מנותקת עלה assays לפשט גנים ביטוי לימודי תפוחי אדמה במהלך התפשטות על ידי לעיסת חרק manduca סקסטה
15 במאי 2019
השיטה המוצגת יוצרת הרביוור טבעי הנזק רקמת הצמח באמצעות היישום של מנדוקה הזחלים סקסטה להתנתק עלים של תפוחי אדמה. רקמת הצמח הוא הבעה ביטוי של שישה שעתוק גורם הומויומני מעורב בתגובות מוקדמות לחרקים העשב.
פרוטוקול זה משתמש בגישה יעילה למדידת ביטוי גנים צמחיים בתגובה לרבי חרקים. על ידי שימוש בעלים מנותקים מבודדים בצלחות פטרי, החרקים קלים יותר ליישם ולנטר במהלך התקופה הקצרה יחסית של התפשטות לתרום נתוני ביטוי גנים להתרבות. פרוטוקול זה עשוי להיות מותאם אינטראקציות צמחים / חרקים רבים.
אם תצפיות בסיסיות של מערכות צמחים שלמות נחשבות. האופי הבלתי צפוי של האכלת חרקים יכול להיות מאתגר. לכן, אספקה אמינה של זחלים מבוימים כראוי וצמחים בריאים מספקים את הסיכוי הטוב ביותר להצלחה.
לדמיין כיצד צמחים וחרקים בריאים צריכים להופיע ולהתנהג הוא אינסטרומנטלי להשגת תוצאות אופטימליות במיוחד עבור חוקרים חדשים בתחום המחקר. הפגנת ההליך איתי תהיה פרנסס פרז, ביולוגית מולקולרית בשיפור גנטי של מעבדת פירות וירקות. כדי להכין צמחים תפוחי אדמה תרבות רקמות מופץ nodal, תחילה להשיג plantlets Kennebec גדל מחומר explant עם לפחות שלושה עד ארבעה צמתים.
השתמש בלהב סטרילי כדי להסיר את העלים חיתוך הענפים קרוב לגזע הראשי ולהשאיר כשני מילימטרים של רקמת ענף לכל עלה. חותכים כשני מילימטרים מעל ומתחת לכל צומת כדי להסיר את החלקים nodal מן הגבעולים ולסדר את חתכים nodal בכלי תרבות רקמה סטרילית המכיל מדיום העברה nodal עם הענף מצביע למעלה. לאחר מכן להעביר את גזירה nodal לתא תרבות רקמת הצמח במשך שבועיים עד שלושה שבועות של צמיחה ב 24 מעלות צלזיוס ותהוכת צילום כהה אור 16 שעות, שמונה שעות.
כדי להכין את החרקים להאכלה, להשיג את שלב הזחל הרצוי של M.sexta ולהעביר זחל אחד לתוך כל באר של כלי בלימה מתאים בהתאם לגודל הזחל. הפוך תבניות מיקום עבור כל נקודת זמן קציר באמצעות חמישה מגשים חסון מסוגל להחזיק קבוצה של שש מנות פטרי בגודל מתאים מרופד נייר לבן. עקוב אחר קבוצה של שישה עיגולים באמצעות צלחת פטרי בגודל מתאים על הנייר בכל מגש ולתייג קבוצה אחת של עיגולים לשלוט A, B, ו- C והשני שורץ A, B, ו C.Then תווית כל תבנית מיקום עם זמן הקציר המתאים.
לאחר מכן, סמן צינור מיקרוצנטריפוגה אחד של 1.7 מיליליטר עבור כל עיגול בתבנית המיקום כדי לזהות כראוי את ההטרדה, אות שכפול הצמח ונקודת הזמן של הקציר. כאשר כל הצינורות תויגו, מניחים דיסק נייר מסנן סטרילי לתוך צלחת פטרי אחת לכל תבנית להרים את הדיסקים עם מים סטריליים מבלי לתת בריכה נוזלית עודפת בכל מנה. לאחר מכן מניחים מנה אחת בכל עיגול בכל תבנית מיקום ומ מניחים שלושה צמחי תפוחי אדמה באותו גיל וגודל יחסי ליד כל תבנית מיקום.
כדי ליזום את התפשטות, להשתמש במספריים סטריליים כדי להסיר את שני העלים התואמים בגודל העליון מכל צמח ולמקום עלה אחד בצלחת פטרי שליטה ואחד בצלחת פטרי שורץ עבור כל צמח מהר ככל האפשר. כאשר כל העלים הונחו, השתמש במקלות מגע רכות כדי להעביר לפחות זחל אחד לכל מנה שורצת מהר ככל האפשר ולהגדיר את שעון הזמן לזמן התפשטות הרצוי. שימו לב להאכלה כדי לוודא שכל הזחלים אוכלים, ומחליפים כל זחל שאינו מאכיל לפי הצורך.
