Name: מדידת Cytometric ROS הייצור ב מקרופאגים בתגובה FcγR cross-linking (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-07T15:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 20 s
Description: למדו מדידת ROS במקרופאגים בתגובה ל-FcγR cross-linking באמצעות ציטומטריית זרימה וסונדות פלואורסצנטיות. שיטה זו מאפשרת הערכת תפקוד תאי חיסון ואבחון מחלות כמו CGD.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצה להודות חברים אחרים של המעבדה Tigno-ארנחואס כולל ומדלין ה. מילר, עומר קרדונה, Andjie Jeudy, Roopin סינג על עזרתם בתחזוקת המושבה האחזקה ועכבר מעבדה. תמיכה עבור מחקר זה סופק על ידי גרנט R00 HL122365 וקרנות סטארט-אפ J.T.T-איי

<ol><li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Oxygen+Species+and+Neutrophil+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).</li>
<li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).</li>
<li>Robinson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+in+phagocytic+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).</li>
<li>Thomas, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phagocyte+respiratory+burst%3A+Historical+perspectives+and+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances.</a> Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).</li>
<li>Fang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+actions+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial actions of reactive oxygen species.</a> MBio. 2 (5), (2011).</li>
<li>Iles, K. E., Forman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+signaling+and+respiratory+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Immunologic+Research%22%5BJournal%5D)">Macrophage signaling and respiratory burst.</a> Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).</li>
<li>Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+superoxide+production+by+granulocytes+from+patients+with+chronic+granulomatous+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease.</a> New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).</li>
<li>Good, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatal+%28chronic%29+granulomatous+disease+of+childhood%3A+a+hereditary+defect+of+leukocyte+function%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function.</a> Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).</li>
<li>Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+the+metabolic+activity+of+leukocytes+from+patients+with+a+genetic+abnormality+of+phagocytic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function.</a> Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).</li>
<li>Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pattern+of+genetic+transmission+of+the+leukocyte+defect+in+fatal+granulomatous+disease+of+childhood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood.</a> Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).</li>
<li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).</li>
<li>Held, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Introduction+to+Reactive+Oxygen+Species%3A+Measurement+of+ROS+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22White+Paper%22%5BJournal%5D)">An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells.</a> White Paper. , (2015).</li>
<li>Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+reactive+oxygen+species+measurement+in+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).</li>
<li>Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%27%2C7%27-Dichlorodihydrofluorescein+as+a+fluorescent+probe+for+reactive+oxygen+species+measurement%3A+Forty+years+of+application+and+controversy%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy.</a> Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).</li>
<li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation%3A+another+inconvenient+truth%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).</li>
<li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50586(2013).</li>
</ol>

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

DCFH2-DA ומבוסס-היא גילוי של ROS היא טכניקה נפוץ14,15. קלות שימוש והתאמה של אלה ROS זונדי תבניות microplate קינטי, קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ או זרימה cytometric ניתוח תרם הפופולריות שלהם. עם זאת, במחקרים שלנו של פונקציות מקרופאג בתיווך FcγR, שם לא נראה להיות פרוטוקול תקני עבור ביצוע וזמינותו הזה עבור ניתוח תזרים cytometric של תאים צולבים FcγR. בהתחשב באופי תגובתי של analytes המוערך, מצאנו כי התזמון היא בעלת חשיבות מכרעת לוודא כי הפארמצבטית מושגת. למ...

