Name: הזרקה ישירה של וקטור Lentiviral מדגיש מספר מסלולים מוטוריים בחוט השדרה עכברוש (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: למד הזרקה ישירה של וקטור Lentiviral לחוט שדרה עכברוש לצורך מעקב רטרוגרדי אחר מסלולים עצביים. שיטה זו מאפשרת מיפוי מעגלים עצביים ויישומי טיפול גני.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומן על ידי מענק מן המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות ו קו R01 R01NS103481 ומענקים החולים שריינרים למחקר בילדים SHC 84051 ואת SHC 86000 משרד ההגנה (SC140089).

כל ההליכים הבאים כירורגית וטיפול בבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים ועל שימוש הוועדה של אוניברסיטת טמפל.
1. בפגישת ההכנות
<ol><li>הכינו זכוכית משך מחטים להזרקה נגיפית מספר ימים לפני הניתוח באמצעות 3.5 nanoliter זכוכית נימי פיפטות מיועד nanoliter מרססים. משוך כל פיפטה פולר המחט שני שלבים לפי הוראות היצרן כדי ליצור שתי תבניות המחט.</li>
	<li>לחדד את קצה המחט התבניות חותכים כ 1-2 מ מ זכוכית עודף עם microscissors. מדד גודל הצמצם משוער תחת מיקרוסקופ עם מגלשת כיול מיקרוסקופ כדי לבודד מחטים עם 30-40 µm פתחים.</li>
	<li>עם המחט ב 30 מעלות, להשתמש beveller micropipette כדי ליצור קצה עם צוהר מיקרומטר 30-40, בזווית של 45° משופע. ודא רוחב מיפתח צמצם עם קנה המידה ורניה על השקופית כיול. עוברים המחט זכוכית באמצעות מזרק עם קובץ מצורף מחט גמישה כדי לשטוף את הלכלוך ולסמן את המחט במרווחי זמן קבועים עם סמן שחור מים ואתנול.</li>
	<li>מקם את המחטים בצלחת פטרי מכוסה בעבר לנקות עם 70% אתנול ולחטא למשך 30 דקות בשכונה אבטחה תחת אור UV.</li>
	<li>להכין HiRet lentivirus על-ידי הסרת אמצעי אחסון מתאימים מהמקפיא מייד לפני ההליך. הערה: אמצעי אחסון מתאימים כולל את הסכום הדרוש עבור הזרקה (µL 1 לכל זריקה x מספר זריקות) וגם כמות קטנה של יותר נפח להביא בחשבון pipetting וטעינה הפסדים. להעביר ולאחסן את הוירוס על הקרח כאשר אינו בשימוש.</li>
	<li>הכינו את מזרק על ידי חיבורו אל micropump והצבתו לתוך micromanipulator עם קנה מידה ורניה.</li>
	<li>כדי להכין את המחט זכוכית, בזהירות לטעון צבע בצבע כגון שמן אדום עם מזרק לבוש עם מחט גמישה. ודא כי אין בועות יישארו במחט. שימוש בטכניקה אספטית טיפול המחט ולהימנע מלגעת הטיפ.</li>
	<li>את המחט זכוכית לתוך מזרק, המבטיח כי המחט מוכנס כהלכה לתוך הדיסקיות, הכיפה מזרק היא מברזל, מחט מזרק פלדה מורחב כ ¾ אורך המחט זכוכית. וירוס ניתן לטעון לתוך המחט בשלב מאוחר יותר.</li>
</ol>2. הכנת האתר כירורגי והרדמה
<ol><li>שוקלים את החיה בקנה מידה דיגיטלי. להקליט את המשקל שטרם-נותחו כדי לקבוע את עוצמת הקול של הרדמה הנדרש, כדי לאפשר פיקוח על המשקל לאחר הניתוח. חולדות ספראג-Dawley נקבות כ 200 – 250 גרם שהיו בשימוש בפרוטוקול זה.</li>
	<li>עזים ומתנגד העכברוש באמצעות אינהלציה איזופלוריין או פתרון מוזרקים קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים (k / x). . קטמין מוזרק intraperitoneally 67 מ"ג/ק"ג, חריגות השירותים הווטרינריים במינון 6.7 מ"ג/ק"ג.</li>
	<li>לאשר מטוס הרדמה המתאים על-ידי התכווצות כף הרגל בחוזקה. אם מתרחשת נסיגה רפלקסיבי, המתן מספר דקות נוספות לפני שתמשיך. הערה: להתבונן גם שפם, העיניים וקצב נשימה סימנים של התודעה. אם נכון הן בפקעת, העין מהבהבת כאשר נגע בעדינות, או הנשימה היא מהירה ורדודה, המתן עד המטוס הרדמה הוא עמוק יותר כדי להמשיך הפרוטוקול. גם לפקח על הסימנים לאורך כל הניתוח laminectomy, הזרקת. אם החיה מציג מטוס הרדמה שטחית, לנהל זריקת תגבור של קטמין בלבד שווה את ½ את k המקורי / x המינון.</li>
	<li>לגלח את החולדה לאורך הקו האמצעי הגבי מן המותניים זווית נחות השכם. משוך את העור של החיה מתוח על גילוח קל יותר ומדויק יותר.</li>