מוציאים את כל הזחלים מכל העלים בסוף זמן ההתפשטות ומתחילים את שעון הזמן לקציר. בסוף כל נקודת זמן קציר, להעביר כל עלה לתוך הצינור המתאים מיד להפיל את הצינור לתוך חנקן נוזלי להקפיא את דגימת העלה לפני אחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס עד בידוד RNA. זחלים מבוימים בריאים צריכים להתחיל להאכיל מיד לאחר המיקום על פני העלה ואת האכלה צריך להמשיך באופן עקבי למדי לאורך כל תקופת זמן התפשטות.
הזחל בתחתית עלה זה לא צרך שום חומר צמחי והוא דוגמה להתפשטות לא מוצלחת. עלים אלה נותקו מצמחים בת שבועיים של נודל שהתרבו רקמות ונצרכו בשיעורים שונים וסגנונות הזנה לכל שלב זחל. בהתבסס על תוצאות אלה, זחלי instar הרביעי נבחרו כדי להעריך עוד יותר את הנזק עלים עבור אדמה בוגרת יותר גדל צמחי תפוחי אדמה כי יותר קרוב שדה גדל צמחי תפוחי אדמה.
במחקרים אלה ביטוי גנים, שני גורמי שעתוק אצבע אבץ C2H2 חדשים כי הם מגיבים גם M.sexta herbivory זוהו התומכים בשימוש בעלים מנותקים עבור מיסטי התפשטות. זכור להשתמש בעלים תואמי גיל וגודל וללבות כראוי את הזחלים עבור כל ניסוי, כתוצאה מתוצאות אחידות בנתונים ניתנים לשחזור יותר. ניתן להתביג רקמות עלים עבור מיני חמצן תגובתי עם לחץ ונגזרות הורמון חומצה יסמונית.
תעתיק שלם, פרוטאום, או מחקרים מיקרוביום יכול להתבצע גם על רקמות העלה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה משתמש בגישה יעילה למדידת ביטוי גנים בצמחים בתגובה למשראי חרקים. על ידי החלת זחלי Manduca sexta על עלי תפוח אדמה מנותקים, חוקרים יכולים לנטר בקלות את השפעות המשראי על ביטוי הגנים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה של צמחים
- אינטראקציות בין חרקים לצמחים
- ניתוח ביטוי גנים
רקע
- פגיעה על ידי חרקים אוכלי-צמחים משפיעה באופן משמעותי על בריאות הצמח ועל התפתחותו.
- הבנת תגובות הצמח לפגיעה על ידי חרקים היא קריטית עבור פרקטיקות חקלאיות.
- שיטות מסורתיות לחקר אינטראקציות אלו עשויות להיות מורכבות ומשתנות.
- בדיקות של עלים מנותקים מספקות סביבה מבוקרת לניסויים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה להערכת ביטוי גנים בצמחים בתגובה לפגיעה על ידי רב-מרב (herbivory).
- סיוע בחקר אינטראקציות שונות בין צמחים לחרקים.
- שיפור השחזוריות של נתוני ביטוי גנים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- החלת זחלי Manduca sexta על עלי תפוח אדמה מנותקים.
- בידוד העלים בצלחות פטרי לצורך תצפית מבוקרת.
- ניטור התנהגות ההאכלה של החרקים במהלך הבדיקה.
- בדיקת ביטוי של הומולוגים של גורמי שעתוק.
תוצאות עיקריות
- יישום מוצלח של זחליים מוביל לשינויים מדידים בביטוי גנים.
- נותח ביטוי של שישה הומולוגים של גורמי שעתוק.
- הנתונים תומכים ביכולת השחזור וההתאמה של השיטה.
- הממצאים תורמים להבנת תגובות צמחים לעשבונייה (herbivory).
מסקנות
- הפרוטוקול מספק מסגרת מהימנה לחקר תגובות צמחים לעשבים של חרקים.
