Name: Immunostaining של Myelinating Organotypic פרוסה אסטרוציטומה תרבויות והכנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: למדו שיטת אימונוהיסטוכימיה לתרביות פרוסות אורגנוטיפיות ממוח עכברים לחקר מיאלינציה ושיקום מיאלין במערכת העצבים המרכזית. שיטה זו שומרת על ארכיטקטורת הרקמה ומאפשרת הדמיה חיה וסקרינג תרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ד ר שון פרימן, ד ר נטלי סול-Foulon, ד ר תומס רו להערות יקר על כתב היד. עבודה זו מומן על ידי INSERM, ICM, מענקים ARSEP R13123DD, R17127DD ANR (כדי לספירה) ואחווה עקרות, SPF20110421435 (כדי לספירה) FDT20170437332 (ל. מ. ת). אנו מודים המתקן תרבות תא CELIS, את icm. פלטפורמת הדמיה חשבים.

כל העבודה המערבות בעלי חיים תאמו מדיניות מוסדית המנחים שקבע את UPMC, INSERM ואת צרפתית הקהילה האירופית םיאנתל 86/609/EEC.
1. הכנת בינוני תרבות ותרבות מוסיף (תרגולים זמן ≈ 10-15 דקות)
הערה: לבצע שלב זה בשכונה תרבות זרימה בתנאים סטריליים
<ol><li>להכין 40 מ של תרבות בינוני, אשר מורכב של 50% BME, של 25% האנק מאוזנת תמיסת מלח (1 x), 25% חום-לא פעיל סוס סרום, בתוספת נגזרות גלוטמין 2 מ מ, 100 IU/mL פניצילין-סטרפטומיצין, 4.5 מ"ג/מ"ל D-גלוקוז. להתאים את ה-pH ל 7.4.</li>
	<li>מסנן-לעקר את המדיום דרך מסנן μm 0.22 הותאם על מזרק פלסטיק 50 מל. הערה: תרבות בינוני ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך לפחות שבוע.</li>
	<li>לשימוש רגיל המליטה גורים 6, שתי צלחות 6-ובכן סטרילי. על כל צלחת, להסיר את המכסה ומוסיפים 1 מ"ל של תרבות בינוני לכל טוב.</li>
	<li>הוספה תרבות המקום לבאר כל בודדים על-ידי החזקת הקצה פלסטיק עם מלקחיים סטרילי. שים את המכסה בחזרה על הצלחת. הערה: הפרוסות אסטרוציטומה שנאסף גור אחד (6-8) יכול ישוגר על שתי ממברנות (3-4 פרוסות אסטרוציטומה לכל ממברנה הוספה).</li>
</ol>2. הכנת לנתיחה בינוני (תרגולים זמן ≈ 5 דקות)
הערה: לבצע שלב זה בשכונה תרבות זרימה בתנאים סטריליים
<ol><li>הכן 100 מ של דיסקציה בינוני, אשר מורכב של Gey מאוזנת תמיסת מלח בתוספת פניצילין D-גלוקוז ו- 1 x 4.5 מ"ג/מ"ל – סטרפטומיצין (100 IU/mL כל).</li>
	<li>מסנן-המדיום דרך יחידת מסנן μm 0.22 לחטא. הערה: ניתן לאחסן המדיום לנתיחה ב 4 מעלות צלזיוס למשך חודש לפחות.</li>
	<li>הוסף 5 מ של ניתוח קר בינונית 60 מ מ תא תרבות מנות. להכין צלחת תרבות תא 60 מ"מ אחת עבור כל pup ניסויים.</li>
	<li>לשמור את הכלים לנתיחה על הקרח עד השימוש.</li>
</ol>3. הכנת חומר לנתיחה (≈ הידיים על הזמן 15 דקות)
<ol><li>לנקות את הספסל עם 100% אתנול.</li>
	<li>לעקר כל כלי חיתוך, סכין גילוח, פלטפורמה המסוק רקמות פלסטיק עם 100% אתנול.</li>
	<li>לתקן את להתגלח, פלטפורמת פלסטיק על המסוק רקמות ולהתאים את עובי חיתוך מיקרומטר 300.</li>
	<li>ודא כי כל האתנול התאדו לפני שמתחילים את הקרע.</li>
</ol>4. CerebellumDissection והכנות מקטעים (≈ זמן הידיים על 15-20 דקות לכל בעל חיים)
<ol><li>הציבו אחד של 60 מ מ תא תרבות מאכלים המכילים המדיום לנתיחה כקרח תחת המיקרוסקופ המשקפת ולהסיר את הפלטה.</li>
	<li>לנקות את הראש הפרווה עם 70% אתנול (בזהירות הימנעות נוגע בעיניים של בעל החיים), לערוף את החיה באמצעות מספריים חדות גדול, על פי הנוהל שאושר. הערה: הפרוסות אסטרוציטומה נוצרים של עכברים P9-P10 ללא מין ספציפי או זן הטיה.</li>
	<li>השתמש מספריים קטנות כדי לחתוך את העור לאורך הקו האמצעי של הראש מתחיל מהצוואר, עומד המחסום העכבר.</li>
	<li>. תחזיק את הראש ולחשוף את הגולגולת, מקפלים בחזרה את העור ventrally מתחת לראש, צבוט שני קפלי העור בין אצבעותיו.</li>
	<li>הכנס בעדינות את המספריים קטן מאגנום נקב וחותכים את הגולגולת על-ידי הפיכת אחד לרוחב החתך לכיוון הצד ולאחר מכן לחתוך סביב הגולגולת ראש. שמור את קצה המספריים כמו במקביל וקרוב הגולגולת ככל האפשר תוך כדי חיתוך, כדי למנוע נזק לרקמת המוח.</li>
