Name: מנותקת עלה assays לפשט גנים ביטוי לימודי תפוחי אדמה במהלך התפשטות על ידי לעיסת חרק manduca סקסטה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: למדו שיטה פשוטה למדידת ביטוי גנים בתפוחי אדמה בתגובה ללעיסת חרקים באמצעות עלים מנותקים וזחלי Manduca sexta. הפרוטוקול מאפשר ניטור מבוקר של השפעת הרבייה על ביטוי גנים ומספק נתונים ברי-השוואה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות בוב Farrar ואלקסיס פארק עבור מתן חרקים המשמשים במחקר זה ועבור המומחיות שלהם בזחל הזמני. תודות למייקל בלקברן ולסקאט גוש לסקירה קריטית של כתב היד.
ציון שמות המסחר או מוצרים מסחריים בפרסום זה מיועד אך ורק לצורך מתן מידע ספציפי ואינו מעיד על המלצה או אישור על ידי משרד החקלאות של ארצות הברית.
משרד החקלאות הוא ספק הזדמנויות שוות ומעסיק.

הערה: הפרוטוקול הבא מיועד להגדרה של אדם אחד, לבצע תצפיות ולאסוף דגימות. ניתן לשלב רצפים מרובים של אותה התקנה כדי להגביר את השכפול הביולוגי. כל חזרות נוספות של הניסוי יש להגדיר באותו זמן ביום כדי למנוע השפעות יומי אפשרי על הביטוי גנים. הפרוטוקול נועד ליצור 3 "שורץ" עלים עבור 5 נקודות זמן הקציר נפרד. שליטה בהתאמה עוזב עבור כל נקודת זמן ליצור סך של 30 דגימות. ניתן לבצע את הניסוי במגוון גדלים של עלים ושלבי זחל, אך מומלץ כי גודל העלה, הזחל וזמן התפשטות יהיו עקביים במהלך התהליך.
1. הכנת צמחי תפוחי אדמה
הערה: יש לבצע את כל השלבים המחייבים טכניקה סטרילית במכסה של תרבות הרקמה18,19.
<ol><li>בסדר.<ol>
<li>הכן אמצעי הפצה.<ol>
<li>הוסף 4.43 g של מורראשיג ו Skoog (MS) עם אבקת ויטמינים, 20 גרם של סוכרוז ו 2 גרם של אגר תחליף 1 L של אוסמוזה הפוכה (RO)-מים מטוהרים ב 2 L בקבוקון עם פס ספין. העבר בקבוקון לצלחת מהומה לערבב. להתאים את ה-pH ל 5.8 באמצעות NaOH תוך המשך לערבב. הערה: אגר לא יימס עד לתיקון האוטוקלפה.</li>
			<li>הוסף 1 מ ל של חומר משמר/ביוסייד ואוטוקלב על מחזור נוזלי עבור 20 דקות (121 ° c, 101.3 kPa). להסיר בינוני מ אוטוקלב מיד לאחר המחזור הוא סיים ולצנן אותו 50 ° c. העברת 100 mL של בינונית הפצה סטרילית ומקורר לכלי תרבות סטרילית (למשל, מגנטה או פלנטקון) באמצעות טכניקה סטרילית במכסה של תרבות רקמה.</li>
		</ol>
</li>
		<li>. הכן את חומר ההסבר<ol>
<li>להשיג את מקור ההסבר כמו תפוחי אדמה הזרע קנאני ולהסיר את כל העקבות של הקרקע על ידי כביסה עם ברז H2O. להסיר נבטי לחתוך לתוך 2 ס מ חתיכות עם אזמל סטרילי.</li>
			<li>לחטא את חתיכות נבט על ידי הטבילה עבור 15 s ב 70% אתנול, ואחריו 13 דקות ב 1:1 אקונומיקה (1 חלק RO-מים: 1 חלק מרוכז מרוכזת germרידקים/מסחרי כיתה אקונומיקה). לשטוף 5 פעמים ב-H סטרילי2O.</li>
			<li>העברת חומר לחקור את כלי התרבות רקמה סטרילית עם בינוני התפשטות במכסה התרבות רקמה באמצעות טכניקה סטרילית. העברת ספינות לחדר התרבות רקמת הצמח ולגדול עבור 2 \ u20123 שבועות או עד הטופס שתילי ב 24 ° c, 16 h אור (140 μ:00 m-2· s-1)/8 h photoperiod כהה.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>הכינו מפעלי תפוחי אדמה מעור.<ol>
<li>הכן מדיום העברה קטרי. הערה: זה יהיה 10 כלי התרבות רקמה אשר עשוי לשמש באותו יום או עשוי להיות מראש הזמן ומאוחסן ב 4 ° c עד העברה קטרי.<ol>
<li>הוסף 36.43 g של תערובת מזינים אגר ל 1 L של המים RO-מטוהרים ב 2 L בקבוקון עם פס ספין. העבר בקבוקון לצלחת מהומה לערבב. להתאים את ה-pH ל 5.8 באמצעות KOH תוך המשך לערבב. הערה: אגר לא יימס עד לתיקון האוטוקלפה.</li>
			<li>אוטוקלב על מחזור נוזלי עבור 20 דקות (121 ° c, 101.3 kPa). להסיר בינוני מ אוטוקלב מיד לאחר המחזור הוא סיים ולצנן אותו 50 ° c. העברת 100 mL של בינוני סטרילי מקורר קטרי מדיום כלי התרבות סטרילי (לראות את הטבלה של חומרים) באמצעות טכניקה סטרילית בשכונה תרבות רקמה.</li>
		</ol>
</li>
		<li>להכין גזרי קטרי.<ol>
<li>להשיג שתילי קנאני גדל מחומר ההסבר (המיוצר בשלב 1.1.2). שתילי צריכה להיות לפחות 3 עד 4 צמתים (נקודות הסתעפות). להסיר עלים באמצעות מספריים סטרילי או אזמל. חותכים ענפים קרוב הגבעול הראשי, עוזב כ 2 מ"מ של רקמת הענף.</li>
			<li>הסר סעיפים קטרי מן הגבעול על ידי חיתוך כ 2 מ"מ מעל ומתחת לכל נקודת הסתעפות או צומת. לסדר גזרי קטרי בספינה סטרילית תרבות רקמה המכילה קטרי בינונית העברה (המיוצר בשלב 1.2.1.2) באותו כיוון כמו בכלי הקודם (הענף מצביע למעלה).</li>
			<li>העברת ספינות עם גזרי קטרי לחדר התרבות רקמת הצמח ולצמוח עבור 2 \ u20123 שבועות ב 24 ° c, 16 h אור (140 μ:00 m-2· s-1)/8 h photoperiod כהה. הערה: כל חיתוך קטרי יגדל לתוך שתילי חדש. מספר גזרי בכל כלי קובע את גודל העלה. גזרי פחות הועברו לכל ספינה תגרום עלים גדולים. שלושה צמחים לכל כלי יהיה 15 מ"מ x 20 מ"מ עלים ב 2 \ u20123 שבועות.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>אופציונלי הכינו את צמחי תפוחי האדמה. הגדולים בקנאלה הערה: כדי לייצר עלים גדולים יותר, ניתן להעביר שתילי תפוחי אדמה לקרקע.<ol>
<li>העברת שתילי תפוחי אדמה גדל בינוני העברה קטרי לקרקע על ידי משיכת בעדינות את הצמח מן המדיום עד כל רקמת השורש משתחרר אגר.</li>
		<li>העברה לאדמה בדיוק מעל הצומת הראשון מהשורש ובקלות לארוז את הקרקע סביב ההשתלה. המים בעדינות כדי להבטיח מגע הקרקע עם מערכת השורש.</li>
		<li>מקום בחדר הגידול עם האור 16 h (140 μ:00 m-2· s-1)/8 h photoperiod כהה ו 25/20 ° c יום/לילה טמפרטורות. הערה: הצמחים מוכנים כאשר שני עלים מורחבים למעלה לגמרי הגיעו לגודל המתאים לצורך הצורך.</li>
	</ol></li>
