של מנגנוני מחלות אוטואימוניות ופיתוח טיפולים מכוונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה של Eline ג'יי Arends ו Y.K. אונו טנג נתמך על ידי ההולנדי כליות הקרן (17OKG04), אחוות קלינית מארגון הולנד למחקר מדעי (90713460). העבודה לורה ס ון דאם נתמכת על ידי העמותה לחקר ראומטולוגיה (FOREUM).

כל החולים בקרות בריא הסכים להשתתף biobank LUMC. שני המחקרים biobanking אושרו על ידי הוועדה האתית LUMC.
1. בידוד של נויטרופילים בריא
<ol><li>להשיג 20 מ של דם היקפיים מתורם בריא שני צינורות מצופים EDTA 10 מ"ל.</li>
	<li>מכניסים צינור סטרילי 50 מ ל 10 מ"ל של דם ולהוסיף buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) עד 32.5 מ ל.</li>
	<li>
הוסף דחיסות צבע (למשל., Ficoll-amidotrizoaat) תחת התאים.
	<ol>
<li>תופסים 14 מ של דחיסות צבע עם 10 מ ל pipet, pipet בקר.</li>
		<li>מניחים את pipet על התחתון של הצינור 50 מ.</li>
		<li>לקחת את הבקר pipet הנחה pipet, המאפשר מעבר הצבע צפיפות לזרום מתוך pipet חוק המשיכה עד המרבי על ידי אפקט נימי (1-2 מ ל יישאר), ללא שימוש המנוע.</li>
		<li>הסר pipet על-ידי הצבת אגודל על גבי pipet, ובכך מונע צפיפות הדרגתי דולף החוצה במהלך הסרת pipet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לסובב את הצינורות כעשרים דקות ב 912 x g ובטמפרטורת החדר (RT) ללא האצה או בלם. הערה: תאי דם אדומים (RBC) ו נויטרופילים צפיפות גבוהה ונמצאות בחלק התחתון של הצינור 50 מ. תאי תאי דם היקפיים (PBMCs) הם נפרדו, על גבי המילוי ההדרגתי צפיפות כמו טבעת לבנה. פלזמה מדולל-PBS יהיה מעל PBMCs. אם יש צורך, PBMCs יכול להיות מבודדת על ידי העברת הטבעת לבן צינור 50 מ עם צעדים נוספים כביסה עם PBS.</li>
	<li>הסר בזהירות את הטבעת לבן המכיל PBMCs ראשון, ואחריו הסרת פלזמה מדולל-PBS ולבסוף את צפיפות השכבה הדרגתי ככל האפשר.</li>
	<li>
כדי לבודד נויטרופילים מהתערובת נויטרופילים/אריתרוציטים, lyse אריתרוציטים מאת קר במים מזוקקים סטריליים.
	<ol>
<li>קח קר בקבוק מים מזוקקים סטריליים, סימן x 10 מרוכזים PBS הבקבוק מהמקרר.</li>
		<li>לעבוד מהר בשלב זה. להוסיף 36 מ"ל מים מזוקקים קרים סטרילי ישירות מעל בגדר ולערבב פעם אחת בקפידה. להוסיף 4 מיליליטר 10 x PBS לאחר 20 s כדי ליצור פתרון מול. מערבבים פעם אחת בקפידה.</li>
		<li>ספין צינור 5 דקות ב 739 x g ו- C ° 4 (להסרת RBCs). נויטרופילים יהיו בגדר לבן.</li>
		<li>בזהירות למחוק את תגובת שיקוע. בצע שוב את שלב 1.6.2 וודא שבגדר מושעה כראוי.</li>
		<li>ספין צינור עבור 5 דקות ב 328 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>בזהירות להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 5 מ של PBS. לספור נויטרופילים ולשמור אותם על קרח. הערה: התשואה הצפויה של דם (10 מ"ל) צינור 1 הוא כ- 15-75 מיליון נויטרופילים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. תא ניאון אדום תוויות של נויטרופילים
<ol><li>להפוך השעיה נויטרופילים של 10-20 מיליון נויטרופילים ב 2 מ של PBS בשפופרת 15 מ"ל.</li>
	<li>להפוך את פתרון של 2 מ ל PBS עם 4 µL של 2 מיקרומטר תא ניאון אדום מקשר (ראה טבלה של חומרים) צינור שונה 15 מ"ל. להוסיף את זה בעדינות כדי ההשעיה נויטרופילים ומערבבים היטב.</li>
	<li>דגירה בחושך בדיוק 25 דקות ב 37 ° C כדי להדביק תווית נויטרופילים עם מקשר תא ניאון אדום.</li>
	<li>בטל תיוג על-ידי הוספת RPMI 1640 בינוני המכיל 10% חום להשבית סרום שור עוברית (FCS) ב RT עד 15 mL ולערבב פעם בקפידה. ודא כי בגדר בקפידה resuspended אם גלולה הקימה.</li>
	<li>ספין צינור 5 דקות ב 328 x g ו- RT.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע, resuspend צנפה ב 5 מ של פנול אדום ללא RPMI 1640 בינוני המכיל 2% FCS ו-10% P/S-RT. נחשב נויטרופילים. הערה: תא הפסד של 50% יכולה להתרחש לאחר labelling תא ניאון אדום.</li>
</ol>3. אינדוקציה של היווצרות נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית
<ol><li>להפוך את התא השעיה של 0.42 x 106 תאים למ"ל פנול אדום חינם RPMI 1640 בינוני המכיל 2% FCS ו- 10% P/S.</li>
	<li>להוסיף נויטרופילים 37,500 µL 90 לכל טוב בצלחת התחתונה 96-ובכן, שטוח שחור.</li>
	<li>להוסיף 10 µL הגירוי שבחרת (למשל, סרה של המטופל) דולר כדי להגיע בריכוז 10% בתוך הבאר. תמיד לכלול פקד שלילי (בינוני) בשלושה עותקים.</li>
	<li>דגירה בחושך ב 37 מעלות צלזיוס במשך הזמן המבוקש, הנע בין 30 דקות ל 2, 4 או 6 ח' המקננת במשך 4 שעות הוא הציע.</li>
	<li>לחשב את אמצעי האחסון הדרושים כדי להוסיף 25 µL של 5 מיקרומטר אטום דנ א לצבוע (ראה טבלה של חומרים), כדי להגיע ריכוז סופי של 1 מיקרומטר בבאר. להפוך predilution אם יש צורך RPMI 1640 בינוני המכיל 2% FCS ו- 10% P/S בריכוז 5 מיקרומטר.</li>
	<li>להוסיף 25 µL של 5 מיקרומטר אטום DNA צבע 15 דקות לפני תום זמן הדגירה. המשך הדגירה למשך עוד 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחושך.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע (~ 125 µL) היטב ולאחסן במידת הצורך. להוסיף 100 µL של 4% paraformaldehyde (PFA). גילינו ולהמשיך מיד בשלב 4.</li>
</ol>4. נטו ויזואליזציה עם Immunofluorescence גבוהה-תוכן, רזולוציה גבוהה 3D מיקרוסקופיה קונפוקלית
<ol><li>
קביעת ההגדרות במיקרוסקופ קונפוקלי immunofluorescence על ידי לחיצה על הגדרת רכישה.
	<ol>
<li>לחץ על הכרטיסיה קביעת תצורה .</li>
		<li>בחר את המטרה ואת המצלמה. לבחור המטרה X Apo למבדה 10 עם מצב רכישה של הקדמוניות מיקרומטר 60 קונפוקלי.</li>
		<li>לחץ על צלחת , בחר את הצלחת 96-ובכן פלסטיק. בחר את האתרים כדי לבקר ובחר מספר קבוע של אתרים. מלאו 3 עמודות ושורות 3 ללא חפיפה (0 מיקרומטר), אשר מכסים את סך של 45% של הבאר.</li>
		<li>לחץ על רכישה. בחר לאפשר התמקדות מבוססת לייזר. בחר לרכוש סדרות סדרות/שעה Z במידת הצורך.</li>
		<li>לחץ על אתר פוקוס אוטומטי.<ol>
<li>לחץ על המוקד על צלחת התחתון | את הגדר על ידי עובי התחתון. על הבאר הראשונית למצוא את הדגימה, לבחור את הבאר הראשונה רכשה. פוקוס אוטומטי אתר, בחר ' כל האתרים.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לחץ על אורכי גל.<ol>
<li>עבור המספר של אורכי גל, לבחור 2. TL הצללה תיקון עידון הרמה, לבחור 2.</li>
			<li>עבור גל 1, בחר טקסס אדום.<ol>
<li>עבור האפשרויות פוקוס אוטומטי, בחר לייזר עם Z היסט, פוסט לייזר היסט 1.1 מיקרומטר. שימוש Z-מחסנית עם מגוון המותאם אישית של 200-10.</li>
			</ol>
</li>
			<li>גל 2, בחר FITC.<ol>
<li>עבור האפשרויות פוקוס אוטומטי, בחר לייזר עם Z קיזוז מתוך w1 0 מיקרומטר. שימוש Z-מחסנית עם מגוון המותאם אישית של 200-10.</li>
				<li>עבור אפשרויות רכישה, בחר סדרת Z ו תמונה מוקרנת 2D המרבי. עבור אפשרויות רכישה, בחר תיקון הצללה | את.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>בחר סדרת Z. בחר את מספר שלבים: 10. בחר את גודל הצעד: 3 מ מ (טווח הכולל יהיה מיקרומטר 27).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לשים את הצלחת קונפוקלית immunofluorescence.
	<ol>
<li>לחץ על הכרטיסיה הפעל .<ol>
<li>למלא את הצלחת שם ותיאור ובחר מיקום האחסון.</li>
			<li>בחר הבארות שצריך לרכוש.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>בחר זמן החשיפה FITC, טקסס אדום.</li>
	<li>לחץ על צלחת לרכוש כדי להפעיל את הרכישה, אשר יעביר כ 1 h לכל צלחת.</li>
</ol>5. ניתוח של היווצרות נטו
<ol><li>להשתמש בתמונה עיבוד תוכנית שנועדה לצורך ניתוח מדעי תמונות רב-ממדי (ראה טבלה של חומרים) לנתח את היווצרות נטו.</li>
	<li>להעביר את נתוני התמונה נרכשת כונן קשיח נפרדים.</li>
	<li>
בחר את הצבע הוספת הכלי.
	<ol>
<li>בחר w1 ובחר את התיקיה בכונן הקשיח שבו הנתונים מאוחסנים.</li>
		<li>בחר w2 ובחר את התיקיה בכונן הקשיח שבו הנתונים מאוחסנים. הערה: להשתמש במאקרו סטנדרטית משתמשת w1 בשם הקובץ כדי להוסיף צבע אדום לתמונות טקסס אדום ומשתמש w2 להוסיף צבע ירוק התמונות FITC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
בחר ניתוח מאקרו.
	<ol>
<li>בחר w1, לבחור את ערך הסף (עוצמת מפתן), המהווה בדרך כלל 10. בחר את ערך הפיקסל הרצוי (גודל הסף, למשל, 100).</li>
		<li>בחר w2, לבחור את ערך הסף (עוצמת מפתן), המהווה בדרך כלל 10. בחר את ערך הפיקסל הרצוי (גודל הסף, למשל, 500).</li>
		<li>בחר את מיקום היעד עבור קובץ גיליון אלקטרוני, להפעיל ניתוח ולשמור קבצי יומן רישום לאחר מכן.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ניתוח נתונים בגיליון אלקטרוני.</li>
</ol>