	<li>משחה אופטלמולוגיות חלות על שתי העיניים.</li>
	<li>החל חיטוי לאזור מגולח כדי לעקר את האתר. עבור בסבך שיחים הראשון, משרים גזה סטרילית עם 5% יודיפלור תמיסה, נגבי כל שיער ופסולת. ללכת עם לסחוב חד כיווני עם גזה סטרילית טבולים 70% אתנול, כך אין אזור שתתבצע פניה פעמיים. השתמש את אותה טכניקה עם מתחלפים יוד, ספוג אתנול גזה עוד פעמיים.</li>
</ol>3. הכנה השדה ואת כלי כירורגי
<ol><li>הכנת סט של כלי ניתוח בלוק הכוללים אזמל, rongeurs, עכברוש השן מלקחיים, מעיין מספריים, ועוצרי דימום, נקודת בינוני מעוקל מלקחיים, רטרקטורים או ווים משוקלל על ידי הסרת העטיפה הגלישה סטרילי כדי ליצור שדה סטרילי.</li>
	<li>פתח את חבילת כפפות כירורגי סטרילי ולמקם הגלישה כפפה סטרילית על השולחן. אשתמש במקום שדה סטרילי נוסף לכלים משומשים כדי למנוע זיהום של הגלישה סטרילי.</li>
	<li>ירידה להב סכין #10 בשטח סטרילי. אבטח את הפגיון. כדי אחיזה עם ועוצרי דימום. מיקום מלח סטרילית, 4.0 כרום תפר וחומרים כדי לשלוט הדימום כגון cauterizer, גזה סטרילית, סטרילי applicators שקצהו כותנה (בלידים שריר), או השאיבה או bonewax (בלידים העצם) במקום נגיש.</li>
	<li>להוציא את בעל החיים ולהגדיר אותו על בד סטרילי. במקום גזה מתחת לשלפוחית השתן לאיסוף השתן. להעלות אזור היעד עם מגבת מגולגלת מתחת בבטן. אם הוא זמין, מקם כרית החימום כירורגי מתחת הבד סטרילי, במיוחד עבור הליכים ארוכים יותר. הערה: עקרות חשוב במהלך ניתוח הישרדות. החזק בקבוק ספריי אתנול 70% על היד כדי לשמור על עקרות של ידיים בכפפות, מעקר חרוז שימוש אם מכשיר עקרות נמצא בסיכון, או בין ניתוחים בודדים.</li>
</ol>4. חשיפת בעמודה השדרה וזיהוי באתר laminectomy
<ol><li>לזהות את האזור שבו חתך בעור ייעשו על-ידי הקשה על האצבעות בעדינות על הצלע האחרונה כדי לאתר החוליה L1. שימוש זה כנקודת ציון, גורם חתך בעור 3-4 ס מ עם אזמל כירורגי #10 סיום רק נחות L1 לחשוף את השריר. להחזיק העור המתוח במריחה עדינה ולחץ בחוזקה עם הלהב האזמל כדי להבטיח חתך נקי.</li>
	<li>לחתוך ולהפיץ שמן שטחית עם מלקחיים ומספריים במידת הצורך. (בהתאם למטרה חוליה, שם או לא להיות כרית השומן גדולה משיטחי להקפיד השריר).</li>
	<li>מרגיש עבור התהליכים קוצניים על הדירה של הלהב באזמל או האצבע. לעיתים קרובות אזור קו האמצע יסומנו על-ידי "V" של fascia לבן משני צדדיו. לעשות חתך קטן rostral כדי לאפשר חדר תתפוס בצורה מאובטחת תהליך העליון עם עכברוש השן מלקחיים, ולאחר מכן לבצע קיצוצים ארוכה, עמוקה 2 קרוב התהליכים ככל האפשר. בנקודה העמוקה ביותר של החתך, ניתן לחוש המשטח הגבי של החוליות עם הלהב ומהדקים.</li>
	<li>החזק את השרירים לרוחב הצידה עם רטרקטורים או ווים משוקלל כדי לשפר את הראות. שרירים ברורה סביב התהליכים עם האזמל, מעיין מספריים או rongeurs כדי לקבוע את צורת הראש שלהם. הערה: זכור כי חוט השדרה לא להאריך את אורך מלא בעמודה השדרה, בתור חוט השדרה רקמות עצירות גוברת מוקדם בהתפתחות מאשר עצם. משמעות הדבר היא כי רמת בעמוד השדרה היעד עשוי להיות מתחת חוליה אחרת בשם.</li>
	<li>אתר את T11 ואת התהליכים טי12 ו- T13 הסמוך. הערה: סיוע המיקוד הנכון רמות בחוליות ניתן למצוא אטלס חוט השדרה של עכברוש, מחקרים קודמים בהתוויית ציוני דרך בהעכבר, אשר דומה מאוד במבנה בחוליות6,33. השאר תהליך קוצניים rostral כגון T9 ללא הפרעה לתת ציון דרך קו האמצע.</li>
</ol>5. ביצוע laminectomy
<ol><li>ברגע אזור המטרה זוהתה בצורה נכונה, לבצע laminectomies של היבטים הגבי של T11-T13. מורחים בעדינות החוליות כדי לחשוף את הרצועות בין-חולייתי, אשר הם אתרים טובים כדי להוסיף rongeurs עבור הנשיכה הראשונית של העצם. החזק את rongeurs בעמדה עצומות למחצה כדי להגדיל את שליטה טובה.</li>