	<li>אופציונלי הכינו צמחי תפוח אדמה מגודלים. הערה: צמחי תפוחי אדמה הגדלים מפקעות הינם גדולים יותר וחזקים יותר ויכולים להיות שימושיים אם הזחלים של גידול על צמחים או אם יש צורך בהאכלת הזחל לילה.<ol>
<li>המקום פקעת תפוח אדמה 6 עמוק בתוך 10 בסיר המכיל תערובת הקרקע בתוספת עם 10 מ"ל מרחוק דשן שחרור איטי.</li>
		<li>מקום בחדר הגידול עם האור 16 h (140 μ:00 m-2· s-1)/8 h photoperiod כהה ו 25/20 ° c יום/לילה טמפרטורה. הצמחים מוכנים כ 30 \ u201240 ימים מנטיעת פקעת. הערה: אין להשתמש בצמחים שהחלו פרח.</li>
	</ol></li>
</ol>2. הכנת חרקים להזנה
<ol><li>להשיג את הזחל הרצוי השלב של M. סקסטה. הערה: הזחלים למחקר זה הוגדלו על תזונה מלאכותית באמצעות המבנה החמישי20 ומבוים על ידי אדם מנוסה מתוך הבית הזחלים. הזחלים יכולים גם להיות מתרומם באופן חלקי או לגמרי על רקמת הצמח. הזחלים לא אוכלים מיד לפני נשירה וסביר ביותר לאכול מיד אחרי נשירה, כך ההיערכות המתאימה היא חשובה21.</li>
	<li>העברת הזחלים לכלי בלימה מתאים (למשל, 6-, 12, 24-היטב העור הצלחת הרקמה) בהתאם לגודל זחל. צריך להיות זחל אחד לבאר בצלחת. הערה: הזחלים יכולים להציג התנהגות טריטוריאלית או קניבאלי ללא מקור מזון ועלול להיפגע אם שוכנו יחד.</li>
	<li>אופציונלי הזחלים מרעיבות עד 2 מעלות כמו זה עשוי לשפר את האכלה זחל. הערה: הזחלים צריכים להיות בתוך כלי הבלימה המאוחסן בחדר הגידול במהלך הזמן הזה.</li>
</ol>3. הגדרת רכיבים לניסוי התפשטות
הערה: עיין בתקציר הסכימטי באיור 1.
<ol><li>הפוך תבניות מיקום עבור כל נקודת זמן הקציר. הערה: מומלץ להגדיר 5 מגשים שונים עבור כל נקודת זמן הקציר. זה שומר על הדגימות מאורגן ומאפשר להעביר את הכלים ביעילות רבה יותר כמו סט מבלי לשנות את ההסדר שלהם. אם החישובים של אחוז הנזק יבוצעו, זה חיוני כמו לפני ואחרי התפשטות תמונות חייב להילכד באותו אורך מוקד.<ol>
<li>להשיג 5 מגשים חסון מסוגל להחזיק סט של שישה מנות פטרי בגודל הראוי קו עם נייר לבן. הערה: גודל צלחת פטרי מתבסס על גודל העלה שנבחר לצורך האכלה. העלה צריך להתאים בקלות בצלחת מבלי לגעת בצדדים. לדוגמה, צלחת 60 מ"מ x 15 מ"מ מתאים לעלים עד 50 מ"מ באורך או ברוחב.</li>
		<li>מעקב אחר קבוצה של שישה עיגולים באמצעות צלחת פטרי בגודל הראוי על הנייר בכל מגש. סמן קבוצה אחת של ' שליטה במעגלים ' A, B ו-C והשני ' הנגועים ', B ו-C. כמו כן לתייג כל תבנית מיקום עם זמן הקציר המתאים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אופציונלי להגדיר מצלמה עבור ' לפני התפשטות ' ו ' לאחר התפשטות תמונה לכידת.<ol>
<li>מאבטח מצלמה על דוכן באורך המוקד המתאים ללכידת התמונה של כל מנות פטרי בתבנית המיקום.</li>
	</ol>
</li>
	<li>סמן את צינורות הזמן הקציר.<ol>
<li>תווית קבוצה של 30, 1.7 mL מיקרוצנטריפוגה צינורות המתאימים לכל עיגול בתבנית המיקום. סמן את הצינורות כדי לזהות כראוי את הפרטורציה (בקרה/שורץ), את אות השכפול של הצמח (A, B או C) ואת נקודת זמן הקציר (מספר דקות לאחר התפשטות התקופה).</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכינו מנות פטרי שנבחרו בשלב 3.1.1.<ol>
<li>מניחים דיסק נייר מסנן סטרילי בכל אחד מ -30 מנות פטרי משלב 3.1.1. הוסף מים סטרילי כדי להרטיב את הדיסקים; אין לאפשר מים עודפים לבריכה במנה. מניחים כל מנה בכל אחד מששת המעגלים בכל תבנית מיקום.</li>
		<li>הצב שלושה צמחי תפוחי אדמה לצד כל תבנית מיקום. ודא כי צמחים הם באותו גיל ובגודל יחסי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ביצוע התפשטות
הערה: נקודת זמן של קציר אחת/תבנית מיקום מוגדרת בכל פעם.
<ol><li>הסירו את שתי המידות המובילות מהמפעל עם מספריים סטריליים ומניחים עלה אחד בצלחת פטרי ואחד בצלחת פטרי הנגועה לכל צמח (A, B ו-C). ביצוע תהליך זה במהירות האפשרית.</li>
	<li>אופציונלי העבר את תבנית המיקום למעמד המצלמה כדי ללכוד תמונת ' לפני הדבקה '.</li>
	<li>העבר הזחלים לכל מנה שורץ באמצעות מלקחיים לגעת רך מהר ככל האפשר. הגדר את שעון העצר עבור הזמן הנדרש ' הדבקה '. הערה: פרק הזמן שבו הזחלים צורכים את רקמת העלה הוא ' זמן התפשטות '. זה משהו שיכול להיקבע בשיטה מדעית באמצעות כמה עלי בדיקות/הזחלים לפני תחילת התפשטות בפועל. זמן התפשטות הנבחרת צריך להיות עקבי לכל העלים הנגועים. הערה: הזחלים צריכים להיות מטופלים עם טיפול על ידי מלקחיים מגע רך. ניתן להבין בעדינות את השני עד התור הרביעי באמצעות הצופר או המותניים.</li>
	<li>שים לב להזנה כדי לוודא. שכל הזחלים אוכלים יש להוסיף/להסיר את הזחלים על בסיס התנהגות האכלה. שמרו על מכסים על מנות פטרי ככל האפשר. הערה: ניתן להשתמש ברימות מרובות בכל עלה.</li>
	<li>להסיר את הזחלים מעלים בסוף זמן הפלישה. הפעל את שעון העצר לזמן הקציר.</li>
	<li>אופציונלי העבר את תבנית המיקום למעמד המצלמה כדי ללכוד את תמונת ' אחרי הדבקה '. הערה: כל ששת העלים בתבנית המיקום נקצרו בזמן הקציר המסוים.</li>
</ol>5. קציר עלים
<ol><li>העבר כל עלה לצינור המקביל בתווית בסוף כל נקודת זמן הקציר ולהקפיא מיד על ידי שחרור הצינור לתוך N נוזלי2. לאחסן את רקמת הצמח שנקטפו ב-80 ° צ' עד הבידוד של RNA.</li>
	<li>חזור על שלבים 4 \ u 20125.1 עבור כל נקודת זמן של קציר.</li>
</ol>6. מעבד רקמת עלים לניתוח ביטוי גנים
<ol><li>לטחון את רקמת העלים הקפואים לאבקה עם מיקרופסל.</li>
	<li>בודד RNA סה כ ותהליך לביטוי גנים כמתואר בעבר22.</li>
</ol>7. (אופציונאלי) אומדן נזקי עלה
<ol><li>הערכת חזותית אחוזים של נזק עלה או לחשב את אזור העלה בתמונות לפני ואחרי התפשטות.</li>
	<li>למדוד את אזור העלה עם כלי תוכנה (למשל, פנפיט)23.</li>
	<li>ממדידות באזור העלה, חישוב אחוז הנזק כ % נזק = [(אזור העלים לפני – אזור העלים)/אזור העלה לפני] x 100.</li>
</ol>