<ol><li>Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+as+a+defence+against+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death as a defence against infection.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (3), 151-164 (2017).</li>
<li>Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+neutrophil+extracellular+traps+contribute+to+the+heightened+risk+of+thrombosis+in+inflammatory+diseases%3F%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases?</a> World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).</li>
<li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).</li>
<li>Garcia-Romo, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+are+major+inducers+of+type+I+IFN+production+in+pediatric+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils are major inducers of type I IFN production in pediatric systemic lupus erythematosus.</a> Science Translational Medicine. 3 (73), 73ra20(2011).</li>
<li>Lande, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+activate+plasmacytoid+dendritic+cells+by+releasing+self-DNA-peptide+complexes+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus.</a> Science Translational Medicine. 3 (73), 73ra19(2011).</li>
<li>Meng, H., Yalavarthi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Role+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Antiphospholipid+Antibody-Mediated+Venous+Thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">In Vivo Role of Neutrophil Extracellular Traps in Antiphospholipid Antibody-Mediated Venous Thrombosis.</a> Arthritis & Rheumatology. 69 (3), 655-667 (2017).</li>
<li>Desai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particles+of+different+sizes+and+shapes+induce+neutrophil+necroptosis+followed+by+the+release+of+neutrophil+extracellular+trap-like+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports+-+Nature%22%5BJournal%5D)">Particles of different sizes and shapes induce neutrophil necroptosis followed by the release of neutrophil extracellular trap-like chromatin.</a> Scientific Reports - Nature. 7 (1), 15003(2017).</li>
<li>Desai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PMA+and+crystal-induced+neutrophil+extracellular+trap+formation+involves+RIPK1-RIPK3-MLKL+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">PMA and crystal-induced neutrophil extracellular trap formation involves RIPK1-RIPK3-MLKL signaling.</a> European Journal of Immunology. 46 (1), 223-229 (2016).</li>
<li>Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neutrophil+extracellular+traps+in+rheumatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases.</a> Nature Reviews Rheumatology. , (2018).</li>
<li>Kraaij, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+high-throughput+detection+and+quantification+of+neutrophil+extracellular+traps+reveals+ROS-independent+NET+release+with+immune+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity+Reviews%22%5BJournal%5D)">A novel method for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps reveals ROS-independent NET release with immune complexes.</a> Autoimmunity Reviews. 15 (6), 577-584 (2016).</li>
<li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETosis+markers%3A+Quest+for+specific%2C+objective%2C+and+quantitative+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li>
<li>Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+quantification+of+in+vitro+NET+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Automatic quantification of in vitro NET formation.</a> Frontiers in Immunology. 3, 413(2012).</li>
<li>Nakazawa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+formation+and+disordered+regulation+of+NETs+in+myeloperoxidase-ANCA-associated+microscopic+polyangiitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Enhanced formation and disordered regulation of NETs in myeloperoxidase-ANCA-associated microscopic polyangiitis.</a> Journals of the American Society of Nephrology. 25 (5), 990-997 (2014).</li>
<li>Konig, M. F., Andrade, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Reappraisal+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+and+NETosis+Mimics+Based+on+Differential+Requirements+for+Protein+Citrullination%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A Critical Reappraisal of Neutrophil Extracellular Traps and NETosis Mimics Based on Differential Requirements for Protein Citrullination.</a> Frontiers in Immunology. 7, 461(2016).</li>
<li>Kenny, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+stimuli+engage+different+neutrophil+extracellular+trap+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+image-based+quantitative+method+for+the+characterization+of+NETosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis.</a> Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).</li>
<li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> The Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li>
<li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+neutrophil+extracellular+traps+in+various+organs+of+a+murine+sepsis+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of neutrophil extracellular traps in various organs of a murine sepsis model.</a> PLoS One. 9 (11), e111888(2014).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Cell Biology. 176 (2), 231-241 (2007).</li>
<li>von Köckritz-Blickwede, M., Chow, O., Nizet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+calf+serum+contains+heat-stable+nucleases+that+degrade+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps.</a> Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).</li>
<li>Kraaij, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excessive+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+ANCA-associated+vasculitis+is+independent+of+ANCA%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Excessive neutrophil extracellular trap formation in ANCA-associated vasculitis is independent of ANCA.</a> Kidney International. , (2018).</li>
<li>Kraaij, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NET-effect+of+combining+rituximab+with+belimumab+in+severe+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">The NET-effect of combining rituximab with belimumab in severe systemic lupus erythematosus.</a> Journal of Autoimmunity. , (2018).</li>
<li>Hahn, J., Schauer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregated+neutrophil+extracellular+traps+resolve+inflammation+by+proteolysis+of+cytokines+and+chemokines+and+protection+from+antiproteases%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Aggregated neutrophil extracellular traps resolve inflammation by proteolysis of cytokines and chemokines and protection from antiproteases.</a> The FASEB Journal. (Aug 21), (2018).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

