מנותקת עלה assays לפשט גנים ביטוי לימודי תפוחי אדמה במהלך התפשטות על ידי לעיסת חרק manduca סקסטה

פרוטוקול זה משתמש בגישה יעילה למדידת ביטוי גנים צמחיים בתגובה לרבי חרקים. על ידי שימוש בעלים מנותקים מבודדים בצלחות פטרי, החרקים קלים יותר ליישם ולנטר במהלך התקופה הקצרה יחסית של התפשטות לתרום נתוני ביטוי גנים להתרבות. פרוטוקול זה עשוי להיות מותאם אינטראקציות צמחים / חרקים רבים.

אם תצפיות בסיסיות של מערכות צמחים שלמות נחשבות. האופי הבלתי צפוי של האכלת חרקים יכול להיות מאתגר. לכן, אספקה אמינה של זחלים מבוימים כראוי וצמחים בריאים מספקים את הסיכוי הטוב ביותר להצלחה.

לדמיין כיצד צמחים וחרקים בריאים צריכים להופיע ולהתנהג הוא אינסטרומנטלי להשגת תוצאות אופטימליות במיוחד עבור חוקרים חדשים בתחום המחקר. הפגנת ההליך איתי תהיה פרנסס פרז, ביולוגית מולקולרית בשיפור גנטי של מעבדת פירות וירקות. כדי להכין צמחים תפוחי אדמה תרבות רקמות מופץ nodal, תחילה להשיג plantlets Kennebec גדל מחומר explant עם לפחות שלושה עד ארבעה צמתים.

השתמש בלהב סטרילי כדי להסיר את העלים חיתוך הענפים קרוב לגזע הראשי ולהשאיר כשני מילימטרים של רקמת ענף לכל עלה. חותכים כשני מילימטרים מעל ומתחת לכל צומת כדי להסיר את החלקים nodal מן הגבעולים ולסדר את חתכים nodal בכלי תרבות רקמה סטרילית המכיל מדיום העברה nodal עם הענף מצביע למעלה. לאחר מכן להעביר את גזירה nodal לתא תרבות רקמת הצמח במשך שבועיים עד שלושה שבועות של צמיחה ב 24 מעלות צלזיוס ותהוכת צילום כהה אור 16 שעות, שמונה שעות.

כדי להכין את החרקים להאכלה, להשיג את שלב הזחל הרצוי של M.sexta ולהעביר זחל אחד לתוך כל באר של כלי בלימה מתאים בהתאם לגודל הזחל. הפוך תבניות מיקום עבור כל נקודת זמן קציר באמצעות חמישה מגשים חסון מסוגל להחזיק קבוצה של שש מנות פטרי בגודל מתאים מרופד נייר לבן. עקוב אחר קבוצה של שישה עיגולים באמצעות צלחת פטרי בגודל מתאים על הנייר בכל מגש ולתייג קבוצה אחת של עיגולים לשלוט A, B, ו- C והשני שורץ A, B, ו C.Then תווית כל תבנית מיקום עם זמן הקציר המתאים.

לאחר מכן, סמן צינור מיקרוצנטריפוגה אחד של 1.7 מיליליטר עבור כל עיגול בתבנית המיקום כדי לזהות כראוי את ההטרדה, אות שכפול הצמח ונקודת הזמן של הקציר. כאשר כל הצינורות תויגו, מניחים דיסק נייר מסנן סטרילי לתוך צלחת פטרי אחת לכל תבנית להרים את הדיסקים עם מים סטריליים מבלי לתת בריכה נוזלית עודפת בכל מנה. לאחר מכן מניחים מנה אחת בכל עיגול בכל תבנית מיקום ומ מניחים שלושה צמחי תפוחי אדמה באותו גיל וגודל יחסי ליד כל תבנית מיקום.

כדי ליזום את התפשטות, להשתמש במספריים סטריליים כדי להסיר את שני העלים התואמים בגודל העליון מכל צמח ולמקום עלה אחד בצלחת פטרי שליטה ואחד בצלחת פטרי שורץ עבור כל צמח מהר ככל האפשר. כאשר כל העלים הונחו, השתמש במקלות מגע רכות כדי להעביר לפחות זחל אחד לכל מנה שורצת מהר ככל האפשר ולהגדיר את שעון הזמן לזמן התפשטות הרצוי. שימו לב להאכלה כדי לוודא שכל הזחלים אוכלים, ומחליפים כל זחל שאינו מאכיל לפי הצורך.

מוציאים את כל הזחלים מכל העלים בסוף זמן ההתפשטות ומתחילים את שעון הזמן לקציר. בסוף כל נקודת זמן קציר, להעביר כל עלה לתוך הצינור המתאים מיד להפיל את הצינור לתוך חנקן נוזלי להקפיא את דגימת העלה לפני אחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס עד בידוד RNA. זחלים מבוימים בריאים צריכים להתחיל להאכיל מיד לאחר המיקום על פני העלה ואת האכלה צריך להמשיך באופן עקבי למדי לאורך כל תקופת זמן התפשטות.

הזחל בתחתית עלה זה לא צרך שום חומר צמחי והוא דוגמה להתפשטות לא מוצלחת. עלים אלה נותקו מצמחים בת שבועיים של נודל שהתרבו רקמות ונצרכו בשיעורים שונים וסגנונות הזנה לכל שלב זחל. בהתבסס על תוצאות אלה, זחלי instar הרביעי נבחרו כדי להעריך עוד יותר את הנזק עלים עבור אדמה בוגרת יותר גדל צמחי תפוחי אדמה כי יותר קרוב שדה גדל צמחי תפוחי אדמה.

במחקרים אלה ביטוי גנים, שני גורמי שעתוק אצבע אבץ C2H2 חדשים כי הם מגיבים גם M.sexta herbivory זוהו התומכים בשימוש בעלים מנותקים עבור מיסטי התפשטות. זכור להשתמש בעלים תואמי גיל וגודל וללבות כראוי את הזחלים עבור כל ניסוי, כתוצאה מתוצאות אחידות בנתונים ניתנים לשחזור יותר. ניתן להתביג רקמות עלים עבור מיני חמצן תגובתי עם לחץ ונגזרות הורמון חומצה יסמונית.

תעתיק שלם, פרוטאום, או מחקרים מיקרוביום יכול להתבצע גם על רקמות העלה.