Name: עיכוב של צמיחה אספרגילוס flavus Aflatoxin ייצור הטרנסגניים תירס לבטא מעכב α-עמילאז מן Lablab purpureus ל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: חקור שיטת סקר גרעינים פשוטה להערכת עמידות תירס לזיהום Aspergillus flavus וייצור אפלטוקסין באמצעות חלבון אנטי-פטרייתי. השיטה משתמשת בזן GFP לניטור בזמן אמת ומספקת כלי מהיר ואמין להגנת יבולים ולבטיחות מזון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים דוד Meints, אוניברסיטת ארקנסו שלו לסיוע בפיתוח ובניתוח של תירס מהונדס במהלך הדורות הראשונים. עבודה זו קיבל סיוע כספי של משרד החקלאות-ARS כריס פרוייקט 6054-42000-025-00D. איזכור שמות מסחריים או מוצרים מסחריים במאמר זה היא אך ורק לצורך אספקת מידע ספציפי, לא משתמע המלצה או אישור מאת לנו משרד החקלאות. מדיניות הזדמנות שווה בתעסוקה (EEO) של משרד החקלאות-ARS מנדטים שוויון הזדמנויות לכל האנשים, אוסר על אפליה בכל ההיבטים של אנשי מדיניות, שיטות ופעולות של הסוכנות.