החלק הקריטי ביותר של assay זו הוא הצורך להשתמש נויטרופילים טרי מבודדים עבור ניסוי כי נויטרופילים הם קצרי חיים ולא מתים כשהם קפואים. הדבר מחייב תורם בריא בכל פעם, אשר יכול לסבך וריאציות בשל מאפיינים התורם. אחת מהווריאציות האלה הוא מצב ההפעלה של נויטרופילים. נויטרופילים יכול להיות מופעל כבר ויוו לפני בידוד. בנוסף, נויטרופילים יכול להיות מופעל בכל השלבים בידוד ובפרט במהלך פירוק של אריתרוציטים, ולכן מטפל מנוסה של נויטרופילים נדרשת כדי למזער את ההפעלה של נויטרופילים. באופן כללי, בידוד של נויטרופילים צריכה להתבצע בהקדם האפשרי לאחר לקיחת דם, לא צריך אפשרות להשהות את הניסוי כדי למנוע הפעלת ספונטנית מוגזמת. שנית, יש להימנע טיפול אגרסיבי של נויטרופילים. ככזה, היתרון הבולט של הפרוטוקול המתואר הוא ההתערבות pipetting מינימלי, ברגע נויטרופילים הם נזרע בצלחת 96-ובכן. חשוב מכך, מצב ההפעלה של נויטרופילים מורה־הדרך בתנאי unstimulated, שבו ניתן assay הזה ברגישות לזהות רמות נמוכות של היווצרות נטו. גורם נוסף שיש בהם להשפיע וזמינותו הוא השימוש של FCS במדיום. האחוז של FCS הצטמצמה מ 10% ל-2% כדי למנוע הדיכוי אפשרי של היווצרות רשת על-ידי נוגד חמצון פעילות19,20 או את ההפעלה אפשרי של נויטרופילים למרות החום איון. תרבות ללא FCS או עם שימוש סוגים שונים של מדיה לא נוסה. פקד unstimulated או בינונית תמיד נלקחת לאורך בעת ביצוע וזמינותו יש אינדיקציה של האות הרקע (למשל, את מצב ההפעלה של נויטרופילים). העלייה הקיפול עבור כל גירוי לעומת הדגימה unstimulated מוצג כדי להשיג תוצאות עקביות על ניסויים שונים באמצעות הגירוי אותו.
גורם חשוב עבור רקע גבוה אפשרי מכתימה של דנ א חוץ-תאית, כי הוא קשור תהליך היווצרות נטו. וזמינותו הנוכחי מנסה להפחית את זה על-ידי הסרת חוץ-תאי DNA ההכתמה מיד לאחר תקופת דגירה קצרה של 15 דקות על ידי ניתוח הצלחת ישירות לאחר קיבוע. לכן, זה הכרחי להשתמש מיקרוסקופ קונפוקלי מתקדם בעל מספיק מהירות וכוח אנליטיות כדי ללכוד את הצלחת 96-ובכן בתוך 1-2 ח' אוטומטית הגדרה של זמן החשיפה, פוקוס מומלצת. ככזה, ההגדרה מיקרוסקופ יכול להשתנות בין כל מדגם ולהתנסות ביחס לסף עוצמת צבע אשר הכרחי לאיכות תמונה אופטימלית באופן כללי. ההשפעות האחרון בסופו של דבר היכולת לכמת בצורה נכונה נויטרופילים, רשתות, ההגדרה המיטבית ולכן צריך להיות מאושרות על ידי באמצעות שליטה במספר דגימות (למשל, סרום של פקדים בריא). במהלך הניתוח של תמונות שנתפסו, מאפשר השימוש של פיקסל הסף וכן גודל הסף בתוכנית ניתוח מבחר טוב של היווצרות נטו.
דנ א חוץ-תאית, נגזר מערך נטו יכול להיות התוצאה של מסלולים ברורים מוות, כולל NETosis, necroptosis, pyroptosis, ferroptosis או אפילו שאינו lytic תהליך היווצרות נטו חיוני1. ככזה, מגבלה של וזמינותו הנוכחי היא על ידי צביעת רק עבור דנ א חוץ-תאית שאין אין בידול אפשרי בין היווצרות נטו מסלולים אחרים של מוות התא הרלוונטי. ניתן להשיג זאת על-ידי שימוש גם מעכבי סלקטיבי של מסלולים ברורים מוות להפלות בין הצורות לגורם המרכזי עליו מושתתת היווצרות נטו או לאשר על-ידי immunostainings נפרד הנוכחות של סמנים נטו ספציפי, כגון citH3 ו- NE, שותף מקומי עם ה-DNA. לוקליזציה שיתוף של דנ א חוץ-תאית עם citH3 ו- NE לאחרונה אושרה הזה assay10. היתרון של הימנעות נטו סמני הספציפי הזה assay, מאפשר להעריך כל צורות היווצרות נטו המוביל ההבלטה של ה-DNA על ידי נויטרופילים כמו מלא ואובייקטיבי ככל האפשר עם הפוטנציאל של ההקרנה תפוקה גבוהה. תחולתה של פרוטוקול זה הוכח בלימוד נמוך אינדוקציה נטו רמת מתווכת על-ידי המערכת החיסונית מתחמי חיסון למחלה שבה היכולת לזהות הבדלים כמותיים יכול להיות חשוב יותר מאשר הסוג של תהליך מעורב10,21,22. ומציינת כי assay כימות נטו הרומן הזה יכול להיות בעל ערך מוסף לחוקרים שונים לחקור היבטים שונים של היווצרות נטו. שינויים קטנים וזמינותו מיושמים בקלות: התאמת תקופת גירוי, השימוש סמן נטו האהוב עליך להתמקד מוות מסוים אחד שביל שמוביל היווצרות נטו, השימוש הגדלה שונות או השימוש של קריטריונים שונים נטו ב כימות וניתוח.
לסיכום, פרוטוקול מסופק הוא מאוד רגיש assay בהרחבה ישימה עבור כימות חצי אוטומטיות של היווצרות נטו על ההערכה של ex-vivo אינדוקציה של רשתות על גירויים שונים.