	<li>להסיר את התהליכים קוצניים ואת ההיבט הגבי של החוליות על ידי לוקח ביסים קטנים עם rongeurs. יש להיזהר לא לגרום נזק לחוט השדרה או להפריע השכבה הקשה של המוח. הרם מעט עם המלקחיים השן עכברוש לעזור למשוך חוט השדרה מן החוליות, להקטין את הנטייה לפגוע בחוט השדרה רקמות.</li>
	<li>לנקות העצם משם מן האמצע כך ניתן לראות את כלי הדם קו האמצע. להשאיר חלון בבירור מציגה את הרקמה חוט השדרה והוא חינם של פסולת.</li>
	<li>לגעת בעדינות את חוט השדרה עם מלקחיים. בעלי חיים שעלולים לקפוץ ניגודיים גם אם המטוס הרדמה עמוקה. להחיל מספר טיפות של חומר מאלחש כגון לידוקאין ישירות על חוט השדרה כדי למנוע קפיצות במהלך ההליך הזרקה.</li>
	<li>לאבטח בעל החיים בעל עמוד השדרה על ידי והידק מלקחיים ייצוב תהליכים קוצניים rostral, סימטרית אל החלון laminectomy. הרימו את הבטן של החיה באמצעות בעל עמוד השדרה כדי לנטרל את השפעת תנועות נשימה. זה להגביר את היציבות המחט ולהבטיח המתאים עומק ההזרקה.</li>
</ol>6. טעינת וירוס והמיקום של מזרק
<ol><li>לטעון וירוס לתוך מזרק pipetting כ 5 µL על חתיכת מצלמות-מיקרוסקופים, מיקום המחט כך הטיפ הוא בתוך הטיפה.</li>
	<li>השתמש את micropump כדי למשוך µL עד 4 של וירוס בקצב של 20 – 100 nL/s.</li>
	<li>להגדיר את בקר להזריק ולשחרר כמות קטנה של הווירוס המחט כדי להבטיח שקצה המחט אינה חסומה. . תנגב את וירוס עודף עם מגבון מעבדה. הערה: מזרק המילטון עם מחט פלדה עשוי לשמש כחלופה פיפטות זכוכית משך.</li>
	<li>מקם את micromanipulator כך שגלוי בסולם ורניה ומקם את המחט בקו האמצע של חוט השדרה. הערה: האמצע יכול לפעמים להיות ממוקמת על ידי כלי דם גדולים פועל על המשטח הקדמי של חוט השדרה. עם זאת, יכולים להשתנות בחולדות בודדים, קו האמצע מיקוד צריך להיות מאושרות by comparison with תהליכים קוצניים ללא פגע.</li>
	<li>לכוון את המחט רוחבית על ידי 0.8 מ מ באמצעות סולם ורניה על micromanipulator.</li>
	<li>להנמיך את המחט בחוט השדרה עד הוא הסטה פנימה, אך לא ניקב, השכבה הקשה של המוח. באמצעות תנועה מהירה ומפותלים, לנקב השכבה הקשה של המוח עם המחט עד הוא שוקע לעומק של 1.5 מ מ.</li>
</ol>7. הזרקת את וירוס לתוך חוט השדרה
<ol><li>ברגע שהמחט נמצאת במקום, התוכנית מזרק להזרקת בקצב של 400 nL לדקה אשר את הוירוס נכנס חוט השדרה על ידי התבוננות התקדמות החזית לצבוע. צריך להיות. אין נזילה ברור או בולטות של חוט השדרה רקמה. אם נוצרת דליפה, ניתן להקל זה לפעמים על-ידי הפחתת מהירות הזרקת ל nL 200/min.</li>
	<li>מרגע סיום ההזרקה, תאפשר את המחט בתוך חוט השדרה למשך 2-5 דקות (בהתאם נפח מוזרק) כדי להקל על דיפוזיה של הנגיף.</li>
	<li>לאט לאט למשוך את המחט ולהעביר אל האתר הזרקת הבא. מזריקים µL 1 של וירוס לתוך כל אחד 6 אתרים המרווחות באופן שווה בערך 1 מ מ אחד מהשני לאורכו של הרקמה בעמוד השדרה L1-L4. באותה המחט עשוי לשמש עבור כל זריקה כל עוד הוא ממשיך לתפקד כראוי.</li>
</ol>8. פצע הסגר, שלאחר טיפול
<ol><li>הסר את החיה ממחזיק בעמוד השדרה, להוציא רטרקטורים או ווים נעשה שימוש כדי להפיץ את השריר לרוחב. ודא הפצע ברורים של כל פסולת לפני הסגירה.</li>
	<li>תפר את השריר באמצעות בתפר לאללה כרום 4.0. לחתוך חוטי תפירה קרוב על מנת להפחית את הסבירות של גירוי בעור הפנים.</li>
	<li>להדק את העור סגור באמצעות קליפים 9 מ מ פצע. כדי לאפשר לריפוי אופטימלי, בשורה את הקצוות של העור לפני הידוק.</li>
	<li>במקום החיה על הסעת חום המים התחממות משטח וצג עד כשקשה לי לישון.</li>
	<li>להזריק 5 – 10 מ ל תמיסת סטרילית subcutaneously לחדש נוזלים, אנטיביוטיקה כגון צפאזולין כדי למנוע זיהום. כאשר החיה אמבולטורי, למקם אותו לכלוב הביתה ומספקים הראשונית משככי כאבים.  לנטר את החולדות לסימן של כאב ומצוקה ולנהוג לפי נוהל שלך IACUC אושרה לטיפול של כאב.</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