1. פלסמיד בונה ושינוי תירס
<ol><li>PCR להגביר Lablab AILP הוספה באמצעות תחל את 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 'ו 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3'. התנאים PCR לכלול צעד דנטורציה הראשונית ב 98 ° C ל 30 s (שלב 1), ואחריו דנטורציה ב 98 ° C עבור 10 s (שלב 2), חישול ב 55 ° C ל 30 s (שלב 3), התארכות ב-72 מעלות 20 s (שלב 4), 31 מחזורים של שלב 2 עד שלב 4 , וצעד התארכות הסופי ב-72 מעלות במשך 5 דק שיבוט המוצר PCR לתוך pCAMBIA שונה 1,300 וקטוריות באמצעות Xbaאני ו Pstאני באתרים מגבלת. רצף הווקטור היעד הסופי צמח כדי לאשר את הכיוון ואת רצף של הגן AILP משוכפל בוקטור.</li>
	<li>להפוך Agrobacterium המתח EHA101 עם הבונה וקטור הסופי (איור 1) כפי שתואר קודם לכן 16.</li>
	<li>שימוש טרנספורמציה Agrobacterium המכיל את הווקטור היעד הסופי צמח להפוך את העוברים ילדותי תירס (זיה מייז ל' Hi-II) (ביצע את הצמח טרנספורמציה מתקן של איווה סטייט) 16.</li>
	<li>לגדל צמחים0 T בחממה (26-29 מעלות צלזיוס; 16/8 h photoperiod בתוספת בלחץ גבוה Na-מנורות), self-pollinate שוב ושוב כדי לקבל T דור6 כדי להשיג homozygosity עבור התכונה מהונדס.</li>
</ol>2. נבג נביטה assay
<ol><li>הקציר דגימות עלים ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס. לטחון דגימות עלים עם ומכתש בעזרת חנקן נוזלי. שוקלים לצאת 0.5 g ב- 2 mL microcentrifuge צינורות, להוסיף µL 17 של מעכב פרוטאז, במקום צינורות על קרח.</li>
	<li>צנטריפוגה צינורות עבור 10 דקות ב 16,000 x g. העברת µL 225 של תמצית צמח ל 0.5 mL microcentrifuge צינורות ומניחים על קרח.</li>
	<li>בשפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל, להכין השעיה נבג מ של אספרגילוס flavus 70-GFP ב 1% תפוחי אדמה דקסטרוז מרק (w/v). מערבולת ולהתאים נבג ריכוז עד 105 נבגים/מ"ל עם haemocytometer. התראה: א flavus מייצרת aflatoxins, כל העבודה עם פטריה זו צריך לנהל בטיחות ביולוגית בארון.</li>
	<li>דגירה ב- PDB ב 28 ° C עד תרבות משיגה 50% חניכה של נביטה נבג כמצוין על-ידי בולטות של נבגים.</li>
	<li>מערבולת ופתרון aliquot 25 µL נבג למפעל 225 µL לחלץ. תקופת דגירה בדגימות של 20 שעות ב 28 ° C ברעידות לסירוגין.</li>
	<li>Aliquot 25 µL של פתרון נבג על שקופיות מיקרוסקופ ולמדוד אורך נבט צינורות הנבגים באמצעות את תוכנת המצלמה הדיגיטלית. השתמש מינימום של 20 מידות שכפל עבור כל שורה. הערה: בשלב זה, במקום כל התרבויות בגיל 4 ° C כדי לעצור את הצמיחה המושבה עד מוכן לספור.</li>
</ol>3. ליבה הקרנת Assay (קרית גת)
<ol><li>לבנות KSA בקבוקים על ידי הדבקה כמוסות snap 4 (22 מ"מ) בצלוחית 60 x 15 מ מ. לאפשר דבק להתייבש במשך 48 שעות לפני השימוש כמוסות. כל כובע KSA מהווה נציג אחד (איור 2).</li>
	<li>ב סטרילי בטיחות ביולוגית cabinet, לרסס מגש מרובע bioassay (24 ס מ x 24 ס מ) עם 70% אתנול: H2O (v/v) ולתת אוויר יבש. להוסיף נייר סטרילי כרומטוגרפיה המגש. לרסס 9 KSA כמוסות עם 70% אתנול, תן אוויר יבש, ומניחים במגש bioassay.</li>
	<li>לקו לכל הטרנסגניים תירס נבדק, לבחור 20 גרעינים ניזוק ומניחים בתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ. הוספת אתנול 70% ואפשר לשבת במשך 4 דקות. מנערים בעדינות צינורות במהלך עיקור. יוצקים את הגרעינים אתנול ולשטוף שלוש פעמים ב סטרילי יונים H2O.</li>
	<li>להכין השעיה ספורה של אספרגילוס flavus 70-GFP17 מתרבות בן 6 יום גדל על בינוני V8 (5% V8 מיץ, אגר 2%, pH 5.2).<ol>
<li>הוסף 20 מ"ל סטרילי 0.02% H X-100/יונים טריטון2O (v/v), לגנוז את הנבגים עם לולאה סטרילי. Pipet inoculum ואת המקום סטרילי בתוך 300 מ.</li>
		<li>להכין לדילול 5-fold עם 0.02% טריטון X-100, לאחר מכן לבצע ספירה נבג עם haemocytometer. לדלל שוב במידת הצורך להשיג 100 מ עם ריכוז של 4 x 106 נבגים/mL....</li>
	</ol>
</li>
	<li>מקום גרעינים גביע סטרילי 300 מ עם בר מערבבים. להוסיף inoculum הספל. התראה: הוספת גרעינים inoculum יגרום לפתרון הפתיחה. במקום כוס כימית על צלחת מערבבים במשך 3 דקות. לאחר 3 דקות, יוצקים את inoculum לתוך גביע ריק.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, מקום גרעינים המנה bioassay (1 ליבה cap). להוסיף 30 מ ל יונים מים לתחתית בכל מגש bioassay דגירה ב 31 ° C בחושך במשך 7 ימים.</li>
	<li>להכין גרעינים לצילום.<ol>
<li>להפריש 4 גרעינים מכל שורה עבור ניתוח מיקרוסקופי וצילום. הערה: ניתן לאחסן גרעינים ב 4 ° C לא יותר מאשר 5 ימים לפני סיום הצילום.</li>
		<li>תצלמי תמונות של גרעינים לאחר שבעה ימים של חיסון עם flavus א (איור 3).</li>
		<li>החיצוני נקי של גרעינים עם רקמות רכות, מים יונים. ביצוע סעיפים האורך של גרעינים ולצלם מיד תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין גרעינים לניתוח.<ol>
<li>החיצוני נקי של גרעינים הנותרים עם רקמות רכות, מים יונים.</li>
		<li>מקום 4 גרעינים, המהוות נציג 1, בפוליקרבונט פקקי בורג 15 מ"ל בקבוקון המכיל 2 כדורים פלדת אל-חלד. מיד להקפיא בקבוקונים חנקן נוזלי, חנות ב-80 מעלות צלזיוס עד המשך עיבוד וניתוח.</li>
		<li>להסיר את צלוחיות למקפיא-80 ° C, לטחון גרעיני מהמגן-1,500 סל ד במשך 3 דקות. הערה: לשמור על גרעינים קפוא עם חנקן נוזלי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. PCR הקרנת גרעינים תירס מהונדס
<ol><li>השתמש ה-DNA בידוד ערכת כדי לבודד דנ א גנומי (gDNA) מ השמיד תירס גרעינים נגוע flavus א על פי הוראות היצרן. בקצרה, להוסיף 280 מאגר µL F, פרוטאז µL 20 ו- 3 µL dithiothreitol (DTT) 10-15 מ"ג של גרעינים תירס השמיד. דגירה ומנערים ב thermomixer (56 ° C, 1,200 סל ד, 30 דקות). צנטריפוגה-g 10,000 x עבור 1 דקות, להעביר את תגובת שיקוע ברור equilibrated עמודה. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות, צנטריפוגה ב x 700 g עבור 1 דקות עד elute gDNA.</li>
	<li>קח µL 0.8 של שחולצו gDNA כדי להגדיר את תגובת ה-PCR µL 20 עבור כל דגימה באמצעות ערכת ה-PCR. בצע thermocycling בתנאים המומלצים בפרוטוקול של היצרן. התנאים PCR לכלול צעד דנטורציה הראשונית ב 98 ° C למשך 5 דקות (שלב 1) ואחריו דנטורציה ב 98 ° C 5 s (שלב 2), חישול ב 55 ° C 5 s (שלב 3), התארכות ב-72 מעלות 20 s (שלב 4), 40 מחזורי שלב 2 עד שלב 4 , וצעד התארכות הסופי ב 72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה (שלב 5).</li>
	<li>השתמש פריימר לפנים 5'-TATACCACCCCCATCCGTGT-3' הפוכה פריימר 5'-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3' כדי לאשר את הנוכחות של Lablab AILP ג'ין בליבות תירס מהונדס.</li>
</ol>5. RNA בידוד, סינתזה cDNA ו- RT-PCR כמותי למחצה
<ol><li>קח הומוגני flavus א נגוע תירס גרעינים שאוחסנו בעבר ב-80 מעלות צלזיוס לחילוץ RNA. תמצית ה-RNA באמצעות הכולל RNA בידוד ערכת לפי הפרוטוקול של היצרן, אבל עם שינוי קל18. לאחר הוספת 50 מ ג של אבקת הומוגני גרעיני תירס במאגר החילוץ, לערבב אותו (בלי vortexing) באמצעות טיפ pipet 1 מ"ל, תשאיר את זה על קרח למשך 5-6 דקות לפני שתמשיך והשלבים כמפורט בפרוטוקול של היצרן.</li>
	<li>להכין cDNA באמצעות ערכת סינתזה cDNA לפי פרוטוקול של היצרן 18.</li>
	<li>השתמש µL 0.5 של cDNA מדולל לפי תגובת ה-PCR RT-PCR כמותי למחצה כמו שתואר קודם לכן18. השתמש תחל ואחורה qAILP-F 5'-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3' ו- qAILP-R 5' - CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA - 3' בהתאמה, כדי לזהות ביטוי גנים Lablab AILP , ואת קדימה ולהפוך תחל qRib-F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ ו- qRib-R 5ʹ-TCAGTCCAACTTCCAGAATGG-3ʹ בהתאמה לביטוי של תירס ribosomal מבנה גנטי (צלעות), GRMZM2G02483819 כמו גן משק בית.</li>
</ol>6. GFP כימות
<ol><li>הכנת 50 מ ל כל אחד 0.2 מ' monobasic סודיום פוספט (NaH2PO4) ו- 0.2 מ' dibasic סודיום פוספט (נה2HPO4·7H2O) יונים H2O.</li>
	<li>לפצות 100 מ של pH 7.0 סורנסון פוספט המאגר. PH 7.0, להוסיף 19.5 mL NaH2PO4 המניות, 30.5 מ ל NaHPO4·7H2O מניות, 50 מ ל יונים H2O.</li>
	<li>שוקלים לצאת חומר הליבה הקרקע 25 מ ג (משקל טריים, FW) ולמקם צינור microcentrifuge 1.0 מ"ל. להוסיף 500 µL פוספט מאגר צנטריפוגה צינור ו vortex ב-30 s.</li>
	<li>צנטריפוגה דגימות במשך 15 דקות ב 16,000 x g. תגובת שיקוע לתוך צלחת טוב שחור 96 pipet 100 µL. קרא את הדגימות עם fluorometer (nm עירור 485, פליטה 528 ננומטר).</li>
</ol>7. ניתוח aflatoxin הכולל
<ol><li>חילוץ מדגם עיבוד של aflatoxin<ol>
<li>דוגמאות ליבה יבש בתנור אוויר מאולץ במשך יומיים ב 60 מעלות צלזיוס. שוקל דגימות ולמקם 50 מ ל Erlenmeyer בקבוק עם פקק זכוכית.</li>
		<li>בשכונה fume, להוסיף 25 מ ל מתילן כלוריד כל הבקבוק. התראה: מתילן כלוריד הוא הפכפך מאוד, והוא נחשב מסוכנים (גירוי, מסרטן). ב- latex ואינו nitrile כפפות בטוחים עבור עבודה עם מתילן כלוריד. להשתמש בכפפות משופר אורגני PolyVinylAlcohol עמיד הממס.</li>
		<li>דוגמאות למשך 30 דקות נתנער לכבוד מטרף פעולה פרק כף היד. לאחר 30 דקות, מוזגים את התמצית באמצעות עיגול נייר סינון מחורץ לתוך הספל 80 מ. . בוא הלילה יבש בקבוקונים בשכונה fume</li>
		<li>למחרת, להשפריץ מתילן כלוריד (כ- 5 מ"ל) בתוך רים של בקבוקונים יבש מתרוצצות, שופכים לתוך מבחנות זכוכית דראם 2. בקבוקונים. השאירו פתח להתייבש בשכונה fume בן לילה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ניתוח aflatoxin<ol>
<li>להוסיף 4.0 מ ל 80% מתנול: יונים H2O (v/v) כדי בקבוקונים.</li>