היווצרות מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות) הוא תהליך שבו נויטרופילים משחררים את הדנ א שלהם ברשת חוץ-תאית תלת מימדי (3D) כמו מבנה, ומורכבת עם מגוון רחב של מולקולות מיקרוביאלית ומסוכן, פרטנית, אנזימים cytoplasmic, פפטידים וחלבונים. מבנים immunogenic רעילים אלה יש תפקיד פיזיולוגי ההגנה החיסונית מולדת של אנשים בריאים על ידי השמנה ואת להרוג פתוגנים זיהומיות1. עם זאת, הם גם הוכחו להיות מעורב פקקת2 ומחלות אוטואימוניות מערכתית שונות, כולל נויטרופילים נגד cytoplasmic נוגדנים (לימור קלו)-הקשורים וסקוליטיס (AAV)3, זאבת אדמנתית מערכתית (מירה כהן )4,5, תסמונת אנטי-פוספוליפידית (APS)2,6, דלקת מפרקים שגרונית (RA), פסוריאזיס, שיגדון7,8,9.
היווצרות נטו במבחנה נחקרה באופן נרחב עם phorbol תרכובת כימית פעילים-12 13-אצטט (PMA), אשר גורם היווצרות נטו מסיבית. עם זאת ביותר פיזיולוגיות לגירויים לגרום הרבה רמות נמוכות יותר של היווצרות נטו10. ללמוד נטו-מפעילים באווירה, לדוגמה, מחלות אוטואימוניות, וזמינותו כמותיים מתוקננת, רגיש, תפוקה גבוהה יש צורך לזהות ולכמת היווצרות נטו. כימות של רשתות הוכיחה להיות מאתגר, כיום מתבצע באמצעות שיטות שונות, כל אחד עם משלהם-יתרונות ומגבלות11. השיטה הנפוצה היא זיהוי ה-DNA supernatants12, אשר הוא אובייקטיבי אבל לא להפלות בין המקור של ה-DNA (אפופטוטיים להיפגע, נמק, רשתות), ולכן היא לא מאוד ספציפי עבור רשתות. שנית, מבחני מקושרים-אנזים immunosorbent (ELISAs) של ה-DNA-ומורכבת עם חלבונים ספציפיים נטו, לדוגמה, myeloperoxidase (MPO) או elastase נויטרופילים (NE), הן בגישה יותר ספציפי כדי לזהות רשתות והפגינו היו לתאם עם citrullinated היסטון-3 (CitH3) חיובי רשתות13. עם זאת, לא ידוע שיטה זו רגישים מספיק כדי לאסוף את כל רשתות (למשל, MPO, NE, ורשתות CitH3 שלילי). גישה שלישית היא מיקרוסקופ immunofluorescence המשמש לאיתור שותף לוקליזציה של NET-הקשורים מולקולות (NE, MPO, CitH3) עם דנ א חוץ-תאית לכמת רשתות. שיטה זו היא בדרך כלל ספציפי עבור רשתות, אבל זה לא יכול להיות מיושם כשיטה תפוקה גבוהה ואינה אובייקטיבית עקב הטיית הצופה. בנוסף, שיטה זו לא לקחת בחשבון MPO, NE-, רשתות CitH3-שלילי כי קיימים לעתים קרובות בהתאם ה14,בשימוש נטו-ההדק15. גישות cytometry זרימה לזהות רשתות דרך שונה קדימה/sideward פיזור (FSC/האס) המציין נפיחות של הגרעין ב- NET-טינג נויטרופילים16. שיטה זו לא לוקח בחשבון את צורות שונות של היווצרות נטו כי זוהו, אשר לא עשוי להיות כרוך נפיחות של הגרעין, כגון היווצרות נטו חיוני17. לבסוף, immunofluorescence קונפוקלית הוחל כדי להמחיש ולכמת היווצרות רשת על-ידי ישירות מכתים חוץ-תאי DNA עם צבע תא אטום זה כתמים דנ א חוץ-תאית12,18. באופן כללי, 5-10 שדות ובעוצמת ידנית בחרה, העריך, אשר מכסה 1-5% של כל טוב של 96-ובכן צלחת11,17. בחירה ידנית של תמונות הוא לא תמיד אובייקטיבית, נוטה הטיה ומושכת לא לניתוח תפוקה גבוהה. וזמינותו כימות NET אוטומטיים, תפוקה גבוהה פותחה לאחרונה, אשר עם תמונה 11% היטב באופן תלת-ממד כיסוי מיקרומטר 13 דרך מוערם Z immunofluorescence קונפוקלית, ובכך שמוביל טכניקה רגישה מאוד להעריך רשתות לעומת שיטות קונבנציונליות10. הדו ח הנוכחי מתאר את פרוטוקול האחרונה כדי לכמת את היווצרות נטו דרך assay אוטומטיות, רגישה מאוד באמצעות קונפוקלית 3D, אשר משיגה תחום שבעורך כולל של 45% מכל קידוח ומכסה מיקרומטר 27 דרך Z-במחסן. פרוטוקול זה מתאים לכמת, עם רגישות גבוהה, רמות נמוכות של היווצרות נטו באופן אובייקטיבי ובלתי מוטים באופן.