<ol><li>Choi, H. W., Klessig, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAMPs%2C+MAMPs%2C+and+NAMPS+in+plant+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">DAMPs, MAMPs, and NAMPS in plant innate immunity.</a> BMC Plant Biology. 16, 1-10 (2016).</li>
<li>Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S., Ryan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polypeptide+from+tomato+leaves+induces+wound-inducible+proteinase+inhibitor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins.</a> Science. 253, 895-897 (1991).</li>
<li>Savatin, D. V., Gramegna, G., Modesti, V., Cervone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wounding+in+the+plant+tissue%3A+the+defense+of+a+dangerous+passage%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Wounding in the plant tissue: the defense of a dangerous passage.</a> Frontiers in Plant Science. 470 (5), 1-11 (2014).</li>
<li>Basu, S., Varsanit, S., Louis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altering+Plant+Defenses%3A+Herbivore-Associated+Molecular+Patterns+and+Effector+Arsenal+of+Chewing+Herbivores%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Altering Plant Defenses: Herbivore-Associated Molecular Patterns and Effector Arsenal of Chewing Herbivores.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 31, 13-21 (2018).</li>
<li>Chung, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herbivore+exploits+orally+secreted+bacteria+to+suppress+plant+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 110, 15728-15733 (2013).</li>
<li>Chen, M. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+direct+plant+defense+against+insect+herbivores%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Inducible direct plant defense against insect herbivores: A review.</a> Insect Science. 15, 101-114 (2008).</li>
<li>Howe, G. A., Major, I. T., Koo, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modularity+in+jasmonate+signaling+for+multistress+resilience%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Modularity in jasmonate signaling for multistress resilience.</a> Annual Review of Plant Biology. 69, 387-415 (2018).</li>
<li>War, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+defence+against+herbivory+and+insect+adaptations%5BTitle%5D)+AND+%22AoB+PLANTS%22%5BJournal%5D)">Plant defence against herbivory and insect adaptations.</a> AoB PLANTS. 10 (4), 1-19 (2018).</li>
<li>McCloud, E. S., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herbivory+and+caterpillar+regurgitants+amplify+the+wound-induced+increases+in+jasmonic+acid+but+not+nicotine+in+Nicotiana+sylvestris%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Herbivory and caterpillar regurgitants amplify the wound-induced increases in jasmonic acid but not nicotine in Nicotiana sylvestris.</a> Planta. 203, 430-435 (1997).</li>
<li>Schittko, U., Hermsmeier, D., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+interactions+between+the+specialist+herbivore+Manduca+sexta+%28Lepidoptera%2C+Sphingidae%29+and+its+natural+host+Nicotiana+attenuate%3A+II.+Accumulation+of+plant+mRNAs+responding+to+insect-derived+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate: II. Accumulation of plant mRNAs responding to insect-derived cues.</a> Plant Physiology. , 701-710 (2001).</li>
<li>Halitschke, R., Schittko, U., Pohnert, G., Boland, W., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+interactions+between+the+specialist+herbivore+Manduca+sexta+%28Lepidoptera%2C+Sphingidae%29+and+its+natural+host+Nicotiana+attenuate.+III.+Fatty+acid-amino+acid+conjugates+in+herbivore+oral+secretions+are+necessary+and+sufficient+for+herbivore-specific+plant+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular interactions between the specialist herbivore Manduca sexta (Lepidoptera, Sphingidae) and its natural host Nicotiana attenuate. III. Fatty acid-amino acid conjugates in herbivore oral secretions are necessary and sufficient for herbivore-specific plant responses.</a> Plant Physiology. 125, 711-717 (2001).</li>
<li>Lortzing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+responses+of+Solanum+dulcamara+to+natural+and+simulated+herbivory%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Resources%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic responses of Solanum dulcamara to natural and simulated herbivory.</a> Molecular Ecology Resources. 17, 1-16 (2017).</li>
<li>Hjältén, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simulating+herbivory%3A+problems+and+possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Ecological+Studies%22%5BJournal%5D)">Simulating herbivory: problems and possibilities.</a> Ecological Studies. 173, 243-255 (2004).</li>
<li>Lehtilä, K., Boalt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+and+usefulness+of+artificial+herbivory+in+plant-herbivore+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Ecological+Studies%22%5BJournal%5D)">The use and usefulness of artificial herbivory in plant-herbivore studies.</a> Ecological Studies. 173, 257-275 (2004).</li>
<li>Schittko, U., Preston, C. A., Baldwin, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eating+the+evidence%3F+Manduca+sexta+larvae+can+not+disrupt+specific+jasmonate+induction+in+Nicotiana+attenuata+by+rapid+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Eating the evidence? Manduca sexta larvae can not disrupt specific jasmonate induction in Nicotiana attenuata by rapid consumption.</a> Planta. 210, 343-346 (2000).</li>
<li>Zebelo, S. A., Maffei, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+early+signalling+events+in+plant-insect+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Role of early signalling events in plant-insect interactions.</a> Journal of Experimental Botany. 66, 435-448 (2015).</li>
<li>Maffei, M. E., Mithofer, A., Boland, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Before+gene+expression%3A+early+events+in+plant-insect+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Before gene expression: early events in plant-insect interaction.</a> Trends in Plant Science. 12, 310-316 (2007).</li>
<li>Goodwin, P. B., Adisarwanto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+potato+by+shoot+tip+culture+in+Petri+dishes%5BTitle%5D)+AND+%22Potato+Research%22%5BJournal%5D)">Propagation of potato by shoot tip culture in Petri dishes.</a> Potato Research. 23, 445-448 (1980).</li>
<li>Goodwin, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+propagation+of+potato+by+single+node+cuttings%5BTitle%5D)+AND+%22Field+Crops+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid propagation of potato by single node cuttings.</a> Field Crops Research. 4, 165-173 (1981).</li>
<li>Martin, P. A. W., Blackburn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+combinatorics+to+screen+Bacillus+thuringiensis+isolates+for+toxicity+against+Manduca+sexta+and+Plutella+xylostella%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Control%22%5BJournal%5D)">Using combinatorics to screen Bacillus thuringiensis isolates for toxicity against Manduca sexta and Plutella xylostella.</a> Biological Control. 42, 226-232 (2007).</li>
<li>Bell, R. A., Joachim, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+rearing+laboratory+colonies+of+tobacco+hornworms+and+pink+bollworms%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Entomological+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Techniques for rearing laboratory colonies of tobacco hornworms and pink bollworms.</a> Annals of the Entomological Society of America. 69 (2), 365-373 (1976).</li>