		<li>שימוש ערכת חילוץ aflatoxin לסינון לטהר מתנול פתרון עם העמודה שסופקו. ניתוח aflatoxin הכולל רמות עם fluorometer, על פי הוראות היצרן.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ismaiel, A., Papenbrock, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycotoxins%3A+Producing+fungi+and+mechanisms+of+phytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Agriculture%22%5BJournal%5D)">Mycotoxins: Producing fungi and mechanisms of phytotoxicity.</a> Agriculture. 5 (3), 492-537 (2015).</li>
<li>Mitchell, N., Bowers, E., Hurburgh, C., Wu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+economic+losses+to+the+USA+corn+industry+from+aflatoxin+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Additives+%26+Contaminants%3A+Part+A%22%5BJournal%5D)">Potential economic losses to the USA corn industry from aflatoxin contamination.</a> Food Additives & Contaminants: Part A. 33 (3), 540-550 (2016).</li>
<li>Umesha, S., Manukumar, H. M., Chandrasekhar, B., Shivakumara, P., Shiva Kumar, J., Raghava, S., Avinash, P., Shirin, M., Bharathi, T. R., Rajini, S. B., Nandhini, M., Vinaya Rani, G., Shobha, M., Prakash, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aflatoxins+and+food+pathogens%3A+Impact+of+biologically+active+aflatoxins+and+their+control+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Science+of+Food+and+Agriculture%22%5BJournal%5D)">Aflatoxins and food pathogens: Impact of biologically active aflatoxins and their control strategies.</a> Journal of the Science of Food and Agriculture. , (2016).</li>
<li>Brown, R. L., Menkir, A., Chen, Z. Y., Bhatnagar, D., Yu, J., Yao, H., Cleveland, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breeding+aflatoxin-resistant+maize+lines+using+recent+advances+in+technologies+-+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Additives+%26+Contaminants+-+Part+A+Chemistry%2C+Analysis%2C+Control%2C+Exposure+%26+Risk+Assessment%22%5BJournal%5D)">Breeding aflatoxin-resistant maize lines using recent advances in technologies - a review.</a> Food Additives & Contaminants - Part A Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 30 (8), 1382-1391 (2013).</li>
<li>Abbas, H., Accinelli, C., Shier, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+control+of+aflatoxin+contamination+in+U.S.+crops+and+the+use+of+bioplastic+formulations+of+Aspergillus+flavus+biocontrol+strains+to+optimize+application+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biological control of aflatoxin contamination in U.S. crops and the use of bioplastic formulations of Aspergillus flavus biocontrol strains to optimize application strategies.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65, 7081-7087 (2017).</li>
<li>Udomkun, P., Wiredu, A. N., Nagle, M., Müller, J., Vanlauwe, B., Bandyopadhyay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+technologies+to+manage+aflatoxins+in+foods+and+feeds+and+the+profitability+of+application+%E2%80%93+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Control%22%5BJournal%5D)">Innovative technologies to manage aflatoxins in foods and feeds and the profitability of application – A review.</a> Food Control. 76, 127-138 (2017).</li>
<li>Dohroo, N. P., Bhardwaj, S. S., Shyram, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amylase+and+invertase+activity+as+influenced+by+Pythium+pleroticum+causing+rhizome+rot+of+ginger%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease+Research%22%5BJournal%5D)">Amylase and invertase activity as influenced by Pythium pleroticum causing rhizome rot of ginger.</a> Plant Disease Research. 2, 106-107 (1987).</li>
<li>Singh, R., Saxena, V. S., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectinolytic%2C+cellulolytic%2C+amylase+and+protease+production+by+three+isolates+of+Fusarium+solani+variable+in+their+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Mycology+and+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Pectinolytic, cellulolytic, amylase and protease production by three isolates of Fusarium solani variable in their virulence.</a> Indian Journal of Mycology and Plant Pathology. 19, 22-29 (1989).</li>
<li>Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amy1%2C+the+%CE%B1-amylase+gene+of+Aspergillus+flavus%3A+Involvement+in+aflatoxin+biosynthesis+in+maize+kernels%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Amy1, the α-amylase gene of Aspergillus flavus: Involvement in aflatoxin biosynthesis in maize kernels.</a> Phytopathology. 89 (10), 908-914 (1999).</li>
<li>Bluhm, B. H., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amylopectin+induces+Fumonisin+B1+production+by+Fusarium+verticillioides+during+colonization+of+maize+kernels%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Amylopectin induces Fumonisin B1 production by Fusarium verticillioides during colonization of maize kernels.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (12), 1333-1339 (2005).</li>
<li>Gilbert, M. K., Majumdar, R., Rajasekaran, K., Chen, Z. Y., Wei, Q., Sickler, C. M., Lebar, M. D., Cary, J. W., Frame, B. R., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference-based+silencing+of+the+a-amylase+%28amy1%29+gene+in+Aspergillus+flavus+decreases+fungal+growth+and+aflatoxin+production+in+maize+kernels%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">RNA interference-based silencing of the a-amylase (amy1) gene in Aspergillus flavus decreases fungal growth and aflatoxin production in maize kernels.</a> Planta. 247 (6), 1465-1473 (2018).</li>
<li>Chen, Z. Y., Brown, R. L., Russin, J. S., Lax, A. R., Cleveland, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+corn+trypsin+inhibitor+with+antifungal+activity+inhibits+Aspergillus+flavus+%CE%B1-amylase%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">A corn trypsin inhibitor with antifungal activity inhibits Aspergillus flavus α-amylase.</a> Phytopathology. 89 (18944733), 902-907 (1999).</li>
<li>Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+growth+of+Aspergillus+flavus+and+fungal+%CE%B1-amylases+by+a+lectin-like+protein+from+Lablab+purpureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Inhibition of growth of Aspergillus flavus and fungal α-amylases by a lectin-like protein from Lablab purpureus.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (8), 955-961 (2001).</li>
<li>Mirkov, T. E., Wahlstrom, J. M., Hagiwara, K., Finardi-Filho, F., Kjemtrup, S., Chrispeels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+relationships+among+proteins+in+the+phytohemagglutinin-arcelin-a-amylase+inhibitor+family+of+the+common+bean+and+its+relatives%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary relationships among proteins in the phytohemagglutinin-arcelin-a-amylase inhibitor family of the common bean and its relatives.</a> Plant Molecular Biology. 26 (4), 1103-1113 (1994).</li>
<li>Kim, Y. H., Woloshuk, C. P., Cho, E. H., Bae, J. M., Song, Y. S., Huh, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+functional+expression+of+the+gene+encoding+an+inhibitor+against+Aspergillus+flavus+a-amylase%2C+a+novel+seed+lectin+from+Lablab+purpureus+%28Dolichos+lablab%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cloning and functional expression of the gene encoding an inhibitor against Aspergillus flavus a-amylase, a novel seed lectin from Lablab purpureus (Dolichos lablab).</a> Plant Cell Reports. 26 (4), 395-405 (2007).</li>
<li>Frame, B., Main, M., Schick, R., Wang, K. Ch. 22. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFrame%2C+B+%22Plant+Embryo+Culture%22">Plant Embryo Culture</a>. Thorpe, T. A., Yeung, E. C. 710, Humana Press. Methods in Molecular Biology 327-341 (2011).</li>
<li>Rajasekaran, K., Sickler, C. M., Brown, R. L., Cary, J. W., Bhatnagar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+resistance+to+aflatoxin+contamination+in+kernels+of+maize+genotypes+using+a+GFP-expressing+Aspergillus+flavus+strain%5BTitle%5D)+AND+%22World+Mycotoxin+Journal%22%5BJournal%5D)">Evaluation of resistance to aflatoxin contamination in kernels of maize genotypes using a GFP-expressing Aspergillus flavus strain.</a> World Mycotoxin Journal. 6 (2), 151-158 (2013).</li>
<li>Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Sickler, C. M., Majumdar, R., Jaynes, J. M., Cary, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Aspergillus+flavus+growth+and+aflatoxin+production+in+transgenic+maize+kernels+expressing+a+tachyplesin-derived+synthetic+peptide%2C+AGM182%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Control of Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in transgenic maize kernels expressing a tachyplesin-derived synthetic peptide, AGM182.</a> Plant Science. , 150-156 (2018).</li>