<table><tbody><tr><td>Aqua Sterile H2O</td><td>B. Braun, Melsungen, Germany</td><td>12604052</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FCS)</td><td>בודינקו, אלקמאר, הולנד</td><td></td><td>בשימוש בריכוזים גבוהים זה יכול לגרום להיווצרות NET</td></tr><tr><td>Ficoll 5.7% - amidotrizoaat 9% צפיפות 1.077 גרם/מ"ל</td><td>LUMC, ליידן, הולנד</td><td>97902861</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי אימונופלואורסצנטי</td><td>Image Xpress Micro Confocal (מכשירים מולקולריים, סאניווייל, קליפורניה, ארה"ב)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נטרול PBS (10x)</td><td>Gibco, Paisley, UK</td><td>70011-036</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין (p/s)</td><td>Gibco, Paisley, UK</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>פנול אדום ללא RPMI 1640 (1x)</td><td>Gibco, Paisley, UK</td><td>11835-063</td><td>אדום פנול יכול להפריע לאות האימונופלואורסצנטי</td></tr><tr><td>חוצץ פוספט Saline (PBS)</td><td>B. Braun, Melsungen, Germany</td><td>174628062</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 2 &mu; מקשר תאים פלואורסצנטיים M Red</td><td>Sigma Aldrich Saint-Louis, MO, ארה"ב</td><td>PKH26GL-1KT</td><td>PKH הם צבעים פלואורסצנטיים מוגנים בפטנט וטכנולוגיית תיוג תאים הקרויה על שם המגלה שלהם תוכנית פול קארל הורן</td></tr><tr><td>לניתוח תמונות מדעיות רב-ממדיות</td><td>ImageJ, ענף שירותי מחקר, המכון הלאומי לבריאות הנפש, בת'סדה, מרילנד, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium 1640 (1x)</td><td>Gibco, Paisley, UK</td><td>52400-025</td><td></td></tr><tr><td>Sytox ירוק 5 מ"מ צבע DNA אטום</td><td>Gibco, פייזלי, בריטניה</td><td>57020</td><td></td></tr><tr><td>כתם כחול טריפן 0.4%</td> <td>סיגמא אולדריץ', גרמניה</td><td>17942E</td><td></td></tr><tr><td>96 באר, שחור, תחתית שטוחה, צלחת מטופלת בתרבית</td><td>רקמות פלקון, ניו יורק, ארה"ב</td><td>353219</td><td></td></tr></tbody></table>

תפוקה גבוהה הנועד להעריך ולכמת את היווצרות נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות) הם immunogenic מבנים דנ א חוץ-תאית המופצות על ידי נויטרופילים על מגוון רחב של גורמים מפעילים. רשתות הוכחו לשמש מנגנון הגנה חשוב מארח מלכודות והורג מיקרואורגניזמים. מצד שני, הם היו מעורבים מגוון מחלות אוטואימוניות מערכתיות. הרשתות הן מבנים immunogenic רעילים שמכילים מאגר של autoantigens הרלוונטיים כולל נויטרופילים נגד cytoplasmic נוגדנים (לימור קלו)-הקשורים וסקוליטיס (AAV), זאבת אדמנתית מערכתית (מורן סלם). צורות שונות של רשתות יכולה להיגרם בהתאם הגירוי. הכמות של רשתות ניתן לכמת באמצעות טכניקות שונות כולל מדידת לשחרר דנ א supernatants, מדידת ה-DNA-ומורכבת עם נטו-מולקולות כמו myeloperoxidase (MPO) או elastase נויטרופילים (NE), מדידת הנוכחות של citrullinated שינויים היסטוניים על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, או זיהוי cytometric זרימה נטו-רכיבים אשר כולם כוללים תכונות שונות לגבי ירידה לפרטים, רגישות, אובייקטיביות וכמות שלהם. כאן הוא פרוטוקול לכמת ex-vivo נטו היווצרות בצורה מאוד רגיש, תפוקה גבוהה באמצעות קונפוקלית immunofluorescence תלת מימדי. פרוטוקול זה ניתן להחיל כדי לטפל שאלות מחקר שונים על היווצרות נטו והשפלה על בריאות ומחלה.