<li>Lawrence, S. D., Novak, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+remarkable+plethora+of+infestation-responsive+Q-type+C2H2+transcription+factors+in+potato%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">The remarkable plethora of infestation-responsive Q-type C2H2 transcription factors in potato.</a> BMC Research Notes. 11, 1-7 (2018).</li>
<li>Green, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PhenoPhyte%3A+a+flexible+affordable+method+to+quantify+2D+phenotypes+from+imagery%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">PhenoPhyte: a flexible affordable method to quantify 2D phenotypes from imagery.</a> Plant Methods. 8 (45), 1-12 (2012).</li>
<li>Lawrence, S. D., Novak, N. G., Jones, R. W., Farrar, R. R. Jr, Blackburn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herbivory+responsive+C2H2+zinc+finger+transcription+factor+protein+StZFP2+from+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Herbivory responsive C2H2 zinc finger transcription factor protein StZFP2 from potato.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 80, 226-233 (2014).</li>
<li>Korth, K. L., Dixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+chewing+insect-specific+molecular+events+distinct+from+a+general+wound+response+in+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evidence for chewing insect-specific molecular events distinct from a general wound response in leaves.</a> Plant Physiology. 115, 1299-1305 (1997).</li>
<li>Browne, R. A., Cooke, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+an+in+vitro+detached+leaf+assay+for+pre-screening+resistance+to+Fusarium+head+blight+in+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of an in vitro detached leaf assay for pre-screening resistance to Fusarium head blight in wheat.</a> European Journal of Plant Pathology. 110, 91-102 (2004).</li>
<li>Browne, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+components+of+fusarium+head+blight+resistance+in+soft+red+winter+wheat+germ+plasm+using+a+detached+leaf+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">Evaluation of components of fusarium head blight resistance in soft red winter wheat germ plasm using a detached leaf assay.</a> Plant Disease. 89, 404-411 (2005).</li>
<li>Michel, A. P., Rouf Mian, M. A., Davila-Olivas, N. H., Canas, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detached+leaf+and+whole+plant+assays+for+soybean+aphid+resistance%3A+differential+responses+among+resistance+sources+and+biotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Economic+Entomology%22%5BJournal%5D)">Detached leaf and whole plant assays for soybean aphid resistance: differential responses among resistance sources and biotypes.</a> Journal of Economic Entomology. 103, 949-957 (2010).</li>
<li>Sharma, H. C., Pampapathy, G., Dhillon, M. K., Ridsdill-Smith, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detached+leaf+assay+to+screen+for+host+plant+resistance+to+Helicoverpa+armigera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Economic+Entomology%22%5BJournal%5D)">Detached leaf assay to screen for host plant resistance to Helicoverpa armigera.</a> Journal of Economic Entomology. 98, 568-576 (2005).</li>
<li>Vivianne, G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+laboratory+assay+for+Phytophthora+infestans+resistance+in+various+Solanum+species+reflects+the+field+situation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">A laboratory assay for Phytophthora infestans resistance in various Solanum species reflects the field situation.</a> European Journal of Plant Pathology. 105, 241-250 (1999).</li>
<li>Kamoun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+encoding+a+protein+elicitor+of+Phytophthora+infestans+is+down-regulated+during+infection+of+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">A gene encoding a protein elicitor of Phytophthora infestans is down-regulated during infection of potato.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 10, 13-20 (1997).</li>
<li>Nowakowska, M., Nowicki, M., Kłosińska, U., Maciorowski, R., Kozik, E. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appraisal+of+artificial+screening+techniques+of+tomato+to+accurately+reflect+field+performance+of+the+Late+Blight+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Appraisal of artificial screening techniques of tomato to accurately reflect field performance of the Late Blight resistance.</a> Plos One. 9, e109328(2014).</li>
<li>Arimura, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herbivory-induced+volatiles+elicit+defence+genes+in+lima+bean+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Herbivory-induced volatiles elicit defence genes in lima bean leaves.</a> Nature. 406, 512-515 (2000).</li>
<li>Erb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatiles+as+inducers+and+suppressors+of+plant+defense+and+immunity-origins%2C+specificity%2C+perception+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Volatiles as inducers and suppressors of plant defense and immunity-origins, specificity, perception and signaling.</a> Current Opinion in Plant Biology. 44, 117-121 (2018).</li>
<li>Hasegawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+analysis+of+wounding-induced+root-to-shoot+communication+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+and+Environment%22%5BJournal%5D)">Gene expression analysis of wounding-induced root-to-shoot communication in Arabidopsis thaliana.</a> Plant, Cell and Environment. 34, 705-716 (2011).</li>
<li>Ryan, C. A., Moura, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+wound+signaling+in+plants%3A+A+new+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%2C+USA%22%5BJournal%5D)">Systemic wound signaling in plants: A new perception.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 6519-6520 (2002).</li>
<li>Hilleary, R., Gilroy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+signaling+in+response+to+wounding+and+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Systemic signaling in response to wounding and pathogens.</a> Current Opinion in Plant Biology. 43, 57-62 (2018).</li>
<li>Carolina Biological Supply Company. Hornworms. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.carolina.com/hornworm/hornworms/FAM_143880.pr">https://www.carolina.com/hornworm/hornworms/FAM_143880.pr</a> (2018).</li>
<li>Great Lakes Hornworm. Products. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.greatlakeshornworm.com/products/">https://www.greatlakeshornworm.com/products/</a> (2018).</li>
<li>The Board of regents of the University of Wisconsin System. Manduca. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://labs.russell.wisc.edu/manduca/lifecycle/">http://labs.russell.wisc.edu/manduca/lifecycle/</a> (2018).</li>
<li>Raising Manduca sexta. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html">https://acad.carleton.edu/curricular/Biol/resources/rlink/description2.html</a> (2018).</li>
<li>Berkley, C. Teach life cycles with the tobacco hornworm. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr">https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/teach-life-cycles-with-the-tobacco-hornworm/tr30179.tr</a> (2018).</li>
<li>Chung, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+plant+species+determines+symbiotic+bacterial+community+mediating+suppression+of+plant+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Host plant species determines symbiotic bacterial community mediating suppression of plant defenses.</a> Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