	<li>אחזר את החלק הגבי של הגולגולת באמצעות מלקחיים בסדר-ישר. כשאתם מרימים בזהירות את החלק הגבי של הגולגולת, לחתוך את קרומי המוח adhering (שקוף שלחין ממברנה מסביב לרקמת המוח) במידת הצורך עם מספריים קטנות כדי למנוע נזק לרקמת המוח.</li>
	<li>בזהירות להציג בסדר-ישר מלקחיים (או לחלופין להשתמש במרית) בין הגולגולת הגחוני של המוח, בעדינות להעיף המוח, לחתוך את הראייה ואת העצבים המשולש עם מספריים קטנות.</li>
	<li>לעזור למוח לשחרר על-ידי כוח המשיכה לתוך המנה תרבות תא 60 מ מ המכיל ניתוח קר כקרח בינוני על-ידי הפעלת הראש הפוך בדיוק מעל המנה ולשחרר את ההדבקויות האחרון עם מספריים קטנות, במידת הצורך.</li>
	<li>בעזרת מלקחיים בסדר, להתמצא המוח עם הצד הגבי בפני החוקר, הצד הבטני שוכב על החלק התחתון של המנה.</li>
	<li>תחת המיקרוסקופ דו-עינית, השתמש המלקחיים בסדר-ישר כדי לשתק את המוח על הצד הקדמי ואת להימנע מלגעת hindbrain את, כמו זה יכול להיפגע. להפריד את hindbrain משאר חלקי המוח (קידמה - ו המוח האמצעי, ראה מפרטים טכניים על דמות 1Aa), באמצעות מלקחיים בסדר-ישר. להפרדת המוח הקטן משאר hindbrain, השימוש המלקחיים בסדר לחתוך את peduncles אסטרוציטומה מתחת המוח הקטן (ראה מפרטים טכניים על איור 1Aa').</li>
	<li>ברגע המוח הקטן הוא מבודד, בזהירות תקרע מעליך קרומי המוח באמצעות מלקחיים בסדר-ישר (ראה מפרטים טכניים על איור 1Aa').
</li>
	<li>החזק את המוח הקטן בעדינות עם המלקחיים מעוקל בסדר ומניחים אותו עם הצד הגבי למעלה על הפלטפורמה פלסטיק בניצב המסוק גילוח (ראה מפרטים טכניים על דמות 1Bb).</li>
	<li>תשאף כל עודף של דיסקציה בינונית סביב המוח הקטן באמצעות טיפ פיפטה דק-end סטרילי הותאם על 1 מ"ל פיפטה (ראה מפרטים טכניים על דמות 1Bb).</li>
	<li>ודא כי המוח הקטן מניח שטוח, אבל היא לא מתוח, מהרגע ששמים על הפלטפורמה כדי לקבל פרוסות הסאגיטלי אופטימלית במהלך אופטים (ראה סכמטית על איור 1Bb).</li>
	<li>פורסים μm בעובי 300 הסאגיטלי מקטעים של הצרבלום עם המסוק רקמות (ראה מפרטים טכניים על איור 1Bb'). הכוח ואת המהירות של הלהב חייב להיות מותאם על האתר.</li>
	<li>בעדינות להוסיף טיפה של דיסקציה בינוני על גבי פרוסות המוח הקטן. באמצעות טיפ רחב נשא פיפטה ממוקמת על פיפטה 1 מ"ל, לאט תשאף המוח הקטן הפרוס ולהעביר אותו בחזרה לתוך המנה תרבות תא 60 מ מ המכיל ניתוח קר כקרח בינוני (ראה מפרטים טכניים על איור 1Bb ').</li>
	<li>לנקות פלטפורמה רקמות. המסוק פלסטיק עם 100% אתנול בין כל המוח הקטן עם פרוסות. תן האתנול מתאדים לפני הצבת הקטן הבא על הפלטפורמה.</li>
	<li>להשתמש שני פיין-ישר מלקחיים (או לחלופין טיטניום מחטים) להפריד את הפרוסות הנפרדות, לבחור 6-8 פרוסות vermis (ראה מפרטים טכניים על דמות 1Cc ו 1Cc').</li>
	<li>לקחת צלחת 6-ובכן עם תרבות מוסיף ולהעביר ל-4 פרוסות שנבחרו על תרבות אחת הוספה יחד עם כמה בינוני לנתיחה, באמצעות טיפ רחב נשא פיפטה הותאם על פיפטה 1 מ"ל (ראה מפרטים טכניים על 1Cc דמות ').</li>
	<li>מניחים את הפרוסות באמצע תותב תרבות באמצעות ניתוח בינוני או מלקחיים כדי לדחוף ולמשוך אותם בעדינות לתוך במיקום הנכון, הימנעות להם להיות בקשר עם אחד את השני (ראה מפרטים טכניים על 1Cc דמות ').</li>
	<li>הסר כל עודף של דיסקציה בינונית סביב פרוסות באמצעות טיפ דק-end פיפטה. להבטיח הפרוסות להשתטח על הקרום (ראה מפרטים טכניים על 1Cc דמות ').</li>
	<li>מקם את הצלחת 6-ובכן לתוך החממה מיד לאחר שיש להוסיף את הפרוסות על הקרום.</li>
</ol>5. פרוסות תרבות, Demyelination (תרגולים זמן ≈ 15-20 דקות)
הערה: לבצע שלב זה בשכונה תרבות זרימה בתנאים סטריליים
<ol><li>החלף את המדיום תרבות 1 מ"ל לכל טוב של טרום ומחוממת ו במאגר בינוני תרבות טריים כל 3 ימים לאחר הכנה פרוסה.</li>
	<li>עבור demyelination, הסר כל תרבות בינוני שלהלן מוסיפה התרבות אחרי 6 ימים במבחנה (DIV) ולהחליף אותו עם 1 מ"ל לכל טוב של טרום ומחוממת בינוני תרבות טריים המכילים 0.5 מ"ג/מ"ל LPC. תקופת דגירה של 15-17 h ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.</li>