היווצרות מלכודת חוץ-תאית נויטרופילים (נטו) לכמת באופן תלת-ממד על-ידי לכימות דנ א חוץ-תאית מוכתם יותר מ-10 Z-חבילות עם 3 מרחק מיקרומטר החל המטוס מוקד היטב כל. על ידי מדידת השטח המצטבר, הרגישות של גדל assay (איור 1 א'). נויטרופילים מבודד יש טוהר רשע 98.7% עם סטיית תקן (SD) של 1.10% שנמדד בדגימות שונות 14 מ ומשום שונים. האחוז הממוצע של כדוריות דם אדומות הוא SD 1.1% ± 1.04% והוא האחוז הממוצע של monocytes 0.085% ± 0.17% SD (נתונים לא מוצג). השטח של נויטרופילים ויטראז'ים עם תמונה הם לכמת רק ב מישור מוקד כל היטב, אשר בהתאמה באופן משמעותי ספירת נויטרופילים סך כל היטב עם מקדם המתאם פירסון של 0.99 (מרווח הביטחון 95% [CI] 0.985-0.997, p &lt; 0.0001) (איור 1B). התוצאה נציג של כימות של נטו-צורה נויטרופילים מגורה עם 10% סרה AAV המטופלים או בינונית (MED) כפקד שלילי, המבוטא המצטבר באזור ה-DNA מוכתם חוץ-תאית Z מעל 10-במחסן לכל תמונה נויטרופילים (איור 1 C)-תמונות של נציג תמונות של נויטרופילים unstimulated (איור 2 א) ושל רשתות מגורה AAV נויטרופילים (איור 2B) מוצגים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59150/59150fig1.jpg"> איור 1: כימות של היווצרות נטו על ידי מדידת דנ א חוץ-תאית, ספירת נויטרופילים. (א) אזור מצטברת לכמת יותר מ-10 Z-חבילות עבור כל טוב עבור unstimulated נויטרופילים (MED), נויטרופילים מגורה עם 10% סרום של לימור קלו-הקשורים וסקוליטיס (AAV) חולים (n = 4) לכמתו תוכנית עיבוד תמונה. כל גירוי נבדקה שהפקידים, כל נקודה מייצג את הערך החציוני. ספירת אזור ותא אדום התאים שכותרתה פלורסנט (B) היו לכמת במישור המוקד של כל טוב על-ידי התוכנית עיבוד תמונה (R2 = 0.99, p &lt; 0.0001). היווצרות נטו (C) מתבטאת כאזור המצטבר לכל תמונה נויטרופילים (תא שטח). זאת אומרת ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM) של כל שהפקידים מותווים לכל גירוי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59150/59150fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59150/59150fig2.jpg"> איור 2: תמונות של כימות נטו assay. נויטרופילים שכותרתה פלורסנט מוצגים באדום, ויטראז'ים דנ א חוץ-תאית מוצג בצבע ירוק. 10 x לתכנן למדא Apo אובייקטיבי. (א) Unstimulated נויטרופילים. מגורה עם סרום AAV נויטרופילים (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59150/59150fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

פרוטוקול זה מתאר assay מלכודת חוץ-תאית נויטרופילים (נטו) של תפוקה רגיש מאוד, גבוהה עבור כימות חצי אוטומטיות של ex-vivo נטו היווצרות מאת immunofluorescence קונפוקלית תלת מימדי. פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי להעריך את היווצרות נטו והשפלה אחרי גירויים שונים והוא יכול לשמש כדי ללמוד טיפולים פוטנציאליים, ממוקדות נטו.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