השימוש הקיים הצמח כולו מתודולוגיות העשב הוא מיותר להשיג את המטרה של מחקר מסוים זה (כלומר, המסך מערכת של גנים המועמדים לתגובה שלהם התפשטות). היתרון הברור של עידון העלה הפרטי הוא קיצור הזמן שלוקח לבצע העשב vory assays. הטבע המרפא של צמחים שלמים עם כלובים מסולקים מסולק והוא מבוצע מוקדם יותר, מאז הצמחים צעירים כמו 2 שבועות ניתן להשתמש כדי הקציר עלים. זה דורש גם טביעת רגל קטנה הרבה יותר במהלך האכלה ופחות חלל קאמרית הצמיחה; חשוב גם כאשר משאבים אלה מוגבלים.
המגבלה של מעשה זה, כלומר ניתוק, נתקל כאשר ב...

הרבורי מגדיר בתנועה סדרה של אירועים מולקולריים שבהם צמח יכול לזהות את המתקפה ולטעון תגובה מתאימה להישרדותה. צמח מקבל שני רמזים בסיסיים מלעיסת חרקים; אחד מהנזק הפיזי לרקמה ולשני מחומרים ספציפיים לחרקים. תבניות מולקולריות משויכות לנזקים (DAMPs) שוחררו בתגובה לנזק שנוצר על-ידי חלקי הזחל ומפעיל תגובת פציעה מוגדרת היטב הנובעת מגידול בחומצה ההורמון לימונית ותמלול גנים הביטחון1. אחד מהדואמפר הידועים ביותר הוא מערכת, פוליפפטיד הנוצרת על ידי המחשוף של החלבון prosystemin גדול יותר לאחר עלה נפצע2,3. התגובה הפצע החומצה הממונית הוא עוד מאופנן על ידי דפוסי מולקולרי הרביוור-הקשורים (HAMPs), אשר יכול להיות נגזר רוק זחל, תוכן המעיים (regurgitant) וצואה (frass)4. חרקים להשתמש בחומרים אלה כדי להגביר או להתחמק תגובת ההגנה5. גורמים שעתוק ולאחר מכן ממסר את ההודעה מפני אותות הורמונים בתגובה הביטחון באמצעות רגולציה של גנים הביטחון במורד הזרם6,7,8.
חלק ממחקרי האינטראקציה עם חרקים מהמפעל המשמשים במסגרות מעבדה הם מסוג הסימולציה, עם מטרה לקירוב השיטה הטבעית של האכלה על ידי החרק. העשב מדומה מושגת בדרך כלל על ידי יצירת נזק מלאכותי לרקמות הצמח עם כלים שונים המחקים את המנגנון הספציפי של חלקי החרקים מספיק כדי לגרום לשחרור של DAMPs ולהפעיל את הייצור של גנים הביטחון. רכיבים אחרים ספציפיים לחרקים כגון הפרשות אוראלי או regurgitant מתווספים לעתים קרובות כדי לשכפל את התרומה של hamps9,10,11. הקמתה של גודל מסוים וסוג של פצע ואת היישום של כמויות מדויקות של HAMPs הוא אחד היתרונות לסוגים אלה של מחקרים והוא יכול להציע תוצאות שניתן להפיק יותר. טבעי לימודי העשב, היכן נזק לרקמת הצמח מושגת על ידי יישום של חרקים נרכש או מעבדה-הגדלים המעבדה, הם לעתים קרובות יותר מאתגרת בגלל הפצע בגודל וכמויות hamp נשלטים על ידי התנהגות החרק ולהוסיף שינויים ב נתונים. השיטות הטבעיות לעומת מדומה והיתרונות והחסרונות שלהם הינם לדיון היטב בספרות12,13,14.
כדי ללמוד אירועים איתות מוקדם כגון גורמי שעתוק, אחוז מסוים של העלה חייב להיות נצרך בפרק זמן קצר יחסית, כך הזחלים חייבים להתחיל ללעוס מיד לשמור על צריכת עד העלה קפוא לניתוח. M. סקסטה הוא ממזין משוכן על מספר צמחים solanאכאאוס במהלך רבים של שלבי הזחל שלה, מה שהופך אותו אידיאלי לקבלת נזק מקסימלי בפרק זמן קצר יחסית של15. זה נוח כאשר לומדים האירועים איתות מוקדם, כמו תגובת הצמח מתרחשת כמעט מיד לאחר שחרק מקשר את פני העלה16,17. שיטת הבלימה הנפוצה ביותר בשימוש בכלוב מוכיחה מגושמת, משום שכלובים מרובים ידרשו התאמות מתמיד במהלך הניסוי כדי לאפשר הסרה או הוספה של הזחלים. העלים חייבים גם להיות גדולים מספיק וחזקים מספיק כדי לתמוך בחרקים מרובים האכלה באותו זמן. סוגים אלה של צמחי תפוחי אדמה דורשים כמות גדולה של שטח להתבונן האכלה. הזחלים מפרידים לעתים קרובות אל החלק התחתון של משטח העלה אשר גם עושה תצפיות האכלה די קשה. באמצעות צמחים שלמים לבצע ניסויים אלה הוא מסורבל בבירור.
המחקר הנוכחי משתמש בעלים מבודדים בצלחות פטרי במקום צמחים שלמים כדי לייעל ולפשט את הגישה המפעל כולו כדי ללמוד העשב vory. היישום של הפרוטוקול במחקר זה מוגבל להתבוננות של קבוצה של הגורמים C2H2 המושרה מוקדם בעלי תפוחי אדמה לאחר נזק העשב על ידי הזחלים מ. סקסטה .