מינים חמצן תגובתי (ROS) הם מולקולות תגובתי או רדיקלים חופשיים, כי הם תוצר לוואי של נשימה אירובית (נבדקה ב 1). אלה כוללים את סופראוקסיד אניון, מי חמצן, מימן על-חמצני, רדיקלי הידרוקסיל ו יוני הידרוקסיל, בין היתר. בתנאים רגילים הפיזיולוגיות, ROS מיוצרים בעיקר על ידי המיטוכונדריה nicotinamide אדנין dinucleotide פוספט (ניקוטין) oxidases, הן במהירות מאושפרת על ידי אנזימים וחלבונים שונים כמו סופראוקסיד דיסמוטאז גלוטטיון. ייצור מוגזם ROS או פגם ביכולת להסיר ROS יכול לגרום סטרס חמצוני, לפיה מינים חמצן תגובתי לקדם את הנזק של חלבונים, ליפידים ו DNA שמוביל מתח סלולארית או מוות ועם מצבי מחלה פתולוגית. עם זאת, הוא מעריך כיום כי ROS יכול גם לפעול מולקולות איתות (חמצון-חיזור איתות), בתיווך ROS שינוי של מולקולות שונות שביל ביניים יכולים להשפיע על חילוף החומרים הסלולר, התפשטות, הישרדות, דלקתיות איתות, והתיישנות2. בתאים phagocytic, רוס ממלא תפקיד חיוני במתן פעילות מיקרוביאלית במהלך כביכול "פרץ הנשימה"1,3,4,5,6. במהלך התגובה של phagocytes לגירויים חיצוניים, מרכיבי אוקסידאז nadph ל מורכבים (p40phox, p47phox, p67phox) translocate מ ציטוזול למוח phagosomal המכילות את gp91phox ואת p22phox subunits, יחד עם הפעולות של Rac1/2, יוצרים מתפקדת במלואה nadph ל אוקסידאז האנזים מורכבים. אוקסידאז nadph ל שהורכב ואז מנצל nadph ל כדי לצמצם את החמצן סופראוקסיד בתוך חלולית phagosomal. סופראוקסיד אניונים ישירות יכול לגרום לנזק או להיות dismutated לתוך מימן על-חמצני. סופראוקסיד והן מימן על-חמצני יכול להגיב עם מולקולות אחרות ליצירת רדיקלים הידרוקסיל תגובתי. נזק מתווך התגובה של אלה ROS עם ברזל-גופרית אשכולות על חלבונים או על ידי גרימת חמצון הבסיס של ה-DNA, המוביל בסופו של דבר מוגבל מטבוליזם מיקרוביאלי או מוות של חיידק5. החשיבות של האנזים אוקסידאז nadph ל מורכבים של ROS המיוצרים במהלך הנשימה פרץ זה מודגם קלינית בחולים עם מחלת גרגירומת ממושכת כרונית (CGD)7,8,9, 10. אנשים עם CGD מחזיקים מוטציות בגן gp91phox, והתוצאה היא חוסר ייצור ROS, רגישות לזיהומים חוזרים ונשנים עם חיידקים ופטריות אשר אינם בדרך כלל בעיה עם immunocompetent יחידים. לכן, אם לומד חימצוני מתח, חמצון-חיזור איתות או הגנה המארח, להיות מסוגל למדוד ROS הייצור בזמן אמת הוא מאמץ שימושי.
כבר מנוצל מספר מבחני הפקה ROS מידה או בתוצאות של סטרס חמצוני11,12,13. בין אלה, אחד בשימוש נרחב ביותר הוא בדיקה פלורסנט 2', 7' dichlorodihydrofluorescein diacetate (2- DCFH DA)14. מולקולה זו הוא חסר צבע lipophilic. פעפוע של DCFH2-DA על פני קרום התא מאפשר לו להיות שכוונת מאת תאיים esterases, אשר deacetylates את זה לתוך DCFH2, טיוח זה תא אטום. הפעולות של מספר סוגים של ROS (מימן על-חמצני, peroxynitrite, הידרוקסיל רדיקלים, תחמוצת החנקן ו רדיקלים peroxy) DCFH2 נישחק זה לתוך DCF אשר פלורסנט (דיווח Ex / Em: 485-500 ננומטר/515-530 ננומטר), ניתן להבחין באמצעות זרם cytometer מצויד עם מסנן סטנדרטי עבור fluorescein (ערוץ FL1). סופראוקסיד אינו מגיב בחריפות עם DCFH2 אבל יכול להגיב עם dihydroethidium בדיקה נוספת (היא) להניב פלורסנט מוצר ה-2-hydroxyethidium (מוצרי פלורסנט סופראוקסיד תלויית חמצון יתר)15. המוצרים פלורסנט של חמצון היא שניתן לאתר באמצעות אורך גל של עירור של 518 ננומטר, אורך גל של פליטה של 605 ננומטר (ערוץ FL2). למרות פשוטה יחסית לשימוש, ניצול של אלה זונדי גילוי של ROS דורש ידע של המגבלות שלהם, תיאגוד זהיר מכתים תהליכים ובקרות לתוך וזמינותו מסוימת המבוצעת על מנת שיהיה תקף ניסיוני תוצאות ומסקנות. הפרוטוקול הבא מדגים את השימוש ערכת זמינים מסחרית העסקת אלה 2 רגשים שעיצב למדוד ROS cytometry זרימה. אנו כתם להתקפת מקרופאגים הנגזרות מח עצם עם אלו הגששים, זירוז ייצור ROS באמצעות FcγR cross-linking. אנו להציג נציג נתונים שהושגו באמצעות פרוטוקול זה, הלחץ המתאים אמצעי זהירות זה חייב להתבצע עבור ניסויים מוצלחים.