<li>Shu, X., Livingston, D. P., Franks, R. G., Boston, R. S., Woloshuk, C. P., Payne, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+gene+expression+in+maize+seeds+during+colonization+by+Aspergillus+flavus+and+Fusarium+verticillioides%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific gene expression in maize seeds during colonization by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides.</a> Molecular Plant Pathology. 16 (4), 662-674 (2015).</li>
<li>Savary, S., Ficke, A., Aubertot, J. -N., Hollier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crop+losses+due+to+diseases+and+their+implications+for+global+food+production+losses+and+food+security%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Security%22%5BJournal%5D)">Crop losses due to diseases and their implications for global food production losses and food security.</a> Food Security. 4, 519-537 (2012).</li>
<li>Damalas, C. A., Eleftherohorinos, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pesticide+exposure%2C+safety+issues%2C+and+risk+assessment+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Environmental+Research+and+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Pesticide exposure, safety issues, and risk assessment indicators.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 8 (5), 1402-1419 (2011).</li>
<li>Kowalska, A., Walkiewicz, K., Kozieł, P., Muc-Wierzgoń, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aflatoxins%3A+Characterisitcs+and+impact+on+human+health%5BTitle%5D)+AND+%22Post%C4%99py+Higieny+i+Medycyny+Do%C5%9Bwiadczalnej+%28Online%29%22%5BJournal%5D)">Aflatoxins: Characterisitcs and impact on human health.</a> Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej (Online). 71, 315-327 (2017).</li>
<li>Rajasekaran, K., Cary, J. W., Cotty, P. J., Cleveland, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+GFP-expressing+Aspergillus+flavus+strain+to+study+fungal+invasion%2C+colonization%2C+and+resistance+in+cottonseed%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">Development of a GFP-expressing Aspergillus flavus strain to study fungal invasion, colonization, and resistance in cottonseed.</a> Mycopathologia. 165 (2), 89-97 (2008).</li>
<li>Punt, P., Dingemanse, M. A., Kuyvenhoven, A., Soede, R. D., Pouwels, P. H., van den Hondel, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+elements+in+the+promoter+region+of+the+Aspergillus+nidulans+gpdA+gene+encoding+glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Functional elements in the promoter region of the Aspergillus nidulans gpdA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.</a> Gene. 93 (1), 101-109 (1990).</li>
<li>Lee, L. W., Chiou, C. H., Klomparens, K. L., Cary, J. W., Linz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+aflatoxin+biosynthetic+enzymes+Nor-1%2C+Ver-1%2C+and+OmtA+in+time-dependent+fractionated+colonies+of+Aspergillus+parasiticus%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of aflatoxin biosynthetic enzymes Nor-1, Ver-1, and OmtA in time-dependent fractionated colonies of Aspergillus parasiticus.</a> Archives of Microbiology. 181 (3), 204-214 (2004).</li>
<li>Bhatnagar, D., Cary, J. W., Ehrlich, K., Yu, J., Cleveland, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+genetics+of+regulation+of+aflatoxin+production+and+Aspergillus+flavus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">Understanding the genetics of regulation of aflatoxin production and Aspergillus flavus development.</a> Mycopathologia. 162, 155-166 (2006).</li>
<li>Williams, W. P., Krakowsky, M. D., Scully, B. T., Brown, R. L., Menkir, A., Warburton, M. L., Windham, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+and+developing+maize+germplasm+with+resistance+to+accumulation+of+aflatoxins%5BTitle%5D)+AND+%22World+Mycotoxin+Journal%22%5BJournal%5D)">Identifying and developing maize germplasm with resistance to accumulation of aflatoxins.</a> World Mycotoxin Journal. 8 (2), 193-209 (2015).</li>
<li>Broekaert, W. F., van Parijs, J., Leyns, F., Joos, H., Peumans, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chitin-binding+lectin+from+stinging+nettle+rhizomes+with+antifungal+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A chitin-binding lectin from stinging nettle rhizomes with antifungal properties.</a> Science. 245 (4922), 1100-1102 (1989).</li>
<li>Vanparijs, J., Broekaert, W. F., Goldstein, I. J., Peumans, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hevein-an+antifungal+protein+from+rubber-tree+%28Hevea+brasiliensis%29+latex%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Hevein-an antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex.</a> Planta. 183, 258-264 (1991).</li>
<li>Gozia, O., Ciopraga, J., Bentia, T., Lungu, M., Zamfirescu, I., Tudor, R., Roseanu, A., Nitu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+properties+of+lectin+and+new+chitinases+from+potato+tubers%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+de+l%27Academie+des+Sciences+-+Series+III%22%5BJournal%5D)">Antifungal properties of lectin and new chitinases from potato tubers.</a> Comptes Rendus de l'Academie des Sciences - Series III. 316 (8), 788-792 (1993).</li>
<li>Wisessing, A., Choowongkomon, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amylase+inhibitors+in+plants%3A+Structures%2C+Functions+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Plant+Science+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Amylase inhibitors in plants: Structures, Functions and Applications.</a> Functional Plant Science and Biotechnology. 6 (1), 31-41 (2012).</li>
<li>Tyagi, B., Trivedi, N., Dubey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a-amylase+inhibitor%3A+A+compelling+plant+defense+mechanism+against+insect%2Fpests%5BTitle%5D)+AND+%22Environment+%26+Ecology%22%5BJournal%5D)">a-amylase inhibitor: A compelling plant defense mechanism against insect/pests.</a> Environment & Ecology. 32 (3), 995-999 (2014).</li>
<li>Powers, J. R., Culbertson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+effect+of+bean+amylase+inhibitor+on+insect+amylases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">In vitro effect of bean amylase inhibitor on insect amylases.</a> Journal of Food Protection. 45, 655-657 (1982).</li>
<li>Gatehouse, A. M. R., Fenton, K. A., Jepson, I., Pavey, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+a-amylase+inhibitors+on+insect+storage+pests%3A+Inhibition+of+a-amylase+in+vitro+and+effects+on+development+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Science+of+Food+and+Agriculture%22%5BJournal%5D)">The effects of a-amylase inhibitors on insect storage pests: Inhibition of a-amylase in vitro and effects on development in vivo.</a> Journal of the Science of Food and Agriculture. 37, 727-734 (1986).</li>
<li>Blanco-Labra, A., Chagolla-Lopez, A., Martinez-Gallardo, N., Valdes-Rodriguez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+characterization+of+the+12-kDa+protease+a-amylase+inhibitor+present+in+maize+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Further characterization of the 12-kDa protease a-amylase inhibitor present in maize seeds.</a> Journal of Food Biochemistry. 19, 27-41 (1995).</li>
<li>Abdollahi, A., Buchanan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+aflatoxin+biosynthesis%3A+Induction+of+aflatoxin+production+by+various+carbohydrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of aflatoxin biosynthesis: Induction of aflatoxin production by various carbohydrates.</a> Journal of Food Science. 46, 633-635 (1981).</li>
<li>Liu, J., Sun, L., Zhang, N., Zhang, J., Guo, J., Li, C., Rajput, S. A., Qi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+nutrients+in+substrates+of+different+grains+on+aflatoxin+B1+production+by+Aspergillus+flavus%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Effects of nutrients in substrates of different grains on aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus.</a> BioMed Research International. 2016, (2016).</li>
<li>Uppala, S. S., Bowen, K. L., Woods, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-harvest+aflatoxin+contamination+and+soluble+sugars+of+peanut%5BTitle%5D)+AND+%22Peanut+Science%22%5BJournal%5D)">Pre-harvest aflatoxin contamination and soluble sugars of peanut.</a> Peanut Science. 40 (1), 40-51 (2013).</li>
</ol>