<table><tbody><tr><td>תחליף אגר</td><td>מוצר PhytoTechnology Laboratories</td><td>G3251</td> הוא כלי בלימה <td>של גלזן</td></tr><tr><td>(צלחת 6,12 או 24 בארות)</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>08-772-49, 08-772-50, 08-72-51</td><td>חברות רבות אחרות מוכרות את המוצרים הללו</td></tr><tr><td>ביצי מנדוקה&nbsp;</td><td>חברת האספקה הביולוגית של קרוליינה</td><td>143880</td><td>30-50 ביצים</td></tr><tr><td>ביצי מנדוקה&nbsp;</td><td>תולעת קרן האגמים הגדולים</td><td>NA</td><td>50, 100, 250 או 500 ביצים</td></tr><tr><td>זחלי מנדוקה</td><td>חברת האספקה הביולוגית של קרוליינה</td><td>קוראים לבקשות כוכב זחל ספציפיות</td><td>כל</td></tr><tr><td>זחלי מנדוקה</td> instar <td>תולעת קרן</td><td>קוראים לבקשות כוכב זחל ספציפיות</td><td>כל</td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה instar, 1.7 מ"ל&nbsp;</td><td>תומס סיינטיפיק</td><td>1158R22</td><td>אלה נבדקו בנוזל N2 ולא יתפוצצו</td></tr><tr><td>Murashige & Skoog (MS) בינוני בזאלי עם ויטמינים</td><td>מעבדות PhytoTechnology</td><td>M519</td><td>המשמש לייצור תערובת אגר תזונתית בינונית התפשטות</td></tr><tr><td></td><td>PhytoTechnology Laboratories</td><td>M5825</td><td>המוצר הוא Murashige & סקוג בזל בינוני עם ויטמינים, סוכרוז</td></tr><tr><td>ודיסקיות סינון נייר</td> גלזן <td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>09-805A</td><td>מעגלי ווטמן-רכישה להתאמה לצלחת פטרי צלחת</td></tr><tr><td>פטרי, 60X15 מ"מ או 100X15 מ"מ</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td>גודל רכישה <td>FB0875713A או FB0875712</td><td>המתאים</td></tr><tr><td>לפקעות תפוחי אדמה בגודל עלים&nbsp;</td><td>כל</td><td>גודל B (לא אורגני)</td> <td>מציע חקלאי מיין" s סירי החלפה</td></tr><tr><td>, 10 אינץ'&nbsp;</td><td>גריפין חממה אספקה, בע"מ</td><td>41PT1000CN2</td><td></td></tr> חומר <tr><td>משמר/ביוציד</td><td>טכנולוגיית תאי צמח</td> מוצר <td>NA</td><td>הוא PPM (תערובת משמרת צמחית)</td></tr> <tr><td>תפוחי אדמה זרעים למקור אקספלנט</td><td>בכל</td><td>גודל B (לא אורגני)</td> <td>מציע חקלאי מיין' s החלפת</td></tr><tr><td>דשן בשחרור איטי (14-14-14)</td> <td>כל</td><td>NA</td><td>Osmocote הוא שם מותג פופולרי</td></tr><tr><td>מלקחיים רכים למגע</td><td>BioQuip</td><td>4750</td><td></td></tr><tr><td>תערובת אדמה</td><td>Griffin Greenhouse Supplies, Inc.</td><td>65-51121</td><td>המוצר הוא Sunshine LC1 mix</td></tr><tr><td>כלי תרבית סטרילי&nbsp;</td><td>PhytoTechnology Laboratories</td><td>C2100</td><td>כלי מסוג מגנטה, כלי תרבית סטרילי PTL-100</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>מוצר ICN2672206</td><td>הוא MP Biomedicals Plantcon</td></tr></tbody></table>

מנותקת עלה assays לפשט גנים ביטוי לימודי תפוחי אדמה במהלך התפשטות על ידי לעיסת חרק manduca סקסטה

Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

הטבע הmultitrophic של לימודי גנים של העשב המאלף חרקים דורש מספר רב של משכפל ביולוגי, היוצר את הצורך לפרוטוקולים פשוטים ויעילים יותר של העשב. רטבאליות של חרקים לעיסה לומדים בדרך כלל במערכות צמחים שלמות. בעוד שאסטרטגיית האורגניזם הזאת פופולרית, אין בכך צורך אם ניתן לשכפל תצפיות דומות בעלה מנותק אחד. ההנחה היא שאלמנטים בסיסיים הנדרשים להתמרה של אותות נמצאים בתוך העלה עצמו. במקרה של אירועים מוקדמים של התמרה אותות, התאים צריכים רק כדי לקבל את האות מתוך הפרטורציה ולשדר את האות לתאים השכנים אשר מחכים לביטוי גנים.
השיטה המוצעת פשוט משנה את התזמון של הניתוק. בניסויים צמחיים שלמים, הזחלים מוגבלים לעלה בודד אשר מנותקת בסופו של דבר מן הצמח ומרותק לביטוי גנים. אם הסדר של כריתה מתהפך, מאחרון בלימודי המפעל כולו, לראשונה במחקר הפרטי, ניסוי ההזנה הוא פשוט.
. סולנום טובראוסום באר קנאו מופץ על ידי העברה קטרי במדיום תרבות פשוטה בינונית והועברה קרקע לצמיחה נוספת אם תרצה. העלים מוגשים ממפעל ההורים והועברו למנות פטרי שבהן מתנהל שיטת ההזנה עם שלבי הזחל של מדיום. רקמת עלה פגומה הינה לביטוי של אירועים מוקדמים יחסית של התמרה אותות. ניתוח ביטויים גנטיים זיהה התפשטות Cys2-His2 (C2H2) גורמים שעתוק, המאשרת את ההצלחה של שימוש בעלים מנותקים במחקרים מוקדמים של התגובה. השיטה היא קלה יותר לבצע מאשר הצמח שלמות התחנות והוא משתמש פחות שטח.