פיתחנו מלכודות תפוקה גבוהה כדי למדוד מלכודות חוץ תאיות נויטרופילים, או NETs. NETs הם מבני דנ"א אימונוגניים שנחשפים על ידי נויטרופילים. NETs יכולים ללכוד ולהרוג מיקרואורגניזמים ולכן הם מנגנון אנטי זיהומיות חשוב, אבל הם גם ממלאים תפקיד פתוגניים במחלות אוטואימוניות.עם טכניקה זו, NETs הם כימות על ידי מיקרוסקופיה קונפוסל immunofluorescence תלת מימדי וכתוצאה מכך שיטה רגישה מאוד ותפוקה גבוהה ללמוד היווצרות נטו השפלה. טכניקה זו מאפשרת לנו לכמת היווצרות נטו של חולים עם מחלות אוטואימוניות. אקס ויוו נטו היווצרות של חולים עם דלקת כלי דם הקשורים ANCA או זאבת אדמתמטוזיס מערכתית יכול להיות במעקב עם הראיה זו.בנוסף, טיפולים פוטנציאליים מיקוד היווצרות נטו יכול להיבדק עם זה מבחן במבחנה. בידוד נויטרופילים יכול להיות מאבק עבור אנשים שמעולם לא ביצעו את הטכניקה הזו בעבר. כדי להתחיל בהליך זה, להשיג 20 מיליליטר של דם היקפי מתורם בריא בשני צינורות 10 מיליליטר מקודד EDTA.להעביר 10 מיליליטר של דם בצינור סטרילי 50 מיליליטר ו PBS לנפח הכולל הסופי 32.5 מיליליטר. באמצעות פיפסה 10 מיליליטר בקר פיפטה, לקחת 14 מיליליטר של שיפוע צפיפות. מניחים את הפיפסה בתחתית צינור ה-50 מיליליטר.לאחר מכן, לקחת את בקר פיפטה את פיפטה, המאפשר שיפוע הצפיפות לזרום החוצה על ידי כוח הכבידה עד המקסימום הוא הגיע על ידי אפקט נימי. מניחים אגודל על גבי פיפטה כדי למנוע את שיפוע הצפיפות הנותרת דולף החוצה, ולאחר מכן להסיר את פיפטה מהצינור. צנטריפוגה הצינור ב 912 פעמים g בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות ללא תאוצה או בלם.בזהירות להסיר את הטבעת הלבנה המכילה את התאים mononuclear הדם ההיקפי הראשון, בעקבות פלזמה מדולל PBS. לבסוף, הסר את שכבת מעבר הצבע של הצפיפות ככל האפשר. לאחר מכן, יש לאחזר ממקרר בקבוק מים מזוקקים סטריליים קרים ובקבוק PBS מרוכז פי 10.עובדים במהירות, מוסיפים 36 מיליליטר של המים ישירות על גבי גלולה ומערבבים בזהירות פעם אחת. לאחר 20 שניות שנספרו מההתחלה, להוסיף ארבעה מיליליטר של 10x PBS כדי להפוך פתרון איזוטוני. ושוב, מערבבים פעם בזהירות.צנטריפוגה הצינור ב 739 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. להשליך את supernatant, הקפד להיות זהיר מאוד כמו גלולה אינה מוצקה, במהירות לחזור על התהליך של הוספת מים מזוקקים סטריליים קרים PBS מרוכז כפי שתואר קודם לכן. צנטריפוגה ב 328 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.בזהירות להסיר את supernatant מחדש להשעות את גלולה בחמישה מיליליטר של PBS. לספור את הנויטרופילים ולשמור אותם על קרח. ראשית, לעשות השעיה נויטרופילים המכילים כ 10 עד 20 מיליון נויטרופילים בשני מיליליטר של PBS בצינור 15 מיליליטר.בצינור 15 מיליליטר אחר, מערבבים שני מיליליטר PBS עם ארבעה מיקרוליטרים של מקשר תא פלואורסצנטי אדום שני מיקרומולרי. מוסיפים בעדינות את פתרון מקשר התאים הפלורסנטיים האדום לתליית הנויטרופילים ומערבבים בזהירות. עוטפים את הצינור בנייר אלומיניום כדי להגן על התערובת מפני אור, ו דגירה בדיוק 25 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי לתייג את נויטרופילים עם מקשר תא פלואורסצנטי אדום.בטל את התיוג על-ידי הוספת מדיום RPMI 1640 המכיל FCS מושבת בחום של 10% בטמפרטורת החדר לנפח סופי של 15 מיליליטר ומערבבים פעם אחת בזהירות. אם אחרי זה גלולה נוצרה, בזהירות להשעות את התערובת. צנטריפוגה הצינור ב 328 פעמים גרם בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.לפני הסרת supernatant, ודא כי גלולה נוצרה. לאחר מכן, להשעות מחדש את גלולה בחמישה מיליליטר של אדום חינם RPMI 1640 בינוני המכיל 2% FCS בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לספור את נויטרופילים.הפוך מתלה תא בצפיפות של 420, 000 תאים למיליליטר ב פנול אדום חינם RPMI 1640 בינוני המכיל 2%FCS. הוסיפו 37, 500 נויטרופילים ב-90 מיקרוליטרים לכל באר של צלחת שחורה עם 96 באר, עם תחתית שטוחה. לאחר מכן, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של הגירוי הנבחר בטריפלקט כדי להגיע לריכוז של 10% בכל באר.תמיד לכלול שליטה שלילית ב- triplicate. דגירה בחושך ב 37 מעלות צלזיוס לזמן הרצוי, החל 30 דקות עד שתיים, ארבע, או שש שעות. לאחר מכן, הכינו את נפח צבע הדנ"א הבלתי חדיר הדרוש להוספת 25 מיקרוליטרים של צבע DNA אטום של חמישה מיקרומולרים כדי להגיע לריכוז סופי של מיקרומולר אחד בכל באר.15 דקות לפני תום זמן הדגירה, מוסיפים 25 מיקרוליטרים של צבע DNA בלתי חדיר של חמישה מיקרומולרים לכל באר. ממשיכים את הדגירה במשך 15 הדקות האחרונות ב-37 מעלות צלזיוס בחושך. לאחר מכן, להסיר את supernatant בזהירות רבה ולאחסן במידת הצורך.הוסף 100 מיקרוליטרים של 4% פרפורמלדהיד. שמור את הצלחת בחושך, ומיד להמשיך לקטע הבא. לאחר קביעת התצורה של ההגדרות, בחר סידרת Z.בחר 10 כמספר השלבים. בחר שלושה מיקרומטרים כגודל הצעד. טען את הצלחת לתוך מיקרוסקופ קונפוסל שפעת האימונו.לחץ על הכרטיסיה הפעלה. מלא את השם והתיאור של הלוח ובחר את מיקום האחסון. בחר את בארות שיש לרכוש.בחר את זמן החשיפה עבור טקסס רד ו- FITC. לאחר מכן, לחץ על צלחת רכישה ולהתחיל את הרכישה, אשר ייקח כשעה לכל צלחת. לאחר מכן, בחר ניתוח מאקרו.לאחר מכן בחרו w1 ובחרו בערך הסף. לאחר מכן, בחרו בערך הפיקסל הרצוי. ולבסוף, בחלון תמונה J שני, בחר w2 ובחר את ערך הסף עם ערך הפיקסל הרצוי.בחר יעד עבור קובץ הגיליון האלקטרוני, הפעל את הניתוח ושמור את קובץ יומן הרישום לאחר מכן. מוצג כאן הוא רגיש מאוד נרחב ישים assay עבור כימות אוטומטי למחצה של היווצרות מלכודת נויטרופילים חוץ תאיים להערכת אקס ויוו אינדוקציה של מלכודות נויטרופילים חוץ תאיים על גירויים שונים. היווצרות NET מכומתת באופן תלת מימדי על ידי כימות דנ"א חוץ-תאי מוכתם מעל 10 ערימות Z עם מרחק של שלושה מיקרומטרים החל במישור המוקד בכל באר.על ידי מדידת השטח המצטבר, הרגישות של ההתרגם גוברת. השטח הכולל של נויטרופילים מוכתמים בתמונה מכומתים רק במישור המוקד בכל באר אשר בקורלציה משמעותית עם ספירת נויטרופילים הכוללת בכל באר עם מקדם מתאם פירסון של 0.99. התוצאה הייצוגית של כימות היווצרות NET בנויטרופילים באה לידי ביטוי כאזור דנ"א חוץ-תאי מוכתם במצטבר מעל 10 ערימות Z לכל נויטרופילים בתמונה.לאחר מכן נלקחות תמונות של מחש כימות הרשת. תמונות מייצגות של נויטרופילים לא מבודדים ו- NETs בנויטרופילים מגורים AAV מוצגים כאן עם נויטרופילים בעלי תווית פלואורסצנטיים באדום והדנ"א החוץ-תאי המוכתם בירוק. יש לטפל בנויטרופילים בזהירות, ויש לבצע את תיוג ה- PKH בדיוק בהתאם לפרוטוקול.ניתן להשתמש במבחן זה כדי ללמוד מורפולוגיה, קינטיקה, והרכב של NETs. טכניקה זו היא שיטה נוספת המספקת את האפשרות ללמוד NETs בבריאות ומחלות. טריפאן כחול, PKH, ו PFA צריך להיות מטופלים עם כפפות ולא צריך לנשום ישירות.