הנדסה גנטית של נוירונים במוח ובחוט השדרה שימש גולת חושית, מוטוריים, מסלולים אוטונומי באמצעות מעקב פלורסנט, וכן לבחון את פוטנציאל לצמיחה מחודשת של ספינלי עצביים לאחר פציעה27,28, 29 , 30 , 31 , 32 , 33. ישיר הזרקה של וקטור ויראלי יביל retrogradely לתוך חוט השדרה ניתן לייעד אוכלוסיות עצביים באמ...

וקטורים ויראלי הם כלים ביולוגי חשוב יכול להציג חומר גנטי לתוך התאים על מנת לפצות על גנים פגומים, upregulate צמיחה חשוב חלבונים או מייצרים חלבונים סמן המדגישות את המבנה ואת קשרים סינפטיים של המטרות שלהם. מאמר זה מתמקד הזרקה ישירה של וקטור lentiviral retrogradely הניתנים להעברה יעילה במיוחד לתוך חוט השדרה חולדה כדי לסמן מסלולים מוטוריים הגדולות עם עקיבה פלורסנט.  שיטה זו גם מאוד מתאים ללימודי רגנרציה ומחזור לצמיחה מחודשת עצב להציג חלבונים עניין לתוך אוכלוסיות מגוונות של נוירונים, נעשה שימוש כדי להשתיק את הנוירונים עבור מיפוי פונקציונלי מחקרים1,2.
חלק מהפרטים האנטומי של מסלולים מוטוריים בעמוד השדרה היו מבואר דרך הזרקה ישירה מחקרים עם המשדרים קלאסית כגון BDA ופטור-זהב3,4,5,6,7 , 8. המשדרים הללו נחשבים תקן הזהב, אבל אולי יש חסרונות מסוימים כגון ספיגת מאת אקסונים פגומים או אקסונים בקטע של החומר הלבן שמסביב זריקה באתר9,10,11 . זה יכול להוביל פירושים שגויים של מסלול קישוריות, יכול להיות חיסרון במחקרים התחדשות איפה לצבוע הקליטה על-ידי אקסונים פגומים או קטוע אפשר לטעות, ולשם רגנרציה סיבי במהלך ניתוח מאוחר יותר12.
וקטורים lentiviral פופולריים במחקרים טיפול גנטי, כפי שהם מספקים יציב, לטווח ארוך ביטוי אוכלוסיות עצביים13,14,15,16,17,18 ,19. עם זאת, באופן מסורתי הארוזה וקטורים lentiviral יכול מוגבלת רטרוגרדית תחבורה, עשוי לעורר את התגובה של המערכת החיסונית כאשר נעשה שימוש ב- vivo4,20,21. וקטור תחבורה יעיל רטרוגרדית כינה HiRet הופק על ידי קאטו et al. על-ידי שינוי של מעטפת נגיפית עם גליקופרוטאין וירוס הכלבת ליצירת וקטור היברידית המשפרת תחבורה רטרוגרדית22,23.
עקיבה רטרוגרדית מציג וקטור לתוך מרחב סינפטית של נוירון המטרה, ולאפשר לו להיות נלקח על ידי האקסון של תא זה, מועבר לגוף התא. הובלה מוצלחת של HiRet הוכח הסינפסות עצביים לתוך מוחותיהם של קופים ועכברים23,24 ומן לשריר לתוך מוטורי לגלוקוז22. פרוטוקול זה מדגים הזרקה לתוך חוט השדרה המותני, המכוון את מסופי סינפטית של propriospinal interneurons, גזע המוח נוירונים. מערכת העצבים ההיקפית לקבל חיבורים רבים מסלולים שונים בעמוד השדרה, ובכך יכול להיות מנוצל כדי להתמקד אוכלוסיה מגוונת של הנוירונים בחוט השדרה, גזע המוח. נוירונים שכותרתו במחקר זה מייצגים המעגלים innervating מוטור נוירון בריכות הקשורים בתפקוד המוטורי hindlimb. תיוג חזקים נתפסת חוט השדרה, גזע המוח, כולל פרטים דיוק גבוה של דנדריטים ובשבילים, מסופי האקסון. גם השתמשנו בשיטה זו במחקרים קודמים בתוך חוט השדרה הצווארי לתייג propriospinal, גזע המוח reticulospinal מסלולים25.
פרוטוקול זה מדגים הזרקה של וקטור ויראלי לתוך חוט השדרה המותני של חולדה. כפי שניתן לראות סרט 1, החתך מכוון על ידי זיהוי החוליה L1 הממוקמת הצלע האחרונה. זה משמש כנקודת ציון סימטרית עבור חתך 3-4 ס מ זה חושף את מערכת השרירים מעל חוט השדרה L1-L4. Laminectomies ההיבטים הגבי של החוליות T11-T13 מבוצעים ואת מחט זכוכית משופע מכוונת 0.8 מ מ לרוחב קו האמצע, הוריד 1.5 מ מ עמוק לתוך החומר האפור להחדיר וירוס.