צריכה העלה מגדירה הצלחה של הפרוטוקול. בריאים, הזחלים מבוים באופן מדויק צריך להתחיל להאכיל מיד לאחר הצבת על פני השטח ועל האכלה צריך להמשיך באופן עקבי למדי לאורך זמן הפלישה. ב וידאו 1, הזחל בחלק העליון מתחיל ללעוס מיד לאחר המיקום ושומר על שיעור עקבי תוך כדי האכלה. זה חשוב במיוחד אם לומר אירועים ביטוי גנים מוקדם לאחר התפשטות. הזחל בתחתית לא צורכים כל חומר עלה והוא דוגמה של התפשטות מוצלח.
קירובים חזותית במהלך צריכת ...

השיטה המוצגת יוצרת הרביוור טבעי הנזק רקמת הצמח באמצעות היישום של מנדוקה הזחלים סקסטה להתנתק עלים של תפוחי אדמה. רקמת הצמח הוא הבעה ביטוי של שישה שעתוק גורם הומויומני מעורב בתגובות מוקדמות לחרקים העשב.

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...

פרוטוקול זה משתמש בגישה יעילה למדידת ביטוי גנים צמחיים בתגובה לרבי חרקים. על ידי שימוש בעלים מנותקים מבודדים בצלחות פטרי, החרקים קלים יותר ליישם ולנטר במהלך התקופה הקצרה יחסית של התפשטות לתרום נתוני ביטוי גנים להתרבות. פרוטוקול זה עשוי להיות מותאם אינטראקציות צמחים / חרקים רבים.אם תצפיות בסיסיות של מערכות צמחים שלמות נחשבות. האופי הבלתי צפוי של האכלת חרקים יכול להיות מאתגר. לכן, אספקה אמינה של זחלים מבוימים כראוי וצמחים בריאים מספקים את הסיכוי הטוב ביותר להצלחה.לדמיין כיצד צמחים וחרקים בריאים צריכים להופיע ולהתנהג הוא אינסטרומנטלי להשגת תוצאות אופטימליות במיוחד עבור חוקרים חדשים בתחום המחקר. הפגנת ההליך איתי תהיה פרנסס פרז, ביולוגית מולקולרית בשיפור גנטי של מעבדת פירות וירקות. כדי להכין צמחים תפוחי אדמה תרבות רקמות מופץ nodal, תחילה להשיג plantlets Kennebec גדל מחומר explant עם לפחות שלושה עד ארבעה צמתים.השתמש בלהב סטרילי כדי להסיר את העלים חיתוך הענפים קרוב לגזע הראשי ולהשאיר כשני מילימטרים של רקמת ענף לכל עלה. חותכים כשני מילימטרים מעל ומתחת לכל צומת כדי להסיר את החלקים nodal מן הגבעולים ולסדר את חתכים nodal בכלי תרבות רקמה סטרילית המכיל מדיום העברה nodal עם הענף מצביע למעלה. לאחר מכן להעביר את גזירה nodal לתא תרבות רקמת הצמח במשך שבועיים עד שלושה שבועות של צמיחה ב 24 מעלות צלזיוס ותהוכת צילום כהה אור 16 שעות, שמונה שעות.כדי להכין את החרקים להאכלה, להשיג את שלב הזחל הרצוי של M.sexta ולהעביר זחל אחד לתוך כל באר של כלי בלימה מתאים בהתאם לגודל הזחל. הפוך תבניות מיקום עבור כל נקודת זמן קציר באמצעות חמישה מגשים חסון מסוגל להחזיק קבוצה של שש מנות פטרי בגודל מתאים מרופד נייר לבן. עקוב אחר קבוצה של שישה עיגולים באמצעות צלחת פטרי בגודל מתאים על הנייר בכל מגש ולתייג קבוצה אחת של עיגולים לשלוט A, B, ו- C והשני שורץ A, B, ו C.Then תווית כל תבנית מיקום עם זמן הקציר המתאים.לאחר מכן, סמן צינור מיקרוצנטריפוגה אחד של 1.7 מיליליטר עבור כל עיגול בתבנית המיקום כדי לזהות כראוי את ההטרדה, אות שכפול הצמח ונקודת הזמן של הקציר. כאשר כל הצינורות תויגו, מניחים דיסק נייר מסנן סטרילי לתוך צלחת פטרי אחת לכל תבנית להרים את הדיסקים עם מים סטריליים מבלי לתת בריכה נוזלית עודפת בכל מנה. לאחר מכן מניחים מנה אחת בכל עיגול בכל תבנית מיקום ומ מניחים שלושה צמחי תפוחי אדמה באותו גיל וגודל יחסי ליד כל תבנית מיקום.כדי ליזום את התפשטות, להשתמש במספריים סטריליים כדי להסיר את שני העלים התואמים בגודל העליון מכל צמח ולמקום עלה אחד בצלחת פטרי שליטה ואחד בצלחת פטרי שורץ עבור כל צמח מהר ככל האפשר. כאשר כל העלים הונחו, השתמש במקלות מגע רכות כדי להעביר לפחות זחל אחד לכל מנה שורצת מהר ככל האפשר ולהגדיר את שעון הזמן לזמן התפשטות הרצוי. שימו לב להאכלה כדי לוודא שכל הזחלים אוכלים, ומחליפים כל זחל שאינו מאכיל לפי הצורך.מוציאים את כל הזחלים מכל העלים בסוף זמן ההתפשטות ומתחילים את שעון הזמן לקציר. בסוף כל נקודת זמן קציר, להעביר כל עלה לתוך הצינור המתאים מיד להפיל את הצינור לתוך חנקן נוזלי להקפיא את דגימת העלה לפני אחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס עד בידוד RNA. זחלים מבוימים בריאים צריכים להתחיל להאכיל מיד לאחר המיקום על פני העלה ואת האכלה צריך להמשיך באופן עקבי למדי לאורך כל תקופת זמן התפשטות.הזחל בתחתית עלה זה לא צרך שום חומר צמחי והוא דוגמה להתפשטות לא מוצלחת. עלים אלה נותקו מצמחים בת שבועיים של נודל שהתרבו רקמות ונצרכו בשיעורים שונים וסגנונות הזנה לכל שלב זחל. בהתבסס על תוצאות אלה, זחלי instar הרביעי נבחרו כדי להעריך עוד יותר את הנזק עלים עבור אדמה בוגרת יותר גדל צמחי תפוחי אדמה כי יותר קרוב שדה גדל צמחי תפוחי אדמה.במחקרים אלה ביטוי גנים, שני גורמי שעתוק אצבע אבץ C2H2 חדשים כי הם מגיבים גם M.sexta herbivory זוהו התומכים בשימוש בעלים מנותקים עבור מיסטי התפשטות. זכור להשתמש בעלים תואמי גיל וגודל וללבות כראוי את הזחלים עבור כל ניסוי, כתוצאה מתוצאות אחידות בנתונים ניתנים לשחזור יותר. ניתן להתביג רקמות עלים עבור מיני חמצן תגובתי עם לחץ ונגזרות הורמון חומצה יסמונית.תעתיק שלם, פרוטאום, או מחקרים מיקרוביום יכול להתבצע גם על רקמות העלה.