	<li>לאחר דגירה, לשטוף את המכסים על-ידי הצבתם בצלוחית 25 מ מ המכיל 1 מ"ל של מדיום תרבות ומחוממת מראש. הערה: השרוול צריך להיות בקשר עם המדיום, אבל שלא יהיה מכוסה על-ידי אותו.</li>
	<li>להעביר מיד את הכיסויים תרבות בצלחת 6-ובכן חדש המכיל טרי בינוני תרבות ומחוממת מראש.</li>
	<li>החלף את המדיום תרבות 1 מ"ל של מדיום תרבות מתוקים ומחוממת מראש כל 2-3 ימים עד פרוסות קיבעון.</li>
</ol>6. אימונוהיסטוכימיה (הפעם תרגולים ≈ 1:30 – 2 h)
הערה: לבצע את השלבים 6.1. ל 6.3. ברדס fume. להימנע תערוכות כדי paraformaldehyde (PFA) ולהפנות גליון הנתונים של המוצר בטיחות נאותה מניפולציה והגנה.
<ol><li>שימוש מלקחיים להרים כל תרבות מוסיף על-ידי החזקת הקצה פלסטיק ולהסיר את המדיום תרבות מתחת הכיסויים קרום מכל קידוח.</li>
	<li>לסדר את פרוסות אסטרוציטומה במשך 30 דקות על-ידי הוספת 2 מ של 4% PFA 1 x PBS pH 7.4 על התוספות ממברנה. הערה: נקודת הזמן של קיבעון תלויה השלב של myelination למד: 4 DIV המתאים תחילתה של myelination, DIV 7 פרוסות מלא סיבי העצב. במקרה של טיפול LPC, מקביל 9 DIV פסגת demyelination, DIV 11 תחילתה של remyelination ו- DIV 14 פרוסות remyelinated באופן מלא.</li>
	<li>לשטוף את הכיסויים עם הפרוסות שלוש פעמים עם PBS 1 x 2 מ ל 10 דקות.</li>
	<li>להפריד את הפרוסות הכיסויים קרום מתחת למיקרוסקופ המשקפת באמצעות סימן x 25 עד 30 x הגדלה, על-ידי בעדינות דוחף אותם בעזרת איזמל או מברשת. לחלופין, כדי למנוע את הסיכון של פגיעה הפרוסות תוך ניתוק אותם מן הקרום, להשתמש באזמל לחתוך את הקרום עם הפרוסות עדיין מחוברת.</li>
	<li>להעביר את הפרוסות צף לתוך הבארות של צלחת 4-ובכן המכיל 1 x PBS, בעזרת מברשת.</li>
	<li>האחות של PBS מכל קידוח, דגירה הפרוסות טרום מקורר 100% אתנול ב-20 מעלות צלזיוס למשך 15-20 דקות. שלב זה מאפשר חדירה נוגדן של סיבי סיבי העצב.</li>
	<li>האחות האתנול 100%, לשטוף פעם בקצרה עם 1 x PBS ולאחר מכן פעמיים ב- PBS 1 x 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>האחות של PBS, דגירה את פרוסות למשך 30 עד 45 דקות עם פתרון המכיל 1 x PBS, 5% המיתרים, דטרגנט ללא יונית 0.3% בטמפרטורת החדר כדי לחסום אתרים שאינם ספציפיים נוגדן קיבעון.</li>
	<li>האחות הפתרון חסימה. כביסה לא הכרחי.</li>
	<li>דגירה הפרוסות בין לילה עם נוגדנים העיקרי מעורבבת עם חסימת פתרון ב 4 º C. כדי להמחיש את המיאלין על פרוסות organotypic אסטרוציטומה, השתמש MBP (עוף, 1/150 או בעכבר IGg2b, Smi99, 1/200) או פיפ (עכברוש, ליפידים, 1/5-1/10) נוגדנים. הערה: כדי לחשוף את הביטוי של אנטיגן אחד או יותר בתוך הפרוסה אותו, לבצע כפול - או של טריפל מכתים ההליך (ראו איור 1 כדוגמה). כדי לבצע בו זמנית הדגירה, ודא נוגדנים העיקרי מיוצרים מינים שונים. לאחר מכן השתמש שלהם נוגדנים משניים המתאימים מצמידים fluorophores שונים (ראה טבלה של חומרים עבור קטרי, paranodal סמן18 נוגדנים).</li>
	<li>ביום השני, לשטוף את הפרוסות שלוש פעמים ב- PBS 1 x 10 דקות.</li>
	<li>תקופת דגירה של 3 שעות עם נוגדנים משניים מעורבבת עם חסימת פתרון (1/500 דילול) בחושך בטמפרטורת החדר. הערה: אופטימיזציה של דילול נוגדן וזמן הדגירה עלול להיות נדרש בעת שימוש נוגדנים אחרים מאלה המתוארים כאן.</li>
	<li>לשטוף את הפרוסות שלוש פעמים ב- PBS 1 x 10 דקות בחושך.</li>
	<li>תחת מיקרוסקופ דו-עינית, לטעון את הפרוסות על זכוכית. מקום µL 100 ל- PBS 1 x בשקופית ולהעביר את הפרוסות לתוך מגניב בעזרת מברשת. לגולל את הפרוסות במידת הצורך ולשטח אותם בשקופית. הסר כל עודף של PBS. במקרה immunolabeling מבוצע עם הפרוסות עדיין מחובר ממברנות, הר עם הפרוסות מול coverslip, עם הקרום על השקופית זכוכית.</li>
	<li>מקום טיפה של הרכבה בינונית ישירות על גבי coverslip זכוכית ומכסים בעדינות את הפרוסות. השקופית הממוסגרת ניתן לאחסן במשך כמה חודשים ב 4 ° C בחושך.</li>
</ol>