<table><tbody><tr><td>#10 להבי אזמל</td><td>Roboz</td><td>RS-9801-10</td><td>לשימוש עם אזמל.</td></tr><tr><td>מזרקים של 1 מ"ל</td><td>בקטון, דיקינסון ושות</td>' <td>309659</td><td>להזרקת IP להרדמה, זריקות דחף פוטנציאליות להרדמה וזריקות אנטיביוטיקה.</td></tr><tr><td>מזרקים של 10 מ"ל</td><td>בקטון, דיקינסון ושות</td>' <td>309604</td><td>להזרקת מי מלח לבעל החיים, לאחר הניתוח.</td></tr><tr><td>4.0 תפר כרומי Catgut</td><td>DemeTECH</td><td>NN374-16</td><td>לקשירת שריר מחדש במהלך הסגירה.</td></tr><tr><td>48000 Micropipette Beveler</td><td>World Precision Instruments</td><td>32416</td><td>משמש לשיפוע קצות צינורות נימי הזכוכית הנמשכים ליצירת מחטי זכוכית פונקציונליות.</td></tr><tr><td>5% תמיסת יוד</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>L01020-08</td><td>לשימוש בעיקור של אתר הניתוח.</td></tr><tr><td>70% אתנול</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>לעיקור מחטי זכוכית שהוכנו לאחרונה, מודלים של בעלי חיים במהלך ההכנה הכירורגית וידי המנתח במהלך הניתוח, כמו גם כל שאר השמירה הקלה על סטריליות.</td></tr><tr><td>חומר הרדמה (תמיסת קטמין/קסילזין)</td><td>Zoetis</td><td>240048</td><td>לשמירה על בעל החיים במישור ההכרה הנכון במהלך הניתוח.</td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה (Cefazolin)</td><td>West-Ward Pharmaceuticals</td><td>NPC 0143-9924-90</td><td>להזרקה תת עורית למניעת זיהום לאחר הניתוח.</td></tr><tr><td>מעקר חרוזים</td><td>CellPoint</td><td>5-1450</td><td>לעיקור חום של מכשירים כירורגיים.</td></tr><tr><td>שעוות עצם</td><td>Fine Science Tools</td><td>19009-00</td><td>לאיטום עצם במקרה של דימום בעצם.</td></tr><tr><td>Cauterizer</td><td>Fine Science Tools</td><td>18010-00</td><td>לאיטום עורקים או ורידים שנחתכו במהלך הניתוח כדי למנוע אובדן דם מוגזם.</td></tr><tr><td>משקל דיגיטלי</td><td>Okaus</td><td>REV.005</td><td>לשקילת החיה במהלך ההכנה הכירורגית.</td></tr><tr><td>חיבור מחט גמיש</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td>לניקוי מחטי זכוכית והעמסת שמן אדום למחטי זכוכית.</td></tr><tr><td>קצף ג'ל</td><td>פייזר</td><td>H68079</td><td>לאיטום עצם במקרה של דימום בעצמות.</td></tr><tr><td>צינורות נימי זכוכית</td><td>World Precision Instruments</td><td>4878</td><td>למחטי זכוכית משוכות - יש לתכנן עבור מזרקי ננו-ליטר.</td></tr><tr><td>קוצץ שיער</td><td>אוסטר</td><td>111038-060-000</td><td>לניקוי אזור הניתוח משיער.</td></tr><tr><td>המוסטטים</td><td>Roboz</td><td>RS-7231</td><td>לשימוש כללי בניתוחים.</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td>לשימוש כללי בניתוחים.</td></tr><tr><td>מלקחיים מעוקלים בנקודה בינונית</td><td>Roboz</td><td>RS-5136</td><td>לשימוש כללי בניתוחים.</td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור עם סולם Vernier</td><td>Kanetec</td><td>N/A</td><td>למיקוד מדויק במהלך הניתוח.</td></tr><tr><td>מספריים מיקרו Roboz</td><td></td><td>RS-5621</td><td>לחיתוך לחישות זכוכית מצינורות נימי זכוכית טריים שנמשכו.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ עם אור וסולם ורניר Ocular</td><td>Leitz Wetzlar</td><td>N/A</td><td>משמש להדמיה ומדידה של שיפוע של צינורות נימי זכוכית משוכים לתוך מחטי זכוכית פונקציונליות.</td></tr><tr><td>בקר משאבת MicroSyringe</td><td>World Precision Instruments</td><td>62403</td><td>לשליטה בקצב ההזרקה.</td></tr><tr><td>Nanoliter 2000 מזרק ראש משאבה</td><td>World Precision Instruments</td><td>500150</td><td>לטעינה והזרקת וירוס בצורה מבוקרת.</td></tr><tr><td>חולץ מחטים</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td>לחימום ופירוק צינורות נימי זכוכית ליצירת מחטי זכוכית.</td></tr><tr><td>משחת עיניים</td><td>Dechra מוצרים וטרינריים</td><td>RAC 0119</td><td>להגנה על עיני החיה במהלך הניתוח.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>כדי לסייע בהעמסת הנגיף לתוך הננו-מזרק.</td></tr><tr><td>מחטי PrecisionGlide (25G x 5/8)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305122</td><td>לשימוש עם מזרקי 1 מ"ל ו-10 מ"ל כדי לאפשר הזרקה של דגם החיה.</td></tr><tr><td>מלקחיים לשן חולדה</td><td>Roboz</td><td>RS-5152</td><td>לאחיזה בתהליכים קוצניים.</td></tr><tr><td>שמן אדום</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>לספק חזית להדמיה של הנגיף הנכנס לרקמה במהלך ההזרקה.</td></tr><tr><td>מחזירים</td><td>Roboz</td><td>RS-6510</td><td>כדי להחזיק את פצע הניתוח פתוח.</td></tr><tr><td>טבליות רימדיל</td><td>Bio Serv</td><td>MP275-050</td><td>לטיפול בכאב לאחר הניתוח.</td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Roboz</td><td>RS-8300</td><td>להסרת שריר מעמוד השדרה במהלך הניתוח.</td></tr><tr><td>ידית להב אזמל</td><td>Roboz</td><td>RS-9843</td><td>לפרוס עור פתוח וכרית שומן של דגם בעלי חיים במהלך הניתוח.</td></tr><tr><td>מספריים</td><td>Roboz</td><td>RS-5980</td><td>לשימוש כללי בניתוחים.</td></tr><tr><td>קליפס פצע גניבת אל חלד</td><td>CellPoint</td><td>201-1000</td><td>כדי לקשור את עור הפצע הניתוחי במהלך הסגירה.</td></tr><tr><td>מלקחיים להסרת סיכות</td><td>קנט סיינטיפיק</td><td>INS750347</td><td>כדי להסיר את הסיכות, אם יש ליישם אותם בצורה לא נכונה.</td></tr><tr><td>בד סטרילי</td><td>Phoenix Research Products</td><td>BP-989</td><td>כדי לספק משטח סטרילי לניתוח.</td></tr><tr><td>אפליקטורים סטריליים עם קצה כותנה</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td>לספיגת דם בפצע הניתוחי תוך שמירה על סטריליות.</td></tr><tr><td>גזה סטרילית</td><td>Covidien</td><td>2146</td><td>לניקוי אזור הניתוח וכלי הניתוח תוך שמירה על סטריליות.</td></tr><tr><td>תאגיד הבריאות בקסטר</td> <td>סטרילי</td><td>281324</td><td>לשימוש בניקוי דם ולהחלפת נוזלים לאחר ניתוח.</td></tr><tr><td>כפפות כירורגיות</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>לשימוש על ידי המנתח לשמירה על שדה סטרילי במהלך הניתוח.</td></tr><tr><td>כרית חימום כירורגית</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>לשמירה על טמפרטורת הגוף של דגם החיה במהלך הניתוח.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ כירורגי</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>להדמיה משופרת של הפצע הניתוחי.</td></tr><tr><td>מהדק כירורגי</td><td>קנט סיינטיפיק</td><td>INS750546</td><td>למרוח את הסיכות.</td></tr><tr><td>משאבת מים לטיפול בחום T / Pump</td><td>Gaymar</td><td>TP500C</td><td>כדי לשאוב מים חמים לתוך כרית חימום הסעת המים.</td></tr><tr><td>כרית חימום הסעת מים</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>L1K018</td><td>לשימוש באזור ההתאוששות לאחר הניתוח לשמירה על טמפרטורת הגוף של החיה חסרת ההכרה.</td></tr><tr><td>ווים משוקללים</td><td>N/A</td><td>N/A כדי</td><td>להחזיק את פצע הניתוח פתוח.</td></tr></tbody></table>