detached-leaf-assays-to-simplify-gene-expression-studies-potato

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

מקור: שי, ג'. ואחרים. סינון וזיהוי מדכאי השתקת RNA מאפקטורים מופרשים של פתוגנים צמחיים. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים מבחן חדירה משותפת לזיהוי חלבוני אפקטור פתוגנים המדכאים השתקת RNA בניקוטיאנה בנתמיאנה 16c. דיווח פלואורסצנטי וגן אפקטור מועמד מועברים לעלי הצמח דרך אגרובקטריום. בדרך כלל, השתקת RNA מפחיתה את תמלולי המדווחים, ומפחית את הפלואורסצנציה. אפקטורים מדכאים חוסמים תגובה זו, ושומרים על פלואורסצנציה. בדיקה זו מציעה שיטה מהירה ויזואלית לסינון אפקטורים מיקרוביאליים שמפריעים להגנת המארח.

מבחן קו-אינפלטרציה לבדיקת אפקטורים פתוגנים המדכאים השתקת RNA בצמח

מקור: רופיאן, י. ס. ואחרים. ניתוח תא יחיד של ביטוי גני Pseudomonas syringae ברקמת הצמח. J. Vis. Exp. (2022).סרטון זה מדגים שיטה לניתוח ביטוי גנים בחיידקים פתוגניים שמופקים מצמחים ברמת תא יחיד באמצעות פקטור שעתוק פלואורסצנטי. הדמיה קונפוקלית חושפת הטרוגניות בביטוי גנים של אלימות, ומדגיש גיוון פונקציונלי בתוך אוכלוסיית חיידקים משובטים.

ניתוח ביטוי גנים בתא יחיד מפתוגנים שמופקים על ידי צמחים

אגרואינפיציה ו- PVX agroinfection הם מבחנים תפקודיים שגרתיים לביטוי חוץ רחמי חולף של גנים בצמחים. שיטות אלה הן מבחנים יעילים באסטרטגיות אפקטאורומיות (התנגדות מהירה ותגלית גנים ארסית) וחיוניות למחקר מודרני בפתולוגיה של צמחים מולקולריים. הם עונים על הביקוש לניתוח תפקודי חזק בעל תפוקה גבוהה בצמחים.

אגרוינפינציה ו- PVX אגרוינבינציה בתפוח אדמה וניקוטיאנה בנתאמיאנה

כימות צמיחת פתוגנים הוא כלי רב עוצמה לאפיון תגובות חיסוניות שונות של Arabidopsis thaliana (להלן: Arabidopsis). השיטה המתוארת כאן מציגה בדיקת חדירת מזרק אופטימלית לכימות Pseudomonas syringae pv. מקוליקולה גידול ES4326 בעלים בוגרים של Arabidopsis.

חיידקי עלה הסתננות Assay עבור אפיון פיין של תגובות הצמחים ביטחון באמצעות<em&gt; Thaliana-Pseudomonas ארבידופסיס syringae</em&gt; Pathosystem

לגנים רבים בעלי חשיבות התפתחותית יש דפוסי ביטוי ספציפיים לתאים או לרקמות. מאמר זה מתאר ניסויי LM RNA-seq לזיהוי גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי בגבול להב-נדן עלי התירס ובמוטציות lg1-R בהשוואה לסוג בר. השיקולים הניסיוניים שנדונו כאן חלים על ניתוחים טרנסקריפטומיים של תופעות התפתחותיות אחרות.

עיצוב ניסיוני עבור לייזר Microdissection RNA-seq: לקחים מניתוח התפתחות תירס ליף

מאמר זה מדגים טכניקות הרומן שפותחו עבור משלוח אוראלי של זוגיות גדילי RNA (dsRNA) דרך הרקמות וסקולריים הצמחים עבור התערבות RNA (RNAi) מהצינורות האכלה חרקים.

שיטות משלוח כפול גדילי RNA אוראלי לזירוז התערבות RNA שיפה וחרקים Hemipteran צמח sap-האכלה

המטרה של פרוטוקול המובאת כאן היא ללמוד תגובת transcriptomic בודדים endosphere Bacillus mycoides תפוחי אדמה השורש exudates. שיטה זו מקלה על הזיהוי של גנים חיידקיים חשוב מעורב אינטראקציות צמח-חיידק, באופן עקרוני החלים endophytes וצמחים אחרים, עם התאמות קלות.

צמח-חיידק האינטראקציה: תעתיק בתגובה של Bacillus Mycoides תפוחי אדמה שחורה Exudates

כאן, אנו מציגים שיטת הקרנה שונה שניתן להשתמש בהרחבה כדי להקרין במהירות RNA השתקה דכאי במחלות צמחים.

הקרנה וזיהוי של רנ א השתקה דכאי מ מופרש העריקים של פתוגנים צמח

אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור וירוס תפוחי אדמה X (PVX)מבוסס microRNA השתקת מערכת (VbMS) כדי לאפיין פונקציונלית microRNAs אנדוגני (miRNAs) בתפוח אדמה. מולקולות חיקוי מטרה (TM) של miRNA של עניין משולבות בווקטור PVX ומתבטאות באופן חולף בתפוח אדמה כדי להשתיק את משפחת ה- miRNA או miRNA היעד.

וירוס תפוחי אדמה X מבוסס השתקת מיקרונה (VbMS) בתפוח אדמה.

הפרוטוקול מתאר זיהום של שורשי Solanum tuberosum בנמטודות טפיליות של צמחים בתנאי חממה in vivo ושורשים טרנסגניים של תפוחי אדמה במבחנה לניתוח היסטוכימי של מבנה השורשים באמצעות מיקרוסקופיה אופטית.

זיהום in vivo ו-In vitro של שורשי תפוחי אדמה בנמטודות טפיליות צמחיות להערכת שינויים מבניים מושרים

פרוטוקול זה מתאר גישה בעלת תפוקה גבוהה להערכת דליפת יוני צמחים, פעילות פרוקסידאז וייצור קלוז באותה דגימה.

הערכת תגובות עלים למטבוליטים משניים מיקרוביאליים באמצעות פורמט בעל תפוקה גבוהה

למדו שיטה פשוטה למדידת ביטוי גנים בתפוחי אדמה בתגובה ללעיסת חרקים באמצעות עלים מנותקים וזחלי Manduca sexta. הפרוטוקול מאפשר ניטור מבוקר של השפעת הרבייה על ביטוי גנים ומספק נתונים ברי-השוואה.

מנותקת עלה assays לפשט גנים ביטוי לימודי תפוחי אדמה במהלך התפשטות על ידי לעיסת חרק manduca סקסטה

גלה סרטונים נוספים