<ol><li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li>
<li>Desmazières, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+at+the+nodal+and+perinodal+axonal+domains%3A+a+basis+for+multiple+sclerosis+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis+Houndmills+Basingstoke+England%22%5BJournal%5D)">Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology.</a> Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).</li>
<li>Waxman, S. G., Ritchie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dissection+of+the+myelinated+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Molecular dissection of the myelinated axon.</a> Annals of Neurology. 33, 121-136 (1993).</li>
<li>Fünfschilling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolytic+oligodendrocytes+maintain+myelin+and+long-term+axonal+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity.</a> Nature. 485, 517-521 (2012).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendroglia+metabolically+support+axons+and+contribute+to+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration.</a> Nature. 487, 443-448 (2012).</li>
<li>Chang, K. -J., Redmond, S. A., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+myelination%3A+implications+for+mechanisms+of+neural+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Remodeling myelination: implications for mechanisms of neural plasticity.</a> Nature Neurosciences. 19, 190-197 (2016).</li>
<li>Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mechanism+of+nervous+system+plasticity%3A+activity-dependent+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A new mechanism of nervous system plasticity: activity-dependent myelination.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16, 756-767 (2015).</li>
<li>Nave, K. -A., Werner, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+of+the+nervous+system%3A+mechanisms+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Myelination of the nervous system: mechanisms and functions.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).</li>
<li>Nave, K. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+and+support+of+axonal+integrity+by+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myelination and support of axonal integrity by glia.</a> Nature. 468, 244-252 (2010).</li>
<li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiological Reviews. 81, 871-927 (2001).</li>
<li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 12, 400-403 (1953).</li>
<li>Meier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+observations+on+early+myelination+in+the+human+spinal+cord.+Light+and+electron+microscope+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Some observations on early myelination in the human spinal cord. Light and electron microscope study.</a> Brain Research. 104, 21-32 (1976).</li>
<li>Hori, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SIMPLIFIED+ACID+HEMATEIN+TEST+FOR+PHOSPHOLIPIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">A SIMPLIFIED ACID HEMATEIN TEST FOR PHOSPHOLIPIDS.</a> Stain Technology. 38, 221-225 (1963).</li>
<li>Gallyas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+staining+of+myelin+by+means+of+physical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neurological+Research%22%5BJournal%5D)">Silver staining of myelin by means of physical development.</a> Neurological Research. 1, 203-209 (1979).</li>
<li>Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje+cell+survival+and+axonal+regeneration+are+age+dependent%3A+an+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+An+Official+Journal+of+the+Society+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study.</a> Journal of Neuroscience An Official Journal of the Society of Neuroscience. 17, 3710-3726 (1997).</li>
<li>Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysolecithin+induces+demyelination+in+vitro+in+a+cerebellar+slice+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system.</a> Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).</li>
<li>Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+remyelination+in+culture--a+tool+for+multiple+sclerosis+research%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Central nervous system remyelination in culture--a tool for multiple sclerosis research.</a> Experimental Neurology. 230, 138-148 (2011).</li>
<li>Rasband, M. N., Peles, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nodes+of+Ranvier%3A+Molecular+Assembly+and+Maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The Nodes of Ranvier: Molecular Assembly and Maintenance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8, a020495(2015).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosciences+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neurosciences Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Hussain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+and+Nestorone+facilitate+axon+remyelination%3A+a+role+for+progesterone+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Progesterone and Nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors.</a> Endocrinology. , 3820-3831 (2011).</li>
<li>Wioland, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epsilon+toxin+from+Clostridium+perfringens+acts+on+oligodendrocytes+without+forming+pores%2C+and+causes+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Epsilon toxin from Clostridium perfringens acts on oligodendrocytes without forming pores, and causes demyelination.</a> Cellular Microbiology. 17, 369-388 (2015).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).</li>
<li>Medina-Rodríguez, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoting+in+vivo+remyelination+with+small+molecules%3A+a+neuroreparative+pharmacological+treatment+for+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Promoting in vivo remyelination with small molecules: a neuroreparative pharmacological treatment for Multiple Sclerosis.</a> Science Reports. 7, (2017).</li>
<li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+steps+of+oligodendrogenesis%3A+insights+from+the+study+of+the+plp+lineage+in+the+brain+of+chicks+and+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents.</a> Developmental Neurosciences. 23, 318-326 (2001).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+green+fluorescent+protein+in+the+oligodendrocyte+lineage%3A+a+transgenic+mouse+for+developmental+and+physiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of the green fluorescent protein in the oligodendrocyte lineage: a transgenic mouse for developmental and physiological studies.</a> Journal of Neuroscience Research. 70, 529-545 (2002).</li>
<li>Gibson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+promotes+oligodendrogenesis+and+adaptive+myelination+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain.</a> Science. 344, 1252304(2014).</li>
<li>Tomassy, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+profiles+of+myelin+distribution+along+single+axons+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Science. 344, 319-324 (2014).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+sensitive+optical+coherence+microscopy+for+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging.</a> Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).</li>
<li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322, 1857-1861 (2008).</li>
<li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+Schwann+cell+myelination+by+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).</li>
<li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li>
<li>Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+node+of+Ranvier+in+CNS+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologia.+%28Berlin%29%22%5BJournal%5D)">The node of Ranvier in CNS pathology.</a> Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).</li>
</ol>

