עיכוב של צמיחה אספרגילוס flavus Aflatoxin ייצור הטרנסגניים תירס לבטא מעכב α-עמילאז מן Lablab purpureus ל'

כאן אנו מציגים פרוטוקול לנתח אספרגילוס flavus צמיחה וייצור aflatoxin ב תירס גרעינים ביטוי של חלבונים נגד פטריות.  באמצעות זן GFP-לבטא flavus א לנו פיקוח זיהום או התפשטות הפטרייה ב גרעינים בוגרת בזמן אמת. וזמינותו היא מהירה, אמינה, לשחזור.

כאן אנו מציגים מבדיקה פשוטה הקרנת ליבה כדי לנתח את הצמיחה אספרגילוס flavus וייצור Aflatoxin גרעיני תירס המבטאת חלבון נגד פטריות. באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק המבטא זן אספרגילוס פלבוס, אנו עוקבים אחר הזיהום וההתפשטות של הפטרייה בגרעים בוגרים בזמן אמת. זו הערכה פשוטה מספקת אמצעי אמין להערכת היכולת של גרעין תירס להתנגד זיהום Flavus אספרגילוס וייצור Aflatoxin.

תוצאות בדיקה מעבדה זו שבוצעו בתנאים מבוקרים על גרעינים בוגרים בקורלציה היטב עם תוצאות של זיהום בתנאי שדה. הדגמת ההליך תהיה ד"ר Rajtilak Majumdar, פוסטדוק מהמעבדה שלנו, יחד עם כריסטין סיקלר ודיוויד אמברוסיו, טכנאי מדע ביולוגי גם מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, הדבק 20 שני כובעי הצמדה מ"מ בצלחת פטרי כדי ליצור כובעי KSA.

תן הדבק להתייבש במשך 48 שעות לפני השימוש באותיות. בארון בטיחות ביולוגי מרססים מגש ביו-אסאי מרובע עם 70% אתנול במים. תן לאוויר המגש להתייבש.

מוסיפים נייר כרומטוגרפיה סטרילי למגש היבש. לרסס תשעה כובעי KSA עם 70% אתנול ולתת להם אוויר יבש. ואז למקם את הכובעים על מגש bioassay.

עבור כל קו תירס מהונדס שנבדק, בחר 20 גרעינים שלא ניזוקו והצב אותם בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. באמצעות מיקרוסקופ סטריאו שולחן לבחור רק גרעינים ניזוקו עבור הראיה. גרעינים פגומים רגישים יותר להתקפה אספרגילוס לייצר יותר Aflatoxin, ובכך להטות את התוצאות ולא מייצג את התכונות האנטי פטריות או מיקרוביאלית אמיתי של מגוון.

מוסיפים 70%אתנול לכל צינור. תן את הגרעינים לעקר במשך ארבע דקות תוך מדי פעם בעדינות לנער אותם. לאחר מכן לשפוך בעדינות את האתנול בעדינות לשטוף את הגרעינים במים סטריליים deionized שלוש פעמים.

השג תרבות של שישה ימים של כתם פלבוס אספרגילוס 70 המביע GFP גדל על V8 בינוני. מוסיפים 20 מ"ל של סטרילי 0.02% טריטון X-100 במים מיונים. ולהשתמש בלולאה סטרילית כדי לגרד את הנבגים.

פיפטה את inoculum ולהעביר אותו ל-300 מ"ל מקור סטרילי. הכינו דילול של פי חמישה עם 0.02% טריטון X-100 ולהשתמש בהמוציטומטר לביצוע ספירת נבגים. לדלל שוב במידת הצורך כדי להשיג 100 מ"ל עם ריכוז של ארבעה מיליון נבגים לכל מ"ל.

יוצקים את inoculum לתוך מקור ריק. מניחים את הגרעינים לתוך מקור סטרילי 300 מ"ל עם בר ערבוב ומערבבים במשך שלוש דקות. באמצעות מדפים להעביר את הגרעינים לצלחת bioassay, הקפדה רק למקם גרעין אחד לתוך כל כובע.