המחברים יש אין ניגוד אינטרסים.

ההפסדים בגידולים חקלאיים בשל פתוגנים מזיקים היא בעיה עולמית20. כיום, יישום של קוטלי פטריות סינטטיים וחומרי הדברה הוא האמצעי השולט על השליטה פתוגנים צמח ומזיקים, אבל שאריות רעילות של אלה ביוכימיקלים ב ואוכל הזנה יכול להוות איום רציני לבריאות האדם ושל בעלי החיים21. בהתחשב החשיבות הכלכלית של תירס מזון, הזנה חיתוך, צמצום או אי-כלילה של זיהום aflatoxin הוא בעל חשיבות עליונה2,3,22. רבייה...

Mycotoxin זיהום על ידי סוגים פטריות, אספרגילוס, Fusarium, Penicilliumו Alternaria היא בעיה רצינית של מזון ולהאכיל יבולים גדולים ברחבי העולם1,2,3. בין אלה שזקוקים, אספרגילוס יש את השפעה שלילית הגבוה ביותר על ערך היבול ובריאות האדם ושל בעלי החיים. אספרגילוס flavus (א flavus) הוא פתוגן הזדמנותית הצמח משפיע על יבול עשיר שמן כגון תירס, זרעי כותנה, בוטנים, מייצרת את קרצינוגנים, aflatoxins, כמו גם רבים רעילים מטבוליטים משניים (SMs). תירס האוכל חשוב להאכיל הגידול ברחבי העולם ו נמצא רגישים מאוד זיהום על-ידי flavus א. ההשפעה הכלכלית של זיהום aflatoxin-מאבד ערך מופחת ב תירס יכול להיות ככל 686.6 מיליון דולר לשנה בארה ב2 עם השינויים החזויים באקלים העולמי, ההשפעה של aflatoxins יכול לגרום הפסדים כלכליים רבתי ב תירס עם הערכות גבוה כמו 1.68 מיליארד דולר לשנה בעתיד הקרוב2. נתון כלכלי ובריאות להשפעות של aflatoxins בני אדם, חיות משק, שליטה aflatoxin קדם קציר תירס עשוי להיות הדרך היעילה ביותר כדי למנוע זיהום aflatoxin מזון, מוצרים.
הגישה ובקרה הקציר מראש גדול עבור עמידות aflatoxin תירס היה בשימוש נרחב של העשורים האחרונים היא בעיקר באמצעות רבייה, אשר דורשת כמות משמעותית של זמן4. לאחרונה, הייצור יש לו הצלחות בהפחתה aflatoxin בקנה מידה גדול שדה יישומים5,6. מלבד/מוצרים חדשים, יישום של כלים חדשניות כגון 'המארח המושרה ג'ין להחרשת' (HIGS) דרך RNAi וביטוי הטרנסגניים של חלבונים הקשורים בהתנגדות יש לו הצלחות בהפחתה של צמיחה flavus א aflatoxin ייצור במחקרים מעבדה ושדה בקנה מידה קטן. גישות אלה כעת להיות ממוטבים בנוסף לזיהוי מטרות ג'ין flavus א פוטנציאלי חדש עבור מניפולציה בעתיד.
מלבד גנים המעורבים ישירות בייצור mycotoxin בתור מטרות פוטנציאליות של אסטרטגיות שליטה מהונדס, הוכחו amylases פטרייתי לשחק תפקיד חיוני בשמירה על הפקה מוצלחת הפתוגנזה ו mycotoxin במהלך השלבים המוקדמים לזיהום הצמח הפונדקאי. כמה דוגמאות Pythium pleroticum (סוכן סיבתי של ריקבון קנה שורש ג'ינג'ר), Fusarium solani (סוכן סיבתי של כרובית ווילט), איפה מתאמים חיוביים בין פתוגניות והביטוי α-עמילאז ופעילות נצפו 7,8. עיכוב של פעילות α-עמילאז או באמצעות נוקאאוט גנטי או גישות תמונות ציפורים משפיע באופן שלילי צמיחה פטרייתי וייצור הרעלן. מוטציה נוקאאוט α-עמילאז של flavus א לא הצליח לייצר aflatoxins כאשר גדל עמילן המצע או degermed תירס גרעינים9. באופן דומה, ב- Fusarium verticillioides זן נוקאאוט α-עמילאז הצליחה לייצר fumonisin B1 (mycotoxin) במהלך זיהום של תירס גרעינים10. במחקר עדכני יותר, הפגינו גילברט et al. (2018) מבוסס-RNAi דפיקה למטה של הביטוי α-עמילאז flavus א HIGS. הקטינה באופן משמעותי את ייצור צמיחה, aflatoxin flavus א במהלך זיהום גרעיני תירס11 .
מעכבים ספציפיים של פעילות α-עמילן יש גם הפיק תוצאות דומות כמו המתקבל למטה-רגולציה של הביטוי α-עמילאז. הדוח הראשון את התפקיד של מעכב α-עמילאז בהתנגדות פטרייתי הגיעה בידוד ואפיון של מעכב טריפסין-α-עמילאז 14-kDa משורות תירס עמידים בפני flavus א12. בהמשך הקרנת הסרט כמה מאות מיני צמחים על-ידי Fakhoury Woloshuk להביא לאיתורם של חלבון מעכב דמוי α-עמילאז (AILP) 36-kDa מהזרעים של יקינתון שעועית, ל' Lablab purpureus 13. רצף פפטיד לקטינים AILP דמה השייכים למשפחת מעכבי לקטין – arcelin – α-עמילאז דיווח במשותף שעועית14,15. AILP מטוהרים התערוכה לא כל פעילות המעכבת לכיוון בתרבית של טריפסין ואפיון נוסף במבחנה הראו עיכוב משמעותי של נביטה conidial13וצמיחה של flavus א . דוחות שהוצגו כאן בבירור מראה α-עמילאז יכול לשמש מטרה בבקרת גישות להגבלת פתוגנים או מזיקים תלויים גיוס עמילן (באמצעות פעילות עמילאז-α) ורכישה של סוכרים מסיסים כמקור אנרגיה בזמן שלהם פתוגניים אינטראקציה עם צמחים פונדקאים.
אלפא-עמילאז ידוע להיות הקריטיים flavus ע' פתוגניות9,10,11, ונתן את החשיבות של AILP כמו אנטי חזק-הסוכן (α-עמילאז עיכוב/antigrowth)flavus א 13, יצרנו צמחי תירס מהונדס לבטא Lablab AILP ג'ין תחת האמרגן CaMV 35S מכוננת. המטרה היא לחקור אם ביטוי heterologous של זה מעכב α-עמילאז ב תירס הוא יעיל נגד ייצור פתוגנזה, aflatoxin flavus א במהלך זיהום גרעיני תירס. התוצאות שלנו מדגימים כי הגרעינים תירס מהונדס לבטא את AILP באופן משמעותי צמצם ייצור צמיחה, aflatoxin flavus א במהלך זיהום ליבה.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Caisson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amazing Marine Goop</td> מוצרים <td></td><td></td><td>אקלקטיים</td></tr><tr><td>C1000 Touch CFX96 מערכת בזמן אמת</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; כלי תרבית רקמות בז, 60 מ"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-772F</td><td></td></tr><tr><td>אפנדורף&nbsp; 5424 מיקרוצנטריפוגה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ארלנמאייר בקבוק עם פקק, 50 מ"ל</td><td>אייס גלאס</td><td>6999-10</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלואורוקוונט אפלה</td><td>רומר מעבדות</td><td>COKFA1010</td><td></td></tr><tr><td>עיגולי נייר סינון איכותיים מחורצים, 15 ס"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>09-790-14E</td><td></td></tr><tr><td>תנור אוויר כוח VWR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FQ-Reader</td><td>Romer Labs</td><td>EQFFM3010</td><td></td></tr><tr><td>Geno/Grinder 2010</td><td>OPS Diagnostics</td><td>SP 2010-115</td><td></td></tr><tr><td>כפפות משופרות PolyVinylAlcohol אורגניות עמידות לממסים</td><td>Ansell</td><td>012-15-554</td><td></td></tr><tr><td>Innova 44 Incubator Shaker</td><td>Brunswick Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>כוסות גריפין חנקן</td><td></td><td></td> נוזלי בצורה נמוכה, 100 מ"ל DKW מדעי החיים 14000-100 <td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתילן כלוריד</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nexttec ערכת בידוד DNA חד-שלבית לצמחים</td><td>Nexttec</td><td>47N</td><td></td></tr><tr><td></td> מיקרוסקופ Nikon Eclipse E600 עם מצלמת Nikon DS-Qi1 Nikon <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ Nikon SMZ25 עם תאורה אפיסקופית C-HGFI ומצלמת Andor Zyla 4.2 sCMOS Nikon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nunc Square BioAssay כלים</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>240835</td><td></td></tr><tr><td>Phire Plant Direct PCR Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F130WH</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני פוליקרבונט, 15 מ"ל</td><td>OPS Diagnostics</td><td>PCRV 15-100-23</td><td></td></tr><tr><td>תפוח אדמה </td> כובע הצמד מרק <td></td><td></td><td></td>דקסטרוז</tr><tr><td>, 22 מ"מ</td><td>DKW מדעי החיים</td><td>242612</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי heptahydrate</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td></td><td></td></tr>' <tr><td>נתרן פוספט מונו-בסיסי</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td></td><td></td></tr>' <tr><td>ספקטרום צמח ערכת RNA כוללת סיגמא-אולדריץ</td><td>'</td><td>STRN50</td><td></td></tr><tr><td>כדורי טחינה מנירוסטה, 3/8 אינץ'</td><td>OPS Diagnostics</td><td>GBSS 375-1000-02</td><td></td></tr><tr><td>סינרגיה צלחת</td><td></td><td></td><td></td>ערבוב</tr><tr><td>4 פלואורומטר</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>V8 מיץ</td><td>קמפבל'ס</td> Whatman יריעות רגילות <td></td><td></td></tr><tr><td>בדרגה איכותית, כיתה 3</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>09-820P</td><td></td></tr><tr><td>שייקר פעולת שורש כף היד</td><td>בורל סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