a-high-throughput-assay-to-assess-quantify-neutrophil-extracellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים טכניקה במבחנה ליצירת ובידוד מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs). נויטרופילים מבודדים מדם היקפי ומעוררים באמצעות phorbol myristate acetate (PMA) כדי לייצר NETs. במהלך הדגירה, הנויטרופילים עוברים תהליך של מוות תאי (NETosis) כדי לשחרר NETs המורכבים מכרומטין מעובה מעורבב עם חלבונים ציטופלזמיים גרגיריים.

טכניקת מבחנה ליצירת מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות אנושיות

סרטון זה מדגים את ההשראות וההדמיה של מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות או NETs בנויטרופילים מסומנים מראש באמצעות נסיוב מטופלים המכיל נוגדנים ציטופלזמיים אנטי-נויטרופילים. יתר על כן, שימוש בצבע DNA בלתי חדיר ומיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשר הדמיה של NETs.

אינדוקציה והדמיה של מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים בנויטרופילים שסומנו מראש

מוצגים מבחני תפוקה גבוהים המספקים בשילוב כלים מצוינים לכימות שחרור NET מנויטרופילים אנושיים.

מדידת תפוקה גבוהה של שחרור DNA תאי והיווצרות NET כמוני נויטרופילים האנוש<em&gt; במבחנה</em

מלכודות תאי נויטרופילים (נטס) הן רשתות של DNA, ההיסטונים וחלבונים נויטרופילים. למרות מרכיב של התגובה החיסונית המולדת, רשתות מעורבות אוטואימוניות פקק. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה עבור בידוד נויטרופילים כלבי וכימות של רשתות באמצעות assay קרינת microplate.

ואלקטרופורזיס פשוט עבור כימות של שחרור מלכודת לכלבים נויטרופילים תאיים

אנו מתארים שיטות כדי לבודד את הכלבים נויטרופילים של דם מלא, להמחיש את NET-צורה נויטרופילים בשידור חי באמצעות מיקרוסקופ זריחה. גם המתוארים הם פרוטוקולים לכמת היווצרות נטו, citrullinated היסטון H3 (citH3) ביטוי באמצעות מיקרוסקופ immunofluorescence.

במבחנה מבנה הכלבי נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית: דינמי וניתוח כמותי על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפקת נויטרופילים מלכודות (רשתות) ו-NETQUANT הפעלה, תוכנה אוטומטית לחלוטין לכמת של רשתות בתמונות immunofluorescence.

הדמית מבוססת תמונה אוטומטית של מלכודות נויטרופילים באמצעות NETQUANT

פרוטוקול זה כולל סדרה של בדיקות פונקציונליות נויטרופילים שישמשו כשיטת סינון לכיסוי פונקציות ממסלולי איתות שונים. הפרוטוקול כולל הערכה ראשונית ופשוטה של כדאיות התא, טוהר, ייצור מיני חמצן תגובתי, נדידה בזמן אמת, פגוציטוזה, והצעה ראשונית של מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים.

סדרה של טכניקות סינון לסקירה מהירה של פונקציית נויטרופיל

אנו מציגים שיטה אוטומטית בעלת תפוקה גבוהה לכימות מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) באמצעות מערכת ניתוח תאים חיים, יחד עם גישת צבע כפול תלוית חדירות ממברנה.

טכניקת תפוקה גבוהה בזמן אמת לכימות היווצרות מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים בנויטרופילים אנושיים

פרוטוקול מוגדר זה מתאר גישת מיקרוסקופיה בתפוקה גבוהה בזמן אמת כדי להמחיש ולכמת שחרור מלכודת נויטרופילים חוץ-תאית אנושית (NET) במבחנה. השיטה הניתנת לשחזור מאפשרת לחקור את המאפיינים והקינטיקה של שחרור NET בעת גירוי עם משפרי NETosis מובהקים ומאפשרת הערכה של הפרמקולוגיה של אנטגוניסטים של NETosis.

כימות מיקרוסקופי בזמן אמת בתפוקה גבוהה של שחרור מלכודת נויטרופילים חוץ-תאית אנושית והערכת הפרמקולוגיה של אנטגוניסטים

מלכודות תאי נויטרופילים (NETS) הן מנגנון חשוב החיסון המולדת להילחם חיידקים פתוגניים, פטריות וטפילים. כאן אנו מתארים שיטות לבודד גרנולוציטים נויטרופילים מהדם האנושי כדי להפעיל אותם בצורה הרשתות. אנו מציגים טכניקות הכנה לדמיין הרשתות מיקרוסקופ אור אלקטרונים.

מלכודות תאי נויטרופילים: כיצד ליצור מדמיינים אותם

למד שיטה רגישה להערכת היווצרות נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית (NETs) באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקל תלת-ממדית. פרוטוקול זה מאפשר מחקר מדויק של מנגנוני מחלות אוטואימוניות ופיתוח טיפולים מכוונים.

תפוקה גבוהה הנועד להעריך ולכמת את היווצרות נויטרופילים מלכודת חוץ-תאית

גלה סרטונים נוספים