אף אחד מחברי יש אינטרסים מתחרים או האינטרסים המתנגשים.

כאן, אנחנו פירוט פרוטוקול ליצירת אקסית vivo מודל המתאים התרבויות פרוסה organotypic אסטרוציטומה העכבר, המותאם ממשחק בעבר שיטות שפורסמו15,16,19 ו את המיאלין עוקבות immunostaining של ההכנות הללו. אסטרטגיה זו מציעה את האפשרות לדמיין המיאלין רכיבים עם ברזולוציה גבוהה מדינות גם בריא וגם פתולוגיים.
Organotypic אסטרוציטומה פרוסה שנלקחו בן יום-10 עכברים שהתרבויות דגם ניסיוני ומבוססת לחקור מנגנונים תאית המולקול...

הנוירונים הם תאים מאוד מקוטב, המהווים תא somato-דנדריטים שמקבל קלט מן הסביבה של האקסון המבטיחה את יצירתם והובלתם של דחפים חשמליים לתאים אחרים. התפשטות מהירה ומדויקת של מידע חיוני לתפקוד תקין של מערכת העצבים. גולגולת, זה בהנחייתם של myelination, אשר מאפשר הגדלת מהירות הולכה עצב1. המיאלין הוא מבנה מיוחדים הנוצרת על-ידי שכבות הדחוס של קרום פלזמה שנוצר על ידי myelinating עכשיו, דונלד, כלומר oligodendrocytes להפוך במערכת העצבים המרכזית (CNS) ותאי שוואן במערכת העצבים ההיקפית (מערכת העצבים ההיקפית). גם מערכת העצבים וגם את מערכת העצבים ההיקפית, axoglial אינטראקציות לנהוג היווצרות של תחומים עצב מיוחדים: את Ranvier של צמתי ו שלהם שמסביב תחומים, paranodes ו juxtaparanodes2. הקטעים עצב מבודדים על ידי המיאלין, או פרקי הגבעולים, לסירוגין עם Ranvier של צמתים, המקבילים לתחומים unmyelinated קטן מועשר בערוצים ממותגת מתח נתרן (Nav). ריכוז גבוה של הפעלה מהירה של ערוציv נה Ranvier של צמתי לאפשר לרגנרציה של פוטנציאל פעולה, ויחד עם המאפיינים בידוד של עטיפות המיאלין, להבטיח את הולכה saltatory מהיר ויעיל של הדחף העצבי לאורך האקסון3.
בנוסף לתפקידה ב מאיצה את מהירות הולכה של הדחף העצבי, עכשיו, דונלד myelinating מספק תמיכה מטבולית הדנדריטי לאקסון, שמירה על שלמותה לטווח ארוך והשתתפות שלה4,של הישרדות5. יתר על כן, כבר ברור בבשנים האחרונות שהמיאלין הזה הוא מווסת באופן דינמי לאורך החיים, ולכן יש להניח המשתתפים תקנה הפלסטיות של פונקציות שונות של מערכת העצבים. התאמות של ההתפלגות, מספר, האורך, עובי של עטיפות המיאלין לאורך אקסונים ובכך עשוי לייצג דרך מקורית לכוון דק שונים רשתות6,7,8. לכן, רכישת המיאלין האבולוציוני הוא תהליך מפתח עבור פונקציות חושית, מוטורי, קוגניטיבי, ההפרעות של אינטראקציה בין אקסונים עכשיו, דונלד יותר ויותר נחשב לתרום התפתחותי או רכשה נוירולוגיות מחלות9.
קומפוזיציה מיאלין מלווה, עם תכונה ספציפית של שיעור גבוה של שומנים (70%) בהשוואה חלבונים (30%) בניגוד ממברנות הסלולר10. עם זאת, בניגוד המיאלין שומנים, רוב החלבונים המיאלין הן ספציפיות המיאלין, כולל חלבון המיאלין הבסיסי (MBP), חלבון proteolipid (פיפ), 2', נוקלאוטיד 3'-מחזורית 3'-phosphodiesterase (CNP), הקשורים המיאלין גליקופרוטאין (מג), מיאלין-אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין (ש א), PMP-22, P010. שיטות שונות היסטולוגית כתם המיאלין קיים המבוסס על הרכב השומנים שלה, כגון Luxol מהר כחול11, סודאן שחור B12, של בייקר חומצה ותקיזו את דמה שיטת13, וכן כסף מכתים14. למרות זאת, גישות אלה אינם תמיד מאפשרים עבור ניגודיות הולמת וגם רזולוציה להמחיש סיבים בודדים. גישה חלופית לזהות המיאלין היא דרך אימונוהיסטוכימיה נגד חלבונים מיאלין. נוגדנים שונים יעד ספציפי המיאלין אנטיגנים עם ירידה לפרטים גבוה והוא יכול לשמש באופן שגרתי כדי לזהות מבנים סיבי העצב. האינטראקציה נוגדן-אנטיגן אשר ניתן עוד יותר לגילוי באמצעות נוגדנים משניים מצמידים fluorophore נגד נוגדן ראשוני, דמיינו פלורסצנטיות נאותה מיקרוסקופ. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול immunochemical כתם מיאלין ב- ex-vivo אסטרוציטומה פרוסות, מודל המאפשר לשימור טוב הארכיטקטורה רקמות עצבים. בנוסף, הארגון ואת גודל של תאי Purkinje (הנוירון סיבי העצב הבלעדית של הצרבלום) לגרום להם מודל קלאסי ללימודי אלקטרופיזיולוגיות, הם אידיאליים באופן דומה לביצוע מחקרים קבוע או הדמיה לחיות.
הפרוסות אסטרוציטומה נוצרים מן P9-P10 עכברים, זמן המתאים תחילת מוקדם Purkinje תא myelination, תהליך זה מושגת בעיקר בשבוע אחד ex-vivo (6-7 ימים במבחנה, DIV)15. יתר על כן, המודל הזה הוא מותאם כדי לחקור את המיאלין הפרעות כגון טרשת נפוצה (MS), כפי demyelination נרחבת יכולה להיגרם אסטרוציטומה פרוסות באמצעות myelinotoxic המורכב lysophosphatidylcholine (או lysolecithin, LPC), אשר ואחריו16,remyelination ספונטנית17. Remyelination אנדוגני מתקיים בין יומיים לאחר הסרת LPC של המדיום תרבות והוא כמעט מוחלט של שבוע לאחר הטיפול.
השלמתו של פרוטוקול זה לוקח 3 שבועות שנהנתם, כולל חצי יום הכנה תרבויות פרוסה אסטרוציטומה, שבוע כדי לקבל פרוסות מלא סיבי העצב, ואחריו 2 ימים כדי להגיע לשיא של demyelination, עוד שבוע עבור שלהם מלא remyelination. בנוסף, ניתן להשלים אימונוהיסטוכימיה 2 ימים. הפרוטוקול המתואר כאן מותאם בהמלטה סטנדרטי של 6 הגורים עכברים וצריך להתאים בנוגע למספר בעלי החיים שבהם משתמשים עבור הניסוי המתוכנן.