עיכוב של צמיחה אספרגילוס flavus aflatoxin ייצור הטרנסגניים תירס לבטא מעכב α-עמילאז מן lablab purpureus ל'

Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the &#945;-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.

Aflatoxin זיהום בגידולים ואוכל הזנה היא אתגר גדול ברחבי העולם. Aflatoxins, המיוצר על ידי הפטריה אספרגילוס flavus (flavus א) הם קרצינוגנים, המפחיתים באופן משמעותי חיתוך הערך בשדה תירס וגידולים אחרים שמן עשיר כמו בוטנים חוץ פוזות איום רציני לבריאות האדם ושל בעלי החיים. גישות שונות, כולל הרבייה המסורתיים, ביטוי הטרנסגניים ההתנגדות קשורה חלבונים ו RNA הפרעה (RNAi)-מבוסס מארח-induced ג'ין להחרשת הקריטיים flavus ע' ג'ין מטרות, להיות מוערכים להגדיל aflatoxin עמידות גידולים רגישים. מחקרים שנעשו בעבר הראו תפקיד חשוב של α-עמילאז הייצור הפתוגנזה ו aflatoxin א flavus , מציע הגן/אנזים זה הוא מטרה אפשרית כדי להפחית flavus א צמיחה וייצור aflatoxin. בהקשר זה, המחקר הנוכחי נערך כדי להעריך ביטוי heterologous (תחת שליטה של האמרגן 35S קונסטיטוטיביות CaMV) Lablab purpureus ל' α-עמילאז דמוי מעכב חלבון (AILP) תירס נגד flavus א. AILP הוא חלבון 36-kDa, אשר מעכב תחרותי של האנזים α-עמילאז flavus א , שייך למשפחת חלבון מעכב לקטין – arcelin – α-עמילאז במשותף שעועית. מחקרים במבחנה לפני העבודה הנוכחית הייתה הפגינו את התפקיד של AILP בעיכוב של צמיחה פטרייתי ופעילות של α-עמילאז flavus א . צמיחה פטרייתי וייצור aflatoxin ב גרעינים בוגרת נוטרו בזמן אמת באמצעות זן GFP-לבטא flavus א . הגרעין הקרנת assay (קרית גת) הוא מאוד פשוט להגדיר ומספק אמין לשחזור נתונים על זיהום ואת מידת התפשטות זה יכול ניתן לכמת להערכת germplasm וקווים מהונדס. בגלל הלחץ GFP הוא צמיחה בקורלציה מקרוב פטרייתי וזה, לפי סיומת, מתואם היטב לערכים aflatoxin.  מטרת העבודה הנוכחית הייתה ליישם את הידע הקודם הזה ב יבול מסחרי חשוב כמו חיטה כדי להגדיל את ההתנגדות aflatoxin. התוצאות שלנו מראים הפחתה 35% – 72% צמיחה flavus א AILP-ביטוי הטרנסגניים תירס גרעינים אשר, בתורו, מתורגם הפחתה 62% – 88% ברמות aflatoxin.