<table><tbody><tr><td>מחקר חדשני נגד BSA IgG1</td><td></td><td>IBSA9E2C2</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Rat IgG2b ו-kappa; איזוטיפ Ctrl נוגדן</td><td>BioLegend</td><td>400626</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד עכבר CD16/32</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד עכבר F4/80 מצומד ל-Alexa Fluor 647</td><td>BD Biosciences</td><td>565853</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד עכבר F4/80 מצומד ל-FITC</td><td>BioLegend</td><td>123108</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן CD11b נגד עכבר/אנושי מצומד ל-Alexa Fluor 647&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>101218</td><td></td></tr><tr><td>בטא-מרקפטואתנול (BME)</td><td>Sigma</td><td>M3148-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA) FractionV</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J&nbsp;</td><td>מעבדות ג'קסון</td><td>מלאי מס' 000664</td><td></td></tr><tr><td>CM-H2DCFDA</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>C6827</td><td>יכול להוות תחליף למגיב לזיהוי מתח חמצוני בערכת Enzo</td></tr><tr><td>Dihydroethidium (DHE)</td> <td>בדיקות מולקולריות</td><td>D11347</td><td>יכול להוות תחליף למגיב לזיהוי סופראוקסיד בערכת Enzo</td></tr><tr><td>DMEM 1x</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM ללא פנול אדום</td><td>Gibco</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>DMF נטול מים&nbsp;</td><td>Acros Organics</td><td>61094-1000</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat IgG2a, &kappa; איזוטיפ Ctrl נוגדן</td><td>BioLegend</td><td>400506</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>L גלוטמין</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>תאי LADMAC</td><td>ATCC</td><td>CRL-2420</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Corning</td><td>10-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>עכבר IFN-g</td><td>GoldBio</td><td>1360-06-100</td><td></td></tr><tr><td>N-אצטיל-L-ציסטאין</td><td>EMD Milipore</td><td>106425</td><td>יכול להוות תחליף למעכב/נבלות ROS בערכת</td></tr><tr><td>Enzo ציטומטר זרימה נובוציט עם דגימה אוטומטית</td><td>Acea</td><td>2060R</td><td></td></tr><tr><td>Pyocyanin (משרה ROS)</td> <td>10009594 כימי קיימן</td><td></td><td>יכול להוות תחליף למשרה בערכת Enzo</td></tr> ערכת <tr><td>ROS-ID ערכת זיהוי ROS/סופראוקסיד כוללת</td><td>ENZO</td><td>ENZ-51010</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט (100 מ"מ)</td><td>גיבקו</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.25%)</td><td>גיבקו</td><td>25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידת cytometric ros הייצור ב מקרופאגים בתגובה fcγr cross-linking