<table><tbody><tr><td>BME בינוני</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>41010026</td><td></td></tr><tr><td>האנק' s תמיסת מלח מאוזנת (10x HBSS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14180046</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>סרום סוסים מומת בחום</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין&ndash; סטרפטומיצין (10.000 יחב"ל/מ"ל)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Gey' s תמיסת מלח מאוזנת</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G9779-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת D-גלוקוז (45%)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G8769-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>ליזופוספטידילכולין (LPC)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>L4129-100MG</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד (PFA)</td><td>מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>אתנול מוחלט (100% אתנול)</td><td>כימיקלים VWR</td><td>20821.330</td><td>מקורר ב-20 מעלות; סי</td></tr><tr><td>טריטון&רג; X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>10% סרום עיזים רגיל (NGS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>500622</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת חיץ פוספט</td><td>EuroMEDEX</td><td>ET330-A</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>נוגדן נגד GFP (פוליקלונל, עוף)</td><td>Merck Millipore</td><td>06-896</td><td>דילול 1/300</td></tr><tr><td>נוגדן חלבון בסיסי נגד מיאלין (MBP) (פוליקלונל, עוף)</td><td>Merck Millipore</td><td>AB9348</td><td>דילול 1/150</td></tr><tr><td>נוגדן חלבון בסיסי נגד מיאלין (MBP) (חד-שבטי, עכבר IgG2b)</td><td>Merck Millipore</td><td>NE1019</td><td>דילול 1/200</td></tr><tr><td>נוגדן נגד PLP (חולדה, היברידומה)</td><td>מתנה מד"ר ק. איקנקה; אוקסאקי, יפן</td><td></td><td>דילול 1/5 עד 1/10</td></tr><tr><td>תעלת אנטי נתרן, נוגדן פאן (מונוקלונלי, עכבר IgG1, שיבוט K58/35)</td> <td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S8809</td><td>דילול 1/150</td></tr><tr><td>נוגדן נגד Caspr (פוליקלונל, ארנב)</td><td>Abcam</td><td>ab34151</td><td>דילול 1/500</td></tr><tr><td>נוגדנים משניים עזים מצומדים ל-Alexa Fluor 488, 594, 647 או 405</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>Dilution 1/500</td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>קוצץ רקמות</td><td>McIlwain</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סכיני גילוח</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מספריים גדולים</td><td>FST</td><td>14101-14</td><td></td></tr><tr><td>מספריים קטנים</td><td>FST</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים ישרים עדינים</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים מעוקלים עדינים</td><td>FST</td><td>11297-00</td><td></td></tr><tr><td>צלחות תרבית תאים (60 מ"מ ו-100 מ"מ)</td> <td>TPP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-, 6 בארות</td> תוספות תרבית <td>TPP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell (0,4 ומיקרו; מ', קוטר 30 מ"מ)</td><td>Merck Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>חממת</td><td></td><td></td> תרבית תאים <td>37&deg; C, 5% CO2</td></tr><tr><td>קצות פיפטה עדינות</td><td>Dutscher</td><td>134000CL</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה רחבות נשא</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific 2079G</td><td></td></tr><tr><td>מזרק סטרילי</td><td>Terumo Europe</td><td></td><td>20 או 50 מ"ל</td></tr><tr><td>מסנני מזרק סטריליים</td><td>Terumo Europe</td><td></td><td>0.22 & micro; </td></tr><tr><td>m אזמל</td><td>Swann-Morton</td><td>0510</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td> מברשת <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> RS צרפת 76 מ"מ x 26 מ"מ x 1.1 מ"מ <tr><td>כיסויי זכוכית</td><td>RS צרפת</td><td></td><td>22 מ"מ x 22 מ"מ</td></tr><tr><td>Kimtech Sciences מגבי רקמות</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>5511</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td></td><td></td> <td>משקפת</td></tr></tbody></table>

immunostaining של myelinating organotypic פרוסה אסטרוציטומה תרבויות והכנה

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

המיאלין במערכת העצבים, הוא מבנה הממברנה מורכבות שנוצרו על-ידי myelinating גליה תאים, אשר אקסונים ensheathes ומקל מהר וההולכה. שינוי המיאלין הוכח להופיע במחלות נוירולוגיות שונות, איפה היא מזוהה עם גירעונות פונקציונלי. כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של אקסית vivo דגם המורכב העכבר organotypic אסטרוציטומה פרוסות, אשר יכול להישמר בתרבות במשך מספר שבועות, עוד יותר להיקרא להמחיש מיאלין.

דוגמאות המיאלין נציג immunostainings לפרוסות אסטרוציטומה organotypic המתקבל P9-P10 C57black6 פראי-סוג (WT) (איור 2 א), כמו גם פיפ-GFP העכברים הטרנסגניים (איור 2B), יחד עם תאי Purkinje מכתים. שעוטף מן החומר הלבן אסטרוציטומה פרוסות מסלולים באזור הפרוסות לעבר הפריפריה הנמצא בניהול ו myelination של תאי Purkinje מושגת בעיקר לאחר 6-7 DIV. ב- 7 DIV, אינדוקציה של demyelination מלאה אפשרי דרך הטיפול LPC (איור 2Ci</str...

כאן אנו מציגים שיטה להכין organotypic פרוסה תרבויות מן המוח הקטן העכבר מיאלין, צביעת על-ידי אימונוהיסטוכימיה מתאים לחקור מנגנונים של myelination ו- remyelination במערכת העצבים המרכזית.