שינוי תירס, מולקולרי ההקרנה של הצמחים הטרנסגניים
עוברי ילדותי של תירס קווי Hi-II היו מומרת באמצעות זן Agrobacterium tumefaciens EHA101 המכיל הווקטור היעד הסופי צמח לבטא את הגן AILP Lablab purpureus תחת השליטה של CaMV 35S יזם. חמישה קווי תירס באופן עצמאי טרנספורמציה היו מתקדמים לדור T6 עבור מחקרים מאוחרים יותר. הצמחים תירס מהונדס היו הרבה יותר קטן, פחות נמרצת, אך לא הראה חריגות...

כאן אנו מציגים פרוטוקול לנתח אספרגילוס flavus צמיחה וייצור aflatoxin ב תירס גרעינים ביטוי של חלבונים נגד פטריות.  באמצעות זן GFP-לבטא flavus א לנו פיקוח זיהום או התפשטות הפטרייה ב גרעינים בוגרת בזמן אמת. וזמינותו היא מהירה, אמינה, לשחזור.

עיכוב של צמיחה אספרגילוס flavus Aflatoxin ייצור הטרנסגניים תירס לבטא מעכב α-עמילאז מן Lablab purpureus ל'

Aflatoxin contamination in food and feed crops is a major challenge worldwide. Aflatoxins, produced by the fungus Aspergillus flavus (A. flavus) are ...

כאן אנו מציגים מבדיקה פשוטה הקרנת ליבה כדי לנתח את הצמיחה אספרגילוס flavus וייצור Aflatoxin גרעיני תירס המבטאת חלבון נגד פטריות. באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק המבטא זן אספרגילוס פלבוס, אנו עוקבים אחר הזיהום וההתפשטות של הפטרייה בגרעים בוגרים בזמן אמת. זו הערכה פשוטה מספקת אמצעי אמין להערכת היכולת של גרעין תירס להתנגד זיהום Flavus אספרגילוס וייצור Aflatoxin.תוצאות בדיקה מעבדה זו שבוצעו בתנאים מבוקרים על גרעינים בוגרים בקורלציה היטב עם תוצאות של זיהום בתנאי שדה. הדגמת ההליך תהיה ד"ר Rajtilak Majumdar, פוסטדוק מהמעבדה שלנו, יחד עם כריסטין סיקלר ודיוויד אמברוסיו, טכנאי מדע ביולוגי גם מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, הדבק 20 שני כובעי הצמדה מ"מ בצלחת פטרי כדי ליצור כובעי KSA.תן הדבק להתייבש במשך 48 שעות לפני השימוש באותיות. בארון בטיחות ביולוגי מרססים מגש ביו-אסאי מרובע עם 70% אתנול במים. תן לאוויר המגש להתייבש.מוסיפים נייר כרומטוגרפיה סטרילי למגש היבש. לרסס תשעה כובעי KSA עם 70% אתנול ולתת להם אוויר יבש. ואז למקם את הכובעים על מגש bioassay.עבור כל קו תירס מהונדס שנבדק, בחר 20 גרעינים שלא ניזוקו והצב אותם בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. באמצעות מיקרוסקופ סטריאו שולחן לבחור רק גרעינים ניזוקו עבור הראיה. גרעינים פגומים רגישים יותר להתקפה אספרגילוס לייצר יותר Aflatoxin, ובכך להטות את התוצאות ולא מייצג את התכונות האנטי פטריות או מיקרוביאלית אמיתי של מגוון.מוסיפים 70%אתנול לכל צינור. תן את הגרעינים לעקר במשך ארבע דקות תוך מדי פעם בעדינות לנער אותם. לאחר מכן לשפוך בעדינות את האתנול בעדינות לשטוף את הגרעינים במים סטריליים deionized שלוש פעמים.השג תרבות של שישה ימים של כתם פלבוס אספרגילוס 70 המביע GFP גדל על V8 בינוני. מוסיפים 20 מ"ל של סטרילי 0.02% טריטון X-100 במים מיונים. ולהשתמש בלולאה סטרילית כדי לגרד את הנבגים.פיפטה את inoculum ולהעביר אותו ל-300 מ"ל מקור סטרילי. הכינו דילול של פי חמישה עם 0.02% טריטון X-100 ולהשתמש בהמוציטומטר לביצוע ספירת נבגים. לדלל שוב במידת הצורך כדי להשיג 100 מ"ל עם ריכוז של ארבעה מיליון נבגים לכל מ"ל.יוצקים את inoculum לתוך מקור ריק. מניחים את הגרעינים לתוך מקור סטרילי 300 מ"ל עם בר ערבוב ומערבבים במשך שלוש דקות. באמצעות מדפים להעביר את הגרעינים לצלחת bioassay, הקפדה רק למקם גרעין אחד לתוך כל כובע.מוסיפים 30 מ"ל של מים deionized לתחתית של כל מגש bioassay. ותגרה ב-31 מעלות צלזיוס במשך שבעה ימים. לאחר שבעה ימים של חיסון עם A.flavus, לצלם ארבעה גרעינים שיועדו לניתוח מיקרוסקופי וצילום.לאחר מכן השתמש רקמות רכות ומים deionized כדי לנקות את החלק החיצוני של הגרעינים. בצע קטעים אורך של גרעינים ומיד לצלם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי להכין את הגרעינים לניתוח, לנקות את החלק החיצוני של הגרעינים הנותרים עם רקמה רכה ומים deionized.מניחים ארבעה גרעינים, המהווים נציג אחד, לתוך בקבוקון פוליקרבונט 15 מ"ל כובע בורג המכיל שני כדורי נירוסטה. מיד להקפיא את הבקבוקונים בחנקן נוזלי ולאחסן ב 80 מעלות צלזיוס עד מוכן להמשיך עם עיבוד וניתוח נוסף. כאשר מוכן, להסיר את הגרעינים מהמקפיא ולהשתמש homogenizer לטחון אותם ב 1500 סל"ד במשך שלוש דקות.השתמש באותם חומרי קרקע לניתוח GFP, קביעת Aflatoxin וניתוח מולקולרי, כך שכל הערכים מייצגים את הדגימות. בעוד מינימום של שלושה שכפולים מומלץ, יותר הוא תמיד טוב יותר בהתאם לזמינות של גרעינים באיכות טובה. במחקר זה עוברים לא בוגרים של קווי תירס HI-II משתנים באמצעות זן Agrobacterium tumefaciens EHA101 המכיל את וקטור היעד הסופי של הצמח המבטא את הגן Lablab purpureus AILP תחת שליטתו של מקדם 35S מנגיף פסיפס הכרובית.הגברה PCR של הגן AILP היעד הראה אמפוליקון 548 bp נצפתה רק בשורות תירס מהופנט. הגן AILP הראה ביטוי בשורות מהופנטות ואילו לא נצפה ביטוי AILP בצמחי הבקרה. נבגים בשלב מוקדם נחשפים תמציות עלים גולמיים מצמחים תירס מהוסס צעיר במשך 20 שעות.אורך מלא גבוה של נבגים החשופים לתמציות עלים מהו מהודורים מראה ירידה של 58 עד 80% בהשוואה לשליטה השלילית. זן A.flavus בשימוש מכיל כתב GFP המאפשר ניטור וכימות של צמיחה פטרייתית בזמן אמת. ירידה משמעותית פלואורסצנטיות GFP נצפתה גרעיני AILP מהופנט לעומת שליטה שלילית isogenic.ירידה משמעותית ניכרת בצמיחה הפטרייתית של קווי AILP 4 ו-5, 69% ו-72% בהתאמה. הקווים האחרים מראים הפחתה של 35 עד 60% בהשוואה לקרני הבקרה. הפחתה של 62 עד 88% בתוכן Aflatoxin נצפתה בליבות AILP בהשוואה לבקרה.קו ארבע הוא ראה את התוכן Aflatoxin הנמוך ביותר ב 486 ננוגרם לגרם, ואחריו קווים אחרים החל תוכן הנע בין 640 ו 1498 ננוגרם לגרם הגרעינים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון שימוש בגלואורומטר לכימות GFP וכצמיחתו הפטרייתית. ניתן להשתמש בערכות מסחריות עם בסיס חיסוני או HPLC או EPLC לביצוע כימות Aflatoxin.הזמינות של KSA מספקת אמצעי מהיר ופשוט לקביעת עמידות לזיהום Aflatoxin. ניתן להעריך במהירות את קווי הרבייה של תירס שונים באמצעות טכניקה זו. בעוד ההקרנה הקרנת הקרנה אינה מסוכנת, המפעיל צריך להגן על עצמו מפני חשיפה נבגי flavus אספרגילוס, להשתמש בציוד מגן נאות.