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

פרץ חימצוני או הנשימה משמש לתאר את צריכת החמצן מהירה ויצירת של מינים חמצן תגובתי (ROS) phagocytes בתגובה לגירויים שונים של מערכת החיסון. ROS שנוצר במהלך הפעלת המערכת החיסונית מפעילה פעילות מיקרוביאלית חזק בעיקר דרך היכולת של ROS נזק DNA, חלבונים, גרימת מוות של מיקרואורגניזמים. היכולת למדוד ROS ייצור reproducibly, בקלות הכרחי על מנת להעריך את התרומה של מסלולים שונים, מולקולות מנגנון ההגנה המארח. בנייר זה, אנו מדגימים את השימוש הגששים פלורסנט, flow cytometry לזהות ROS הייצור. למרות בשימוש נרחב, פלורסנט מדידה של ROS הוא מאד בעייתי, במיוחד בכל הנוגע מדידה של ROS שנגזרות לגירויים ספציפיים, לא mitogenic. אנו מציגים מתודולוגיה מפורט כדי לזהות ROS שנוצר בעקבות גירוי FcγR מסוים החל דור מקרופאג לקרקע, מכתים, FcγR cross-linking, סיום עם ניתוח תזרים cytometric.

באמצעות פרוטוקול שמתואר בתוך, אנו מציגים את הנתונים נציג הדגמת זיהוי cytometric זרימת הייצור ROS הנובע גירוי של WT C57BL/6J BMDMs דרך FcγR. כצפוי, שאנו צופים שינויים מינימאליים ב FL1 או FL2 זריחה מעל רקע רמות בתאי unstimulated (איור 3A, להשוות לעומת "מוכתם, unstimulated" נקודה "וללא רבב, unstimulated" מתווה). אנו מבחינים עלייה ב- FL1 ו- FL2 זריחה כאשר התאים הם גירוי עם FcγR cross-linking הסוכן (איור 3 א, להשוות בין "מוכתם, מגורה באמצעות Fc cross-linking" לעומת ד...

מחקר זה מדגים את השימוש cytometry זרימה כדי לזהות החמצן מגיב מינים (ROS) ייצור הנובע הפעלת FcγR. בשיטה זו ניתן להעריך שינויים מיקרוביאלית, חמצון-חיזור איתות הפונקציה של phagocytes בתגובה מכלולים חיסוניים, מיקרואורגניזמים opsonized או ישירות FcγR cross-linking.