Immunostaining של Myelinating Organotypic פרוסה אסטרוציטומה תרבויות והכנה

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

שיטה זו מאפשרת ללמוד את המנגנון הבסיסי של מילינג ורמיאלציה ברמה התאית והטיסולרית. טכניקה זו נמצאת בצומת דרכים בין תרבויות ראשוניות וגישות vivo. זהו מודל מהיר ונגיש עם היתרון העיקרי של שמירה על ארכיטקטורת הרקמה.הפגנת ההליך תהיה מלינה ת'יות, פוסט דוקטורנטית ורמי רונאזאנו, דוקטורנטית מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, להכניס מספריים קטנים בעדינות לתוך מגנום foramen לחתוך את הגולגולת על ידי ביצוע חתך צדי אחד לכיוון הצד, ולאחר מכן לחתוך סביב כל גולגולת הראש. כדי לאחזר את החלק הגבי של הגולגולת, השתמש במטס דק וישר כדי להרים בזהירות את החלק הגבי של הגולגולת.ואז בזהירות להציג את המדפים בין גולגולת הגחון והמוח. בעדינות להעיף את המוח לחתוך את העצבים האופטיים והטריגמינליים עם מספריים קטנים. לאחר מכן, סובב את הראש או את החלק הגבי של הגולגולת במהופך ממש מעל צלחת תרבות תאים של 60 מילימטר המכילה מדיום ניתוח קר כקרח כדי לעזור למוח לרדת בכוח הכבידה.באמצעות מטלות עדין, לכוון את המוח עם הצד הגבי פונה כלפי מעלה ואת הצד הגחוני בשכיבה. מתחת למיקרוסקופ המשקפת, השתמש במקלות ישרות עדינות כדי לשתק את המוח בצד הקדמה. לאחר מכן, הפרד את המוח האחורי משאר המוח.חותכים את peduncles המוח הקטן מתחת למוח הקטן כדי להפריד את המוח הקטן משאר המוח האחורי. לאחר המוח הקטן מבודד, להשתמש עדין, מדפים ישר לקרוע בזהירות את קרום המוח. החזיקו את המוח הקטן בעדינות עם המדפים העדינים והמסובבים וה מניחים אותו עם הצד הגבי למעלה על גבי פלטפורמת הפלסטיק, בניצב אל סכין הגילוח של המסוק.לאחר מכן, עם קצה סטרילי, קצה דק פיפטה מחובר פיפטה מיליליטר אחד, שאפו כל גישה של מדיום ניתוח סביב המוח הקטן. לאחר מכן, עם מסוק רקמות, פרוסה 300 מיקרומטר עבה קטעים saggital של המוח הקטן. לאחר מכן, מוסיפים טיפה של מדיום ניתוח על המוח הקטן פרוס בעדינות.לאחר מכן, עם קצה פיפטה חזיר רחב מחובר פיפטה מיליליטר אחד, לאט שאפו את המוח הקטן פרוס ולהעביר אותו בחזרה לתוך צלחת תרבות התא 60 מילימטר המכיל קרח קר ניתוח בינוני. לאחר מכן, השתמשו בשני מדפים ישרים עדין כדי להפריד פרוסות בודדות. לאחר מכן, עם קצה פיפטה חזיר רחב מחובר פיפטה מיליליטר אחד, להעביר עד ארבע פרוסות נבחרות מן vermis, יחד עם כמה מדיום ניתוח על הכנס תרבות אחת של צלחת שש היטב.הסר כל גישה של מדיום ניתוח סביב הפרוסות באמצעות קצה דק טיפט. עבור demyelination, להסיר את כל התרבות בינוני מתחת לתרבות מכניס לאחר שישה ימים במבחנה, ולהחליף אותו עם מיליליטר אחד ל הבאר של אמצעי תרבות טרום מחומם, טרי המכיל 0.5 מיליגרם למיליליטר LPC. דגירה במשך 15 עד 17 שעות ב 37 מעלות צלזיוס בסביבה 5%פחמן דו חמצני.לאחר הדגירה, לשטוף את המכניסים על ידי הצבת אותם בצלחת פטרי 25 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של מדיום תרבות מחומם מראש. לאחר מכן, מיד להעביר את התרבות מכניסה חדש, שישה צלחת גם, המכיל טרי, מדיום תרבות מחומם מראש. כדי להתחיל אימונוהיסטוכימיה, ראשית להשתמש במטסים כדי להרים את התרבות מכניס ולהסיר את מדיום התרבות מתחתיהם.לאחר מכן, להוסיף שני מיליליטר של 4%PFA ב 1x PBS, ph 7.4, על מוסיף קרום כדי לתקן את פרוסות המוח הקטן. לאחר 30 דקות, לשטוף את הפרוסות שלוש פעמים עם שני מיליליטר של 1x PBS במשך 10 דקות כל לשטוף. לאחר מכן, מתחת למיקרוסקופ המשקפת, באמצעות הגדלה של פי 25 עד 30, השתמש באזמל או במברשת כדי לנתק בעדינות את הפרוסות ממוסיף הממברנה.לאחר מכן, השתמש במברשת כדי להעביר את הפרוסות הצפות לתוך בארות של צלחת ארבע בארות, המכיל 1x PBS כדי להגביל את צריכת הנוגדנים. לאחר מכן, שאפו את ה-PBS מכל באר והדקרו את הפרוסות באתנול מקורר מראש של 100% במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 15 עד 20 דקות. לאחר הדגירה, שאפו את האתנול 100% ושטפו את הפרוסות לזמן קצר עם פיב"ג אחד.לאחר מכן, לשטוף אותם פעמיים בטמפרטורת החדר עם 1x PBS במשך 10 דקות כל לשטוף. כדי לחסום אתרי קיבוע נוגדנים לא ספציפיים, שאפו את ה-PBS והדקרו את הפרוסות בתתב"ג המכיל 1x PBS, 5%NGS ו-0.3% חומר ניקוי יוני בטמפרטורת החדר למשך 30 עד 45 דקות. לאחר מכן, מוסיפים נוגדנים ראשוניים מדוללים בתפיסת החסימה ומדגרים את הפרוסות בארבע מעלות צלזיוס בן לילה.לאחר הדגירה לילה, לשטוף את הפרוסות שלוש פעמים עם 1x PBS במשך 10 דקות כל לשטוף. לאחר מכן מוסיפים את הנוגדנים המשניים, מדוללים בתפיסת החסימה, ביחס דילול של 1 עד 500 ומדגרים את הפרוסות בטמפרטורת החדר בחושך במשך שלוש שעות. לאחר הדגירה עם הנוגדן המשני, לשטוף את הפרוסות שלוש פעמים ב 1x PBS בחושך במשך 10 דקות כל לשטוף.לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ משקפת, מניחים 100 מיקרולטרים של PBS 1x על השקופית עם מברשת, להעביר את הפרוסות לתוך PBS ולשטח אותם על השקופית. הסר כל גישה של PBS. לבסוף, מניחים טיפה של מדיום הרכבה ישירות על החלקת מכסה הזכוכית בעדינות לכסות את הפרוסות.immunostainings Myelin בפרוסות המוח הקטן organotypic, המתקבל ימים שלאחר הלידה 9 עד 10 C57 שחור שישה עכברים מסוג בר נצפו ב 11 ימים במבחנה עם צמתים של ronviae מועשר בתמי נתרן מגודר מתח, מוקף על ידי תחום צומת אקסוגליאלי עלה. אותן תוצאות נצפו עבור עכברים מהופנטים PLP-GFP. מילינג של תאי parkengy מושגת בעיקר לאחר שבוע בתרבות.טיפול LPC demyelinates באופן מלא את הפרוסות, אשר remyelinate באופן ספונטני והם מיילין מלא שישה ימים לאחר demyelination. הליך זה צריך לקחת 25 דקות לכל היותר. זו באמת הנקודה הקריטית ביותר.תרבות פרוסות אורגנוטיפיק מתאימה לחקר הדמיה חיה של דינמיקת המיאלציה. זה יכול לשמש גם עבור מיקוד ניסויים הקרנת סמים. טכניקה זו מאפשרת גישה קלה וכמותית לחקר תהליכי מילינג ורמיאלציה.על הניסויים לפעול על פי נהלי הבטיחות הבסיסיים החלים על רווחת בעלי החיים, מיאלציה מוגזמת וחדה.