הזרקה ישירה של וקטור lentiviral מדגיש מספר מסלולים מוטוריים בחוט השדרה עכברוש

Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord

היכרות עם חלבונים עניין לתוך תאים במערכת העצבים הוא מאתגר עקב המונעים ביולוגית מולדת להגביל את הגישה רוב המולקולות. הזרקה ישירות לתוך חוט השדרה רקמות עוקף מחסומים אלה, והיא מספקת גישה אל גוף התא או synapses איפה ניתן לשלב מולקולות. שילוב טכנולוגיה וקטור ויראלי בשיטה זו מאפשר החדרת גנים היעד לתוך רקמות עצבים לצורך ריפוי גנטי או מערכת עקיבה. כאן וירוס מהונדס להעברה רטרוגרדית יעילים ביותר (HiRet) הוא הציג את הסינפסות של propriospinal interneurons (מערכת העצבים ההיקפית) כדי לעודד תחבורה ספציפית את הנוירונים בחוט השדרה, גזע המוח גרעינים. פילוח מערכת העצבים ההיקפית מנצל הקשרים רבים שהמוענק להם מסלולים מוטוריים נרחבים של rubrospinal ו- reticulospinal, כמו הקישוריות שלהם אחד עם השני לאורך חוט השדרה מקטעים. נציג מעקב באמצעות וקטור HiRet בפרטים צורונים פעילים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מראה דיוק גבוה של תא גופות, אקסונים ו דנדריטים ובשבילים מערכת העצבים ההיקפית בית החזה, reticulospinal נוירונים ב רשתית pontine. HiRet משלבת גם לתוך משעולים גזע המוח, מערכת העצבים ההיקפית, אבל מראה והשתלבות נוירונים בדרכי corticospinal תלוי גיל. לסיכום, הזרקת חוט השדרה באמצעות וקטורים ויראלי הוא שיטה מתאימה על ההקדמה של חלבונים עניין לתוך הנוירונים של יישוב שטחים.

הזרקת מוצלחת ותעבורה של וקטור ויראלי צריכה לגרום התמרה חושית של אוכלוסיה חזקה של נוירונים חד-צדדית בחוט השדרה, גרעינים מסויימים גזע המוח. איור 1 מדגים תיוג סטריאוטיפית של נוירונים, אקסונים בחוט השדרה החזי ואת ב רשתית pontine של גזע המוח-הזרקת שלאחר ארבעה שבועות. ביטוי משמעותי GFP נתפסת בנוירונים בתוך החומר האפור של חוט השדרה החזי בצד חולשת על הזריקה (איור 1A, באזור ממוסגר). כמה נוירונים גם הן נצפו בצד contralateral, במיוחד ליד האמצע. בתוך החומר הלבן, ביטו...

פרוטוקול זה מדגים הזרקה של וקטור ויראלי יביל retrogradely לתוך רקמות חוט השדרה חולדה. וקטור שצולמו הסינפסה, מועברים לגוף התא של נוירונים היעד. מודל זה מתאים רטרוגרדית העקיבה של מסלולים בעמוד השדרה חשוב או תאים מיקוד ליישומים טיפול גנטי.

הזרקה ישירה של וקטור Lentiviral מדגיש מספר מסלולים מוטוריים בחוט השדרה עכברוש

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. ...

