תפוקה גבוהה שיגלה-Assay אחרים ספציפיים

בתחום המחקר Shigella חסרים כיום בדיקות מוגדרות היטב לבחינת התפקיד התפקודי של נוגדנים הנוצרים על ידי חיסון או זיהום. מבחן זה מייצג שיטה מוגדרת היטב כדי להעפיל תגובות חיסוניות אלה ולמדוד פעילות bactericidal של נוגדנים ספציפיים Shigella. היתרון העיקרי של תוואי זה הוא שהוא מאפשר ניתוח תפוקה גבוהה של דגימות מרובות.

הטכניקות המשמשות בפרוטוקול זה מפחיתות מאוד את זמן ההתמקמה הידיים ואת זמן ההתמקמה הכולל כדי למדוד הרג חיידקים ישיר של נוגדנים ודגימות סרום. כדי להתחיל, דגירה הדגימות באמבט מים חמים ב 56 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי לחמם ולהפעיל את דגימות הבדיקה. השג לוחית בדיקה ו- 20 מיקרוליטרים של מאגר הבדיקה לעמודות 1 עד 12 שורות A עד G.Add 20 מיקרוליטרים של מאגר הבדיקה לעמודות 1 ו-2 של H.Load 30 מיקרוליטרים של כל דגימת בדיקה ושכפל לשורה H של לוח הבדיקה.

כדי להתחיל לבצע דילולים סדרתיים משולשים של דגימות הבדיקה, השתמש בפיפיטה רב-ערוצית כדי להסיר 10 מיקרוליטרים מ בארות 3H עד 12H. העבר את הדגימות ל בארות המתאימות בשורה G ו pipette למעלה ולמטה 8 עד 10 פעמים כדי לערבב את המדגם היטב. לאחר מכן, להסיר 10 microliters מ בארות אלה.

העברה ל בארות המתאימות בשורה F ו pipette למעלה ולמטה 8 עד 10 פעמים לערבב. המשך תהליך דילול סדרתי זה דרך שורה A.לאחר ערבוב בארות בשורה A, להסיר ולהשליך 10 microliters מ בארות 3A עד 12A, כך הנפח הסופי בכל בארות הוא 20 microliters. לאחזר בקבוקון אחד של מלאי חיידקי יעד קפוא ולהפשיר אותו בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, לדלל את החיידקים ב 20 מיליליטר של חיץ מים. על פי גורם הדילול האופטימלי קבוע מראש. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של חיידקים מדוללים לכל באר של צלחת ההתב"צ.

לאחזר בקבוקון אחד של מחמאות ארנב תינוק קפוא בקבוקון אחד של חום קפוא מופעל BRC. השתמש במים זורמים קרים כדי להפשיר את הבקבוקונים לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש לערבב 100 מיקרוליטרים של BRC המופעלים באמצעות חום עם 400 מיקרוליטרים של מאגר בדיקה.

הוסף 50 מיקרוליטרים של פתרון BRC זה המופעל בחום של 20 אחוז לכל הבארים בעמודה הראשונה. מערבבים מיליליטר אחד של BRC מקורי עם ארבעה מיליליטר של מאגר מוצף. הוסף 50 microliters של תערובת זו 20 אחוז לכל בארות בעמודים 2 עד 12.

מניחים את הצלחת אחת שייקר צלחת במשך 10 עד 15 שניות כדי לערבב בעדינות את צלחת ההבטחה. להטמום את צלחת ההתזה באינקובטור מיקרוביולוגי במשך שעתיים. בינתיים, להסיר את המכסים משני צלחות אגר LB ולה מניחים את הצלחות עם הפנים כלפי מעלה ארון בטיחות ביולוגי במשך 40 עד 60 דקות להתייבש.

כאשר הדגירה הושלמה, מעבירים את צלחת ההתלהמות לקרח רטוב ודולרים במשך 10 עד 20 דקות כדי לעצור את התגובה. באמצעות פיפטה שתים עשרה ערוצים, מערבבים את בארות בשורה H וצלחת ספוט 10 microliters של תערובת התגובה על החלק התחתון של צלחת LBA. מיד להטות את הצלחת ולאפשר כתמים לרוץ על 1.5 עד 2 ס"מ.

חזור על הליך זה עבור שורות G, F ו- E, איתור אותם מעל השורה הקודמת. הדגירה צלחות LBA בטמפרטורת החדר עד הפתרון נספג לתוך צלחות LBA. לאחר מכן, לשים את המכסים על הצלחות ולהעביר אותם במהופך לתוך אינקובטור מיקרוביולוגי כדי להחמם לילה.

למחרת, להוסיף 25 מיליליטר של כיסוי אגר ב 55 מעלות צלזיוס, המכיל 100 מיקרוגרם למיליליטר TTC ו 0.1 אחוז נתרן אזיד לכל צלחת LBA. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים כדי לאפשר לחיידקים ששרדו לפתח צבע אדום. לאחר מכן, השתמש במצלמה דיגיטלית כדי לצלם את הצלחות.

העבר את התמונות למחשב ולהשתמש בתוכנת ספירת המושבה המשולבת של NIST כדי לנתח את התמונות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. צלחות LBA נציג להדגים כי פיתוח צבע התרחשה לאחר דגירה לילה ותוספת כיסוי, עם כל המושבות ששרדו להיות גלוי באדום. הרג חיידקים נראה בבירור עבור כל הדגימות שנבדקו בשלושת הדילולים הראשונים.

ירידה בהריגת חיידקים נתפסת כאשר דגימות מדוללות עוד יותר במעלה הצלחת והנסיוב פחות מרוכז. ספירות מיקרו-מושבה מבוצעות לאחר מכן באמצעות תוכנת NIST. לאחר מכן מחושבת ספירת CFU הממוצעת עבור כל דילול של כל מדגם, וכך גם ערך ההרג של 50 אחוז.

ערך הרג זה של 50 אחוז מוחל לאחר מכן על יחידות ה- CFUs הממוצעות עבור כל דילול סרום כדי לקבוע את הערכים הדרושים לחישוב SBA KI. פרוטוקול זה מסתמך על ציפוי חיידקי עקבי ואחיד על LB Auger. ציפוי נקודתי טוב וטכניקת הטיה יאפשרו צמיחה של מיקרו-כלים דיסקרטיים וספירת מושבות מדויקת. טכניקה זו משתמשת שיגלה ארסית חיה ודורש טכניקה aseptic המתאים PPE כדי להבטיח את החיידקים מטופלים בבטחה על פי BSL 2 נהלים.