מוסיפים 30 מ"ל של מים deionized לתחתית של כל מגש bioassay. ותגרה ב-31 מעלות צלזיוס במשך שבעה ימים. לאחר שבעה ימים של חיסון עם A.flavus, לצלם ארבעה גרעינים שיועדו לניתוח מיקרוסקופי וצילום.

לאחר מכן השתמש רקמות רכות ומים deionized כדי לנקות את החלק החיצוני של הגרעינים. בצע קטעים אורך של גרעינים ומיד לצלם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי להכין את הגרעינים לניתוח, לנקות את החלק החיצוני של הגרעינים הנותרים עם רקמה רכה ומים deionized.

מניחים ארבעה גרעינים, המהווים נציג אחד, לתוך בקבוקון פוליקרבונט 15 מ"ל כובע בורג המכיל שני כדורי נירוסטה. מיד להקפיא את הבקבוקונים בחנקן נוזלי ולאחסן ב 80 מעלות צלזיוס עד מוכן להמשיך עם עיבוד וניתוח נוסף. כאשר מוכן, להסיר את הגרעינים מהמקפיא ולהשתמש homogenizer לטחון אותם ב 1500 סל"ד במשך שלוש דקות.

השתמש באותם חומרי קרקע לניתוח GFP, קביעת Aflatoxin וניתוח מולקולרי, כך שכל הערכים מייצגים את הדגימות. בעוד מינימום של שלושה שכפולים מומלץ, יותר הוא תמיד טוב יותר בהתאם לזמינות של גרעינים באיכות טובה. במחקר זה עוברים לא בוגרים של קווי תירס HI-II משתנים באמצעות זן Agrobacterium tumefaciens EHA101 המכיל את וקטור היעד הסופי של הצמח המבטא את הגן Lablab purpureus AILP תחת שליטתו של מקדם 35S מנגיף פסיפס הכרובית.

הגברה PCR של הגן AILP היעד הראה אמפוליקון 548 bp נצפתה רק בשורות תירס מהופנט. הגן AILP הראה ביטוי בשורות מהופנטות ואילו לא נצפה ביטוי AILP בצמחי הבקרה. נבגים בשלב מוקדם נחשפים תמציות עלים גולמיים מצמחים תירס מהוסס צעיר במשך 20 שעות.

אורך מלא גבוה של נבגים החשופים לתמציות עלים מהו מהודורים מראה ירידה של 58 עד 80% בהשוואה לשליטה השלילית. זן A.flavus בשימוש מכיל כתב GFP המאפשר ניטור וכימות של צמיחה פטרייתית בזמן אמת. ירידה משמעותית פלואורסצנטיות GFP נצפתה גרעיני AILP מהופנט לעומת שליטה שלילית isogenic.

ירידה משמעותית ניכרת בצמיחה הפטרייתית של קווי AILP 4 ו-5, 69% ו-72% בהתאמה. הקווים האחרים מראים הפחתה של 35 עד 60% בהשוואה לקרני הבקרה. הפחתה של 62 עד 88% בתוכן Aflatoxin נצפתה בליבות AILP בהשוואה לבקרה.

קו ארבע הוא ראה את התוכן Aflatoxin הנמוך ביותר ב 486 ננוגרם לגרם, ואחריו קווים אחרים החל תוכן הנע בין 640 ו 1498 ננוגרם לגרם הגרעינים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון שימוש בגלואורומטר לכימות GFP וכצמיחתו הפטרייתית. ניתן להשתמש בערכות מסחריות עם בסיס חיסוני או HPLC או EPLC לביצוע כימות Aflatoxin.

הזמינות של KSA מספקת אמצעי מהיר ופשוט לקביעת עמידות לזיהום Aflatoxin. ניתן להעריך במהירות את קווי הרבייה של תירס שונים באמצעות טכניקה זו. בעוד ההקרנה הקרנת הקרנה אינה מסוכנת, המפעיל צריך להגן על עצמו מפני חשיפה נבגי flavus אספרגילוס, להשתמש בציוד מגן נאות.