preparation-immunostaining-myelinating-organotypic-cerebellar-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

שיטה זו מתארת ​​את הדור של תרבויות cerebellar organotypic ואת ההשפעה של גירויים מסוימים אפופטוטיים על הכדאיות של סוגי תאים שונים cerebellar.

תרבויות cerebellar Organotypic: אתגרים אפופטוטיים וזיהוי

אנו מציגים פרוטוקול המאפשר להציג וכמותית לתחת המורפולוגיה של העץ הדנדריטי של תאים בודדים פורקינג' גדלו בתרבויות פרוסות cerebellar organotypic. פרוטוקול זה נועד לקדם מחקרים על המנגנונים של התפתחות הדנדריטים תא פורקינג'.

הניתוח של מורפולוגיה דנדריטים סלולרי פורקינג&#39; בתרבויות Slice Organotypic

סרטון וידאו זה מתאר שיטה ליצירת פרוסות רקמה מהמוח הקטן של העכבר. פרוסות המוח הקטן יכולות לשמש לתרבית אורגנוטיפית המספקת תובנות לגבי מנגנונים נוירו-התפתחותיים, כולל דינמיקה של מיאלינציה.

דיסקציה של המוח הקטן והכנת פרוסות: שיטה ליצירת פרוסות רקמה מהמוח הקטן של העכבר

סרטון זה מדגים טכניקה להשגת פרוסות אורגנוטיפיות של המוח הקטן ממוחו של גור עכבר וטיפוח הפרוסות במדיה בתוספת חומרים מזינים וגורמי גדילה כדי לחקות את התפתחות המוח הקטן במבחנה. בנוסף, פרוסות צרבלריות ספציפיות מטופלות בתרכובת בדיקה, ויכולת ההגנה העצבית של התרכובת מנותחת באמצעות טכניקת צביעה אימונופלואורסצנטית.

ניתוח הישרדות תאי Purkinje בתרביות פרוסות צרבלריות אורגנוטיפיות

מתוארת טכניקה לחקר תאי NG2 ואוליגודנדרוציטים באמצעות מערכת תרבית פרוסות של המוח הקדמי והמוח הקטן.  שיטה זו מאפשרת לבחון את הדינמיקה של התפשטות והתמיינות של תאים בתוך שושלת האוליגודנדרוציטים שבה ניתן לתפעל בקלות את הסביבה החוץ-תאית תוך שמירה על ציטו-ארכיטקטורת רקמות.

תרבויות Organotypic Slice ללמוד oligodendrocyte Dynamics וmyelination

כאן אנו מתארים טכניקה ללימוד neurogenesis לאחר הלידה בהיפוקמפוס באמצעות טכניקת התרבות הפרוסה organotypic. שיטה זו מאפשרת למניפולציה במבחנה של neurogenesis למבוגרים ומאפשרת היישום הישיר של סוכנים תרופתיים להיפוקמפוס התרבותי.

תרבויות Organotypic Slice ללימודים של אחרי לידה נוירוגנזה

במהלך התפתחות המוח הקטן לאחר הלידה, תאי גרגיר לא בשלים שמקורם באזור הנבט מציגים אופני נדידה מובהקים כדי להגיע ליעדם הסופי ולהקים רשתות עצביות. פרוטוקול זה מתאר את הכנת פרוסות המוח הקטן ואת הגישה המקרוסקופית הקונפוקלית המשמשת לחקירת הגורמים המווסתים את נדידת העצבים.

Ex Vivo הדמיה של נדידת תאי המוח הקטן אחרי הלידה גרגיר שימוש Confocal Macroscopy

חלבוני מעטפת גרעינית ממלאים תפקיד מרכזי בתהליכים ביולוגיים בסיסיים רבים והיו מעורבים במגוון מחלות אנושיות.  פרוטוקול זה מתאר מודל עכבר חדש מבוסס Cre/Lox המאפשר בקרה מרחבית-זמנית של שיבוש מתחמי LINC.

אימות של מודל עכבר לשבש מכלולי LINC באופן ספציפי בתא

השכבה החיצונית של המוח הקטנה הגרגר היא האתר של ההגברה המעבר הגדולה ביותר במוח המתפתח. כאן, אנו מציגים פרוטוקול למקד שינוי גנטי לשכבה זו בשיאו של שגשוג באמצעות vivo electroporation והתרבות של פרוסות המוח הקטן לשעבר מעובר חומוס עוברי יום 14.

אקס תרבות Vivo של פרוסות המוח הקטן אפרוח וממוקד מרחבית Electroporation של מבשרי תא גרגיר

תרביות פרוסות אורגאותיות הן כלי רב-עוצמה לחקר תהליכים נוירוהתפתחותיים או ניווניות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול כי מודלים המוות הנוירולוגי של תאים Purkinje בתוך העכבר המוח פרוסה בתרבויות. שיטה זו עשויה להועיל מחקר בגילוי של תרופות נוירוהגנה.

הישרדות התאים purkinje בתרביות פרוסה בלבלר

למדו שיטת אימונוהיסטוכימיה לתרביות פרוסות אורגנוטיפיות ממוח עכברים לחקר מיאלינציה ושיקום מיאלין במערכת העצבים המרכזית. שיטה זו שומרת על ארכיטקטורת הרקמה ומאפשרת הדמיה חיה וסקרינג תרופות.

Immunostaining של Myelinating Organotypic פרוסה אסטרוציטומה תרבויות והכנה

גלה סרטונים נוספים