מדידת Cytometric ROS הייצור ב מקרופאגים בתגובה FcγR cross-linking

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

מדידה של מיני חמצן תגובתי או ROS הוא בעייתי לשמצה. בסרטון זה, נדגים את המדידה לשחזור של ROS בתגובה להצלבת קולטן FC-גמא באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות וציטומטריית זרימה. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם הרבייה של ההתרשאות והשימוש בשיטה זו עם גירויים אנטיגניים ספציפיים, לא רק מיטוגנים או מעוררי ROS ידועים.ייצור ROS Dysregulated הוא מרכזי להתפתחות של מחלות רבות כגון מחלה גרנולומטוס כרונית או CGD. מדידה מדויקת של ROS יכולה להוות חלק אחד של האבחנה המולקולרית של CGD. לימוד ייצור ROS מתווך FC חשוב בחקר immunodeficiencies, כגון CGD, אלא גם בחקר מחלות אוטואימוניות, או מחלות ניווניות, שבו יותר מדי ROS מוביל ללחץ חמצוני ודלקת.העיתוי של ההתרגם הוא קריטי. הייתי מייעץ למישהו שמנסה את הפרוטוקול הזה בפעם הראשונה להתכונן ביסודיות ולעשות ניסוי מדומה במידת האפשר. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית על מנת להדגיש את צעדי ההתנסויות הזקוקות לתשומת לב מיוחדת כגון עיתוי ההתרגםות.כדי להתחיל, הכן מקרופאגים שמקורם במח העצם באמצעות מדיה מותנה כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר priming מקרופאגים לילה, שאפו את העל-טבעי ושטפו את התאים פעם אחת עם PBS. הסרום מרעיב את התאים על-ידי החלפת מדיה באותו אמצעי אחסון של DMEM עם סרום נמוך.עבור כל עכבר, צלחת אחת תטופל עם אנטי BSA IgG1 בעוד סרום רעב בעוד השני יישאר מטופל. הוסיפו רק DMEM עם סרום נמוך לצלחות שלא טופלו והוסיפו DMEM עם סרום נמוך המכיל 2.5 מיקרוגרם למיליליטר של מורין נגד BSA IgG1 לצלחות המטופלות. הקפד לכלול לוח אחד נוסף לא מטופל עבור כל ניסוי לפעול כבקרת פיצוי ציטומטרי זרימה.דגירה הצלחות ארבע שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. במהלך הדגירה של ארבע שעות, הכינו פתרון פי 2 לבדיקות של מיני החמצן תגובתי. עבור כל 10 מיליליטר של DMEM בסרום נמוך הדרושים, להוסיף ארבעה microliters של reagent גילוי סטרס חמצוני וארבעה microliters של reagent זיהוי סופראוקסיד.לאחר מכן, להכין את פתרונות בדיקה 2X המכיל רק את reagent זיהוי סטרס חמצוני או המכיל רק את reagent זיהוי סופראוקסיד. לאחר הדגירה של ארבע שעות, לקצור את התאים על ידי גירוד עדין של הצלחות, איסוף אותם בצינורות מסומנים, חמישה מיליליטר עם תחתית עגולה. צנטריפוגה הצינורות ב 750 פעמים g במשך חמש דקות.הקפד לעקוב אחר התאים שטופלו עם מורין נגד BSA IgG1. לאחר מכן, לשטוף את כדורי התא עם שני מיליליטר של PBS כדי להיפטר כל שאריות אנטי BSA מהתאים המטופלים. צנטריפוגה הצינורות ב 750 פעמים g במשך חמש דקות.