- ניתן להתאמה לאינטראקציות שונות בין צמחים לחרקים באמצעות בקרות מתאימות.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על שיטה זו כדי לבחון השפעות אקולוגיות רחבות יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקות בעלי עלה מנותקות מפחיתות את השונות הביולוגית במחקרי אינטראקציה בין צמחים לחרקים, ובכך מאפשרות קבלת נתוני ביטוי גנים בעלי הדירות גבוהה יותר לצורך תיקוף מטרות בביוטכנולוגיה חקלאית. גישה יעילה זו תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים של נתיבי תגובה לעשביה על ידי בידוד אירועי העברת אותות מוקדמים במערכת מבוקרת וניתנת להרחבה. השיטה משפרת את הביטחון החיזוי בזיהוי גורמי שעתוק וצמתי אותות הרלוונטיים לפיתוח תכונות להגנת גידולים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של תגובות שעתוק להרשמה של חרקים לועסים, ובכך תומך בתיקוף פונקציונלי של גנים מועמדים כגון גורמי שעתוק מסוג C2H2 zinc finger.
- ערך תפעולי: מפשט את זרימת העבודה הניסוית על ידי ניתוק העלים לפני ההדבקה, דבר המקטין את דרישות השטח ומגדיל את התפוקה לסריקת יעדים.
- ערך אסטרטגי: מקל על בדיקת היפותזות במסלולי הגנה של צמחים, ובכך מסייע בתיעדוף תכונות עבור תהליכי שיפור גידולים חקלאיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק פלטפורמה סטנדרטית לכימות שינויים בביטוי גנים בתגובה להפרעות מוגדרות של עשבונייה.
- ערך תפעולי: עושה שימוש בהגבלה של עלים בתוך צלח Petri כדי להבטיח הדירות וקלות בניטור התנהגות ההזנה של הזחלים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר התאמה למערכות שונות של צמח-חרק, ובכך תומך ביישומיות רחבה בתוכניות לגילוי תכונות ובמחקרים אגרוכימיים.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- ערך מדעי: תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לניתוח של סמני עקה כגון reactive oxygen species ונגזרות של jasmonic acid.
- ערך תפעולי: מאפשר פרופיל של הטרנסקריפטום, הפרוטואום או המיקרוביום של רקמות עלים, ובכך משפר את האינטגרציה של multi-omics בהערכת תכונות.
- ערך אסטרטגי: מחזק את הרציפות התרגומית (translational continuity) על ידי קישור תגובות מוקדמות של ביטוי גנים לתוצאות פנוטיפיות בעמידות להרבivorous.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
בדיקת העלה המופרד משתלבת בשלב הביולוגיה הגילויית, ומאפשרת בדיקת השערות בשלבים מוקדמים והבהרת מסלולים לפני המעבר לזיהוי מובילים בפיתוח תכונות של גידולים חקלאיים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות של מסלולי איתות המושרים על ידי עשבונייה ומבהירה את תפקידיהם של גורמי שעתוק בתגובות הגנה מוקדמות.
- סריקה: מספקת מוכנות למבחן באמצעות הכנה סטנדרטית של עלים ותנאי הדברה מבוקרים, מה שמבטיח תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור.
- אנליטיקה: מייצרת נתוני ביטוי גנים המאפשרים השוואה בין תנאי הדברה לתנאי ביקורת, ובכך מאפשרת הערכה סטטיסטית של השפעות הטיפול.
- מחקר תרגומי: מקשרת להמשכיות פרה-קלינית על ידי מתן אפשרות לניתוח נגזרות הורמונליות וסממנים של עקה חמצונית הקשורים לעמידות פנוטיפית.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר במגוון אינטראקציות בין צמחים לחרקים, ובכך מפחיתה עלויות פיתוח מחדש בתוכניות לגילוי תכונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת רעשים הנובעים משונות של הצמח השלם והתמקדות באיתות עצמאי של העלה.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והיכולת להרחבה (scalability) באמצעות תהליך מפושט של ניתוק העלה ופורמט בדיקה מבוסס פטרי.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות מסוג go/no-go בפיתוח תכונות על ידי אספקת נתונים אמינים וניתנים לשחזור על תגובות הגנה מוקדמות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעודוף של גנים מועמדים מותאם סיכון, בהסתמך על דפוסי ביטוי עקביים בתגובה לעשבון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות רקמות צמחים, שלבי התפתחות זחליים וטכניקות לבידוד RNA.
- תלוי במכשור סטרילי, תאי גידול מבוקרים ותשתית לשימור RNA (חנקן נוזלי, אחסון ב-80°C-).
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לגבי גיל העלה, גודלו ובחירת שלב הזחל (instar) כדי להבטיח אחידות ניסויית.
- דורש שיקולי התאמה בעת הרחבה למינים שונים של צמחים או לחרקים צומחים בעלי התנהגויות הזנה משתנות.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך בזחלים בריאים ובשלב התפתחותי אחיד, וניטור קפדני לאישור הזנה עקבית לאורך תקופת הבדיקה.