וקטורים ויראליים יכולים להכניס חומר גנטי לתאים כדי לפצות על גנים פגומים, כדי לווסת חלבוני צמיחה חשובים, או לייצר סמנים שיכולים לעקוב אחר מעגלים עצביים. החדרת וקטורים ויראליים למערכת העצבים היא מאתגרת בשל מחסומים ביולוגיים innate. הזרקה ישירה לרקמת חוט השדרה עוקפת את המחסומים הללו, ומאפשרת גישה לגופי תאים או סינפסות.מיקוד נכון של רמות עמוד השדרה L1 עד L4 יכול להיות קשה. חשוב להשתמש בציוני דרך כדי לאמת את היעד ולזכור כי מקטעים אלה קו לחוליות T11 כדי T13. ביום ההליך, חבר את המזרק למשאבת המיקרו והצב את המיקרו-משאבה במיקרומניפולטור עם סולם ורנייה יותר.השתמש במזרק עם מחט גמישה כדי לטעון בזהירות צבע צבעוני לתוך אחד מחטי הזכוכית ולהכניס את מחט הזכוכית לתוך המזרק. לאחר מכן לאשר כי המחט הוא זרע כראוי לתוך הכביסה, כי מכסה מזרק הוא דפק על חזק, כי מחט מזרק פלדה הוארך כשלושה רבעים של אורך מחט הזכוכית. לפני תחילת ההליך, להפשיר לפחות microliter אחד, בתוספת נפח קטן של וירוס נוסף לכל זריקה מאחסון מקפיא, ולאשר חוסר תגובה של קמצוץ הבוהן בחולדה הרדמה.לגלח לאורך קו האמצע הגבי מן הירכיים אל הזווית הנחותה של עצם השכם של החיה, מושך את העור מתוח עבור גילוח קל ומדויק יותר, ולחטא את העור החשוף עם רציף 5% יוד ו 70% קרצוף אתנול. החל משחה עיניים על שתי העיניים. לאחר מכן מניחים את החיה על מטלית סטרילית ומ מניחים גזה מתחת לשלפוחית השתן כדי לאסוף כל שתן.כדי לזהות את האתר של חתך העור, לחץ על האצבעות בעדינות בצלע האחרונה כדי לאתר את חוליית L1. באמצעות חוליה זו כציון דרך והחזקת העור מתוח על ידי התפשטות עדינה תוך לחיצה בחוזקה עם האזמל, להשתמש מספר 10 להב כירורגי לעשות חתך עור שלושה עד ארבעה סנטימטרים מסתיים רק נחות L1 לחשוף את השריר. השתמש מדפים ומספריים כדי להרגיש את התהליכים ספין.בצע חתכים rostral קטן כדי לאפשר מקום לתפוס בבטחה על תהליך עליון עם מטלשי שן עכברוש. ולעשות שני חתכים ארוכים ועמוקים קרוב ככל האפשר לתהליכים. לאחר הבטחת השרירים הצליריים במקום, לנקות את השריר סביב התהליכים כדי לקבוע את צורת הראש שלהם.לאחר מכן לדמיין את הצורות של ראשי התהליכים ספין על מנת לזהות את האתר laminectomy. T11 ותהליכי T12 ו T13 מצטרפים יהיו האתר של כריתת למין. לאחר אזור היעד זוהה כראוי, בעדינות להפיץ את החוליות כדי לחשוף את הרצועות הבין חולייתיות, ולהשתמש rongeurs לקחת ביסים קטנים של התהליכים ספיני ואת ההיבט הגבי של החוליות.לנקות את העצם מן קו האמצע, כך כלי הדם קו האמצע ניתן לראות, משאיר חלון החושף בבירור את רקמת חוט השדרה והוא ללא פסולת. ואז להדק מטלטולים מייצבים לתהליכים ספיניים rostral ו caudal לחלון כריתת למין כדי לאבטח את החיה במחזיק עמוד השדרה. ולהרים את הבטן של החיה כדי לשלול את ההשפעה של תנועות נשימה.כדי לטעון את הנגיף לתוך המזרק, פיפטה כחמישה מיקרוליטרים של המניה המופשרת על פיסת Parafilm, ולמקם את מחטי הזכוכית כך הקצה הוא בתוך הטיפה. השתמש במשאבת מיקרו כדי למשוך עד ארבעה microliters של וירוס בקצב של 20 כדי 100 nanoliters לשנייה, ולהגדיר את הבקר להזריק לפני שחרור כמות קטנה של וירוס מן קצה המחט כדי להבטיח כי הוא לא חסום. לנגב כל וירוס עודף עם לנגב במעבדה ולמקם את micromanipulators כך סולם vernier גלוי.מניחים את המחט במרכז חוט השדרה, ולהשתמש בסולם vernier על micromanipulator לכוון את המחט באופן אלחוטי 0.8 מילימטרים. לאחר מכן הורידו את המחט לאקורד עמוד השדרה עד שהוא מוסט פנימה, אך לא מנקב, את הדורה, ולהשתמש בתנועה מתפתלת מהירה כדי לנקב את הדורה עם המחט עד שטיפ המחט שקע לעומק של 1.5 מילימטרים. ברגע המחט היא במקום, לתכנת את המזרק כדי לספק את הנגיף בקצב של 400 nanoliters לדקה, ולאשר כי הנגיף נכנס אקורד עמוד השדרה על ידי התבוננות ההתקדמות של חזית הצבע.לאחר סיום ההזרקה, אפשר למחט לנוח בחוט השדרה במשך שתיים עד חמש דקות כדי להקל על דיפוזיה של הנגיף, לפני משיכת המחט לאט למיקום באתר ההזרקה הבא. לאחר הזריקה האחרונה, הסר את החיה ממחזיק עמוד השדרה כדי לאפשר הסרה של כל המכשירים המשמשים להפצת השרירים הדחחיים. לאחר מכן סגור את השריר עם תפר קטגוט כרומי 4.0 ולהדק את העור עם פצע תשעה מילימטר קליפים.ארבעה שבועות לאחר זריקה מוצלחת, ביטוי GFP משמעותי נצפתה בנוירונים בתוך החומר האפור של חוט השדרה החזי בצד, ipsilateral להזרקה. בעניין הלבן, ביטוי GFP נצפתה האקסונים בכבל ipsilateral, במיוחד באזורים האופייניים האקסונים propriospinal. הגדלה גבוהה יותר של נוירוני החומר האפור חושפת דוגמה לביטוי אות טיפוסי בגופי תאים עצביים ודנדריטים.ביטוי GFP בנוירונים ניתן לראות גם בגרעין גזע המוח, כגון בתוך היווצרות הרשתית פונטין. הגורמים העיקריים להליך מוצלח של הזרקת חוט השדרה הם מיקוד חולייתי נכון והבטחת כניסת הנגיף לרקמה אם מבוצעת פגיעה בחוט השדרה לפני הליך זה, ניתן להשתמש בהזרקה ישירה כדי לעקוב אחר נוירונים המ לחדש את הקשרים סביב הפציעה.

direct-injection-lentiviral-vector-highlights-multiple-motor-pathways

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מקור: Smit, R. D., et al. התמקדות בדרכי הקורטיקו-ספינל בחולדות יילודים עם וקטור ויראלי כפול באמצעות ניתוחי מוח ועמוד שדרה משולבים. J. Vis. Exp. (2021)סרטון זה מדגים את המסירה הממוקדת של וקטורים נגיפיים לנוירונים קורטיקו-ספינליים בחולדה שזה עתה נולדה. הפרוטוקול מאפשר ביטוי גנים מדויק באמצעות הזרקות נגיפיות אנטרוגרדיות ורטרוגרדיות, מה שמקל על מחקר על התחדשות עצבית ופלסטיות לאחר פגיעה בחוט השדרה.