לאחר מכן, שאף את ה- PBS ולחץ מחדש על גלולת התא ב- 600 מיקרוליטרים של DMEM עם סרום נמוך. מהשעיית תא 600 מיקרוליטר, aliquot 200 microliters לתוך צינורות תחתונים עגולים 5 מיליליטר prelabeled. מן התאים מטופלים, לקחת 200 microliters עבור צינורות שכותרתו unstimulated, 200 microliters עבור צינורות שכותרתו תמריץ חיובי, ו 200 microliters עבור הצינורות שכותרתו גורם חיובי בתוספת מעכב.לאחר מכן, מן התאים נגד BSA IgG1 מטופלים, לקחת 200 microliters עבור צינורות שכותרתו FC-גמא קולטן crosslinking, ו 200 microliters עבור צינורות שכותרתו קולטן FC-גמא crosslinking בתוספת מעכב. מהתאים הלא מטופלים שישמשו לבקרות פיצוי, יש ליטול 200 מיקרוליטרים עבור הצינור המסומנים כלא מזוהמים, 200 מיקרוליטרים לבקרת גרין פלוס תמריץ, ו-200 מיקרוליטר לבקרת תפוזים פלוס מעוררים. הכן פתרון מעורר חיובי 2X על ידי דילול pyocyanin אחד עד 100 לתוך כל אחד פתרונות בדיקה 2X לריכוז של 500 micromolar.לאחר מכן, הכינו פתרון BSA 2X על ידי דילול פתרון המלאי של BSA בתסרון הבדיקה 2X כדי להשיג ריכוז פי 2 של שני מיקרוגרם למיליליטר. לפני תחילת הגירוי הספציפי, כגון הצלבת קולטן FC-גמא, ודא כי כל reagents ותאים מוכנים למקם את הצינורות על קרח בסדר שבו הם יהיו מגורה. עבור ציטומטר זרימה עם מדגם אוטומטי, שים לב לזמן שלוקח לציטומטר לנתח דגימה אחת ולעבור לדגימה הבאה.הקפד לכלול את כל שלבי ערבוב ושטיפת בדיקה. התזמון הוא קריטי מאוד להתרגם הזה. על מנת שכל תנאי יהיה מבוקר היטב, הגירוי צריך להתבצע בדיוק 30 דקות עבור כל תנאי.לעורר את התאים לפי הסדר ולשלב את זמן ההשהיה בין רכישות מדגם על ידי ציטומטר זרימה. אם מבצעים פיצוי ידני בשלב זה, לעורר צינורות בקרה לשמש לפיצוי על ידי הוספת 200 microliters של פתרון בדיקה 2X המכיל את reagent זיהוי מתח חמצוני ואת המזרז לתוך הצינורות מסומן ירוק בתוספת inducer. לאחר מכן, להוסיף 200 microliters של פתרון בדיקה 2X המכיל את reagent זיהוי סופראוקסיד ואת המריץ לתוך צינורות מסומן כתום בתוספת inducer.דגירה התאים במשך 30 דקות בחושך. באמצעות תוכנת cytometry זרימה, ליצור ולתייג שלושה קבצים לדוגמה עבור הפקד, לא מוכתם, מטופל, ירוק בתוספת inducer, ואת כתום בתוספת דגימות inducer, הקפד לציין את הערוצים ואת הפרמטרים שיש לנתח. כמו כן, הזן תנאי עצירה רצויים.לאחר הגדרת דגימות הבקרה, צור ותייג קבוצה דומה של קבצים עבור הדגימות הניסיוניות. עכשיו, תריץ את הדגימה הלא מזוהמת והלא מטופלת. פתח חלקת נקודה עבור פיזור קדימה על ציר X לעומת פיזור צד על ציר Y ולצייר שער סביב התאים של עניין, למעט תאים מתים ופסולת.לאחר מכן, השתמש בשער של תא זה כדי לפתוח חלקת נקודה נוספת של סמן הפלואורסצנטיות הראשון, FL1, על ציר ה- X, לעומת סמן הפלואורסצנטיות השני, FL2, על ציר Y. צייר שער רבעים ראשוני ולאחר מכן התאם את שער הרבע כך שהאירועים יופיעו ברביע השמאלי התחתון של התוויית FL1 לעומת FL2. בסיום, הפעל את דגימת המזרז הירוק בתוספת.כוונן את המתח כך שהאירועים יופיעו ברבעים השמאליים והימין התחתונים של התוויית FL1 לעומת FL2. לאחר מכן, החל מטריצת פיצוי זו על כל שלושת הקבצים לדוגמה. עכשיו, תריץ את דגימת התפוז פלוס המזרז.