inhibition-aspergillus-flavus-growth-aflatoxin-production-transgenic

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

ההרס של פלחה ידי זרעים מדביק פטריות גרם מאמצי מחקר רבים כדי להבין טוב יותר הצמח לפתוגן אינטראקציות. ללמוד זרעים פטרייתיים אינטראקציות במעבדה להגדרה, פיתחנו שיטה חזקים כימות של רבייה ביומסה פטרייתי, וזיהום mycotoxin באמצעות bioassays ליבה.

כימות של קולוניזציה Sporogenesis פטרייתי, ולאחר הפקה של mycotoxins שימוש bioassays-Kernel

השימוש בשיטת הזרקת מחט לחסן תירס וצמחי teosinte עם פתוגן ביוטרופי Ustilago maydis מתואר.  שיטת החיסון להזרקת מחט מקלה על מסירה מבוקרת של הפתוגן הפטרייתי בין עלי הצמח שבהם הפתוגן נכנס לצמח באמצעות היווצרות appresoria. שיטה זו יעילה ביותר, ומאפשרת חיסונים הניתנים לשחזור עם U. maydis.

שיטה מהירה ויעילה להערכת פתוגניות של מיאדי אוסטילגו על קווי תירס וטוסינטה

אנו מדגימים שיטה לניתוח aflatoxins וביטוי transgene בזרעי בוטנים המכילים אותות RNA-התערבות להשתקת גני אפלטוקסין-סינתזה בflavus אספרגילוס הפטרייה. השליטה בתיווך RNAi של mycotoxins בצמחים לא דווחה בעבר.

בקרה בתיווך RNAi של aflatoxins בבוטנים: שיטה לניתוח ייצור mycotoxin וביטוי transgene בבוטנים /<em&gt; אספרגילוס</em&gt; Pathosystem

אנו מתארים אסטרטגית החלפת גנים חזקה כדי גנטי לתפעל פטריית תועבת Ustilago maydis. פרוטוקול זה מסביר כיצד ליצור מוטציות מחיקות לחקור פנוטיפים זיהום. זה יכול להתארך עד לשנות את הגנים בכל דרך רצויה, למשל, על ידי הוספת רצף קידוד תג חלבון פלואורסצנטי.

מניפולציה גנטית של פתוגן הצמח<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; ללמוד ביולוגיה פטרייתי אינטראקציות חיידק צמח

עבודה זו מתארת את שכפול של זן סוס טרויאני פחמון זקן התירס למסירה באתרו של חלבונים תירס מופרשים לתוך שלושה סוגים שונים של רקמות תירס.

בעזרת פחמון זקן התירס כמו סוס טרויאני ב באתרו משלוח של תירס חלבונים

גנים מורפולגניים הצמח יכול לשמש כדי לשפר את הטרנספורמציה גנטית של גנוטיפים הסרבן. המתואר כאן הוא Agrobacterium-תיווך הטרנספורמציה גנטית (quickcorn) פרוטוקול עבור שלושה חשובים הציבור תירס שורות.

Agrobacterium-תיווך המעבר העובר בלתי בוגר של הסרבן מתוך תירס שורות באמצעות גנים מורפולגניים

פרוטוקול הזרקה מבוסס אגרובקטריום (אגרובקטריה) מוצג לחיסון של וירוס פסיפס זנב שועל ווירוסי פסיפס קני סוכר לשתילי תירס. חיסון באופן זה מוביל לזיהום ויראלי, השתקת גנים הנגרמת על ידי וירוס של גנים סמן, ו overexpression ויראלי של GFP.

אגרוינוקולציה ישירה של שתילי תירס על ידי הזרקה עם וירוס פסיפס זנב שועל רקומביננטי ווירוס פסיפס קנה סוכר שיבוטים זיהומיות

כתב יד זה מפרט פרוטוקול חיסון אופטימלי המשתמש בנדן עלי תירס מנותק למחקרים ציטולוגיים, פיזיולוגיים ומולקולריים הניתנים לשחזור של אינטראקציות תירס עם פתוגנים צמחיים פטרייתיים. מעטה העלים מאפשר תצפית בזמן אמת על אינטראקציות תאיות בין הצמח החי לפטרייה ברקמות לא מקובעות.

נדן תירס מנותק להדמיית תאים חיים של זיהום על ידי פתוגנים פטרייתיים של תירס פוליארי

כדי להשיג דיכוי האוכלוסייה של Aedes aegypti באמצעות® RIDL (שחרור של חרקים הנושאים קטלני דומיננטי) מערכת, מספר גדול של יתושים זכר צריך להשתחרר. זה דורש שימוש בטכניקות גידול המוני וטכנולוגיה כדי לספק מערכות אמינות כדי להשיג את המספר המרבי של יתושים זכר באיכות גבוהה.

ייצור המוני של Aedes aegypti מהונדסים גנטית עבור מהדורות שדה בברזיל

נהלי Microplate מבוססות מתוארים לניתוח colorimetric או fluorometric של פעילות אנזים תאית. נהלים אלה מאפשרים לassay המהיר של פעילות מסוג זה במספר הגדול של דגימות סביבתיות בתוך מסגרת זמן לניהול.

קביעת מיקרוביאלית התאית אנזים הפעילות במים, קרקעות, ומשקעים באמצעות מבחני Microplate תפוקה גבוהה

חקור שיטת סקר גרעינים פשוטה להערכת עמידות תירס לזיהום Aspergillus flavus וייצור אפלטוקסין באמצעות חלבון אנטי-פטרייתי. השיטה משתמשת בזן GFP לניטור בזמן אמת ומספקת כלי מהיר ואמין להגנת יבולים ולבטיחות מזון.

עיכוב של צמיחה אספרגילוס flavus Aflatoxin ייצור הטרנסגניים תירס לבטא מעכב α-עמילאז מן Lablab purpureus ל'

גלה סרטונים נוספים