העברה ויראלית ממוקדת לנוירונים קורטיקו-ספינליים בחולדה יילודים כדי לחקור פגיעה בחוט השדרה

סרטון זה מדגים את התהליך של הזרקת וקטור ויראלי לתוך חומר החולדה השחור כדי למדל מחלת פרקינסון. הוא מתאר את השלבים להכנת החולדה, הזרקת המיקרו של הווקטור הנגיפי לתוך החומר השחור, ואת הליך ההתאוששות.

הזרקה וקטורית ויראלית לתוך חומר החולדה ניגרה למידול מחלות נוירודגנרטיביות

מקור: Keefe, K. M., et al. הזרקה ישירה של וקטור לנטי-ויראלי מדגישה מסלולים מוטוריים מרובים בחוט השדרה של החולדה. J. Vis. Exp. (2019).סרטון זה מדגים את הזרקת וקטור ויראלי יעיל ביותר להובלה לאחור (HiRet) לחוט השדרה של החולדה כדי לעקוב אחר מסלולים עצביים. לנגיף יש גליקופרוטאינים לכניסה סינפטית וגן מקודד חלבון פלואורסצנטי. המחט מוחדרת לחוט השדרה, ותרחיף הנגיף ניתן בקצב מבוקר. המחט נשלפת לבסוף לאחר מתן מספיק זמן לדיפוזיה ויראלית.

הזרקת וקטור ויראלי לחוט השדרה של החולדה למעקב עצבי לאחור

וקטורים ויראליים לאפשר למניפולצית גן ממוקדת. אנחנו מדגימים את שיטה לביטוי גנים מותנים או אבלציה בחוט שדרת העכבר, באמצעות הזרקת stereotaxic של וקטור ויראלי לקרן האחורית, אתר בולט של קשר הסינפטי בין afferents החושיים הראשוניים ועצב של מערכת העצבים המרכזית.

הזרקת Stereotaxic של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית מותנית בחוט השדרה המאוס

כאן אנו מדגימים טכניקה להתמרה עצבית נרחבת על ידי הזרקה תוך-חדרית של נגיף הקשור לאדנו למוח העכבר היילוד.  שיטה זו מספקת דרך מהירה וקלה להשיג ביטוי לכל החיים של טרנסגנים המועברים באופן ויראלי.

הזרקת נגיפי Intracerebroventricular של ילודים עכבר המוח לתמרה עצבית מתמשכת ונרחבת

מערכת CRISPR / Cas9 מציעה את הפוטנציאל להפוך הגנום ממוקד עריכה נגישה ובמחיר סביר לקהילה המדעית. פרוטוקול זה נועד להדגים כיצד ליצור וירוסים אשר מפסיד יוצאים גן של עניין באמצעות מערכת CRISPR / Cas9, ואז מזריקים אותם stereotaxically לתוך מוח העכבר הבוגר.

תכנון, אריזה, משלוח של רטרו CRISPR כייל גבוה ו Lentiviruses באמצעות Stereotaxic הזרקת

שיטות משלוח הגן רחב היקף מערכת העצבים המרכזית בחולדה מכוסים. בדוגמה זו, המטרה היא לחקות מחלה המשפיעה על חוט השדרה כולו. התמרה חושית רחבה יכול לשמש כדי לספק חלבון טיפולית מערכת העצבים מהמינהל, היקפי חד פעמי.

שיטות וטיפים על עירוי לוריד של Adeno-הקשורים וירוס חולדות והערכה של מערכת העצבים המרכזית התמרה חושית

תוך הזרקה של recombinase תלויה רקומביננטי adeno-הקשורים וירוס (rAAV) ניתן להשתמש כדי לטפל בכל סוג התא גנטית שכותרתה בחוט השדרה. כאן נתאר כיצד מגלי נוירונים ב הצופר הגבי של חוט השדרה המותני. טכניקה זו מאפשרת פונקציונלי חקירתו של המשנה נוירון מניפולציה.

הביטוי Adeno-הקשורים Transgene וירוס בתיווך בנוירונים מבחינה גנטית מוגדרים של חוט השדרה

מאמר זה שואפת לספק את המתודולוגיה עבור הטרנסגנזה לעדשה של עוברי החולדה באמצעות זריקות מרובות של השעיית וירוס לתוך החלל perivitelline הזיטה. חולדות נשים הזדווג עם זן גברי פורה עם צבע פרווה דומיננטי שונה משמש להפקת אמהות pseudopregnant אומנה.

הדור של חולדות הטרנסגניים באמצעות גישה וקטורית לנטינגיי

פרוטוקול זה מדגים שיטה חדשנית ליישום טיפולים גנטיים על תת-אוכלוסיות של תאים בחולדות ילודים בגילאים שלאחר הלידה 5-10 ימים על ידי הזרקת משנה כימוגנטית אנטרוגרדית לקליפת המוח הסומטומוטורית ורקומבינאז Cre הניתן להובלה רטרוגרדית לחוט השדרה הצווארי.

התמקדות במערכת הקורטיקוספינלית בחולדות ילודים עם וקטור דו-ויראלי באמצעות ניתוח משולב של המוח ועמוד השדרה

מתואר הליך כירורגי לביצוע זריקות לתוך בור המים המותני של החולדה הצעירה. גישה זו שימשה להעברה תוך-תאית של וקטורים של ריפוי גנטי, אך צפוי כי גישה זו תוכל לשמש למגוון טיפולים, כולל תאים ותרופות.

משלוח וקטורי תוך-תאי בחולדות צעירות באמצעות הזרקת בור מים מותני

למד הזרקה ישירה של וקטור Lentiviral לחוט שדרה עכברוש לצורך מעקב רטרוגרדי אחר מסלולים עצביים. שיטה זו מאפשרת מיפוי מעגלים עצביים ויישומי טיפול גני.

הזרקה ישירה של וקטור Lentiviral מדגיש מספר מסלולים מוטוריים בחוט השדרה עכברוש

גלה סרטונים נוספים