התאם את המתח כך שהאירועים יופיעו ברבעים השמאליים העליונים והתחתונים של התוויית FL1 לעומת FL2, ולאחר מכן החל מטריצת פיצוי זו על כל שלושת הקבצים לדוגמה. בדוק כל קובץ פיצוי וודא שאירועים לא נגועים ולא מטופלים מופיעים ברביע השמאלי התחתון, אירועי ה-green plus inducer מופיעים ברבעים השמאליים והימניות התחתונים, ואירועי המזרז הכתומים פלוס מופיעים ברבעים השמאליים העליונים והתחתונים של התוויית FL1 לעומת FL2. לאחר מכן, החל את מטריצת הפיצוי על כל קבצי הדוגמה הניסיוניים.לאחר ביצוע פיצוי ידני והתקבלה תבנית ניסיונית, עבור אל הדגימות הניסיוניות. לפני הטיפול בתאים עם מעורר חיובי או ביצוע גירוי תא קולטן FC-גמא, לסמן אילו צינורות יקבלו מעכב ROS. לטפל בתאים אלה עם מעכב ROS לפחות 30 דקות לפני מעורר חיובי או גירוי קולטן FC-גמא על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של המעכב ל 200 microliters של תאים resuspended לריכוז סופי של חמישה מילימולרים.עבור תאים לא מנומקים, לטפל בתאים עם 200 microliters של פתרון בדיקה 2X ללא כל גירוי נוסף 200 microliters של השעיית תא שכותרתו מוכתם, ללא גירוי. עבור פקדים חיוביים, לטפל בתאים עם 200 microliters של פתרון תמריץ חיובי 2X כדי 200 microliters של השעיית התא שכותרתו תמריץ חיובי או מעורר חיובי בתוספת מעכב. לבסוף, עבור תאים מגורה על ידי הצלבת קולטן FC-גמא, לטפל בהם עם 200 microliters של פתרון 2X BSA הוסיף 200 microliters של המתלה התא שכותרתו FC-גמא קולטן crosslinking או קולטן FC-גמא crosslinking בתוספת מעכב.דגירה התאים במשך 30 דקות בחושך. לאחר הדגירה, לנתח את הדגימות בסדר שבו הם היו מגורים, באמצעות ציטומטר זרימה ותבניות ניתוח שנוצר במהלך שלבי הפיצוי הראשוניים. הנתונים המוצגים כאן מדגימים את הזיהוי הציטומטרי של זרימה של ייצור מיני חמצן תגובתי הנובע מגירוי של מקרופאגים באמצעות קולטן FC-גמא.יש עלייה ניכרת פלואורסצנטיות FL1 ו FL2 כאשר תאים מגורים עם סוכן crosslinking קולטן FC-גמא. כאשר תאים טופלו עם מעכבי מיני חמצן תגובתי לפני הצלבת קולטן FC-גמא, פלואורסצנטיות מוגברת זו מוחזרת לרמות בסיס. לעומת זאת, חלקות נקודה אלה מציגות ניסוי לא מוצלח, שבו נצפתה ייצור מיני חמצן תגובתי תת-אופטימלי כתוצאה מגירוי קולטן FC-גמא.כדי להדגיש את ההבדלים הגדולים בין האחוזים הצפויים, או עליות MFI, נתונים אלה מראים מה דגימות עם עלייה מינימלית FL1 ו FL2 פלואורסצנטי נראה. הפרוטוקול הנוכחי משתמש בשלב של 24 שעות ביממה. כאשר משווים זמן של 24 שעות לעומת זמן של 48 שעות, לא היה הבדל ניכר באחוז התאים החיוביים עבור רוח הלחץ החמצוני הירוק.עם זאת, הגדלת זמן הפרימינג ל-48 שעות הגדילה את אחוז התאים החיוביים עבור הפלואורסצנטיות הכתומה. הדברים החשובים ביותר שיש לזכור בעת ביצוע הליך זה הוא תכנון מראש, ולהיות עקבי על העיתוי של הבדיקה כדי לקבל תוצאות לשחזור.

flow-cytometric-measurement-ros-production-macrophages-response-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מדגימים את השירות של זרימת cytometry ססגוניות אפיון פנוטיפי ופונקציונלי מפורט הכולל, כמו גם תת זיכרון מסוג CD4 + ו - CD8 + T תאים של קופי רזוס, המודל האידיאלי עבור HIV / איידס מחקרים החיסון.

Cytometry ססגוניות אנליזות זרימה של תגובה חיסונית תאית של קופי רזוס

שיטה יעילה כדי להשיג תובנות לדמיין את האינדוקציה אוטוקריני הנגזרות ROS של האנדותל Ca2 + איתות מתואר. שיטה זו מנצלת את מדידת ROS נגזר אוטוקריני מופעלות Ca2 + לגיוס בתאי האנדותל בכלי הדם במודל שיתוף תרבות.

ויזואליזציה של כלי דם Ca 2 + איתות מופעלות על ידי ROS נגזר אוטוקריני

סרטון זה מציג בדיקת מונוציטים חד-שכבתית המשתמשת במונוציטים ראשוניים מדם היקפי כדי להעריך פגוציטוזה בתיווך קולטן Fcγ עם תאי דם אדומים מסוג פולי D נגד נוגדנים R2R2.

בדיקה לחקר פגוציטוזה מונעת קולטן Fcγ במונוציטים מונושכבות

הנה, אנחנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש בcytometry תמונה לכימות של פטריות פתוגניים בשיתוף עם תאי מארח בתרבות. טכניקה זו יכולה לשמש כאלטרנטיבה לספירת CFU.

שימוש cytometry תמונה לכימות של פטריות פתוגניים בשיתוף עם תאי מארח

phagocytosis microglial הוא קריטי לשמירה על הומאוסטזיס רקמות ותפקוד לקוי phagocytic הייתה מעורב פתולוגיה. עם זאת, להערכת תפקוד microglia in vivo מבחינה טכנית מאתגרת. פתחנו טכניקה פשוטה אך חזקה לניטור בדיוק וכימות פוטנציאל phagocytic של microglia בסביבה פיזיולוגית.

להערכת תפקוד רשתית microglial Phagocytic<em&gt; In vivo</em&gt; שימוש cytometry זרימה מבוסס Assay

מאמר זה מתאר שיטה למדידת alloreactivity באוכלוסייה מעורבת של תאי T באמצעות זרימת הדמית cytometry.

מדידת T Cell Alloreactivity שימוש cytometry זרימה הדמיה

פרוטוקול זה מספק שיטה לעכל עיניים שלמות לתוך השעיית תא יחיד לצורך ניתוח ציטומטרי זרימה רב-פרמטרית על מנת לזהות אוכלוסיות פיגוציטיות מונונוקולריות עיניות ספציפיות, כולל מונוציטים, מיקרוגליה, מקרופאגים ותאים דנדריטיים.

עיכול של עיני עכבר שלמות לניתוח ציטומטרי של זרימה מרובת פרמטרים של פיגוציטים מונונוקאריים

פרוטוקול זה מספק שיטת עיכול יעילה של collagenase לבידוד של אדיפוציטים בני קיימא ותאי SVF של מקטע כלי דם סטרומה משומן בטני אנושי בתהליך יחיד, כולל מתודולוגיה להשגת RNA באיכות גבוהה מאדיפוציטים ופנוטיפפיקציה של SVF-מקרופאגים באמצעות צביעה של סמנים מרובים הקשורים לממברנה לניתוח על ידי ציטומטריית זרימה.

בידוד אדיפוציטים בני קיימא ומקטע כלי דם סטרומלי מרקמת השומן הקרבית האנושית המתאימה לניתוח RNA ופנוטיפ מקרופאגים

כאן, אנו מציעים פרוטוקול שיטתי, נגיש, לשחזור כדי לזהות מינים חמצן תגובתי תאית (ROS) באמצעות 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate בדיקה (DCFH-DA) בתאי גליה מולר (MGCs). שיטה זו מכמתת את סך רמות ה- ROS התאיות עם ציטומטר זרימה. פרוטוקול זה קל מאוד לשימוש, מתאים וניתן לשחזור.

כימות של מינים חמצן תגובתי באמצעות 2′,7′-Dichlorofluorescein Diacetate בדיקה וזרימה-Cytometry בתאי גליה מולר

עבודה זו מתארת פרוטוקול מתוקנן במבחנה לכימות והשוואה של שיעורי הפגוציטוזיס של תאי דם אדומים קסנוגניים (אנושיים) ואלוגניים (חולדות) על ידי מקרופאגים מבודדים של חולדות.

הערכה כמותית של פגוציטוזיס של אריתרוציטים אלוגניים וקסנוגניים על ידי מקרופאגים של חולדות במבחנה

למדו מדידת ROS במקרופאגים בתגובה ל-FcγR cross-linking באמצעות ציטומטריית זרימה וסונדות פלואורסצנטיות. שיטה זו מאפשרת הערכת תפקוד תאי חיסון ואבחון מחלות כמו CGD.

מדידת Cytometric ROS הייצור ב מקרופאגים בתגובה FcγR cross-linking

גלה